本发明涉及动物细菌学及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速、简便、低成本检测ferlavirus病毒的rt-pcr引物及其应用。
背景技术：
在1972年瑞士的一个蛇类展览馆的矛头蛇（ferdelance）出现呼吸困难、嗜睡、神经症状，死亡率达30%，此后d.w.folsch从一条矛头蛇分离到一株副黏病毒，这是第一次从爬行动物分离到副黏病毒的报道。由于是从矛头蛇分离的缘故，故将病毒株命名为fer-de-lance(fdlv)。2011年，国际病毒分类委员会同意以fdlv为代表的代表毒株增加一个新的副黏病毒属--ferlavirus的提议。
ferlavirus主要引起蛇呼吸系统疾病，临床特征主要表现不同程度的呼吸困难、口腔有粘液、饮水增多，部分蛇出现头震颤等神经症状；病理变化主要表现为肺水肿、充血、出血，严重的肺表面产生大量分泌物呈豆腐渣样或干酪样，气管有大量痰液，肝、脾肿大，胰腺坏死、出血，肠道出血等。由ferlavirus引起的蛇肺炎是人工养殖蛇最常见疾病之一，目前缺乏对防治该病毒的相关疫苗和药物，所以一旦发病往往引起高的发病率和死亡率，给养殖户带来巨大的损失。因此由ferlavirus感染引起的蛇肺炎是制约养蛇行业持续健康发展的巨大障碍。
对于ferlavirus的检测目前有多种方法，包括病毒分离、电子显微镜技术、免疫组化学技术、原位杂交技术、血凝抑制反应（hi）、红细胞凝集反应（ha）、rt-pcr技术。虽然病毒分离、电子显微镜技术、免疫组化学技术、原位杂交技术都能够检测组织样本中是否有ferlavirus病毒，但是这些检测方法在仪器设备要求上比较苛刻、技术繁琐、成本高、时间长等特点，难以在临床上对大规模的样本进行快速检测。临床对于ferlavirus上用得较多的是hi、ha、rt-pcr方法。由于ferlavirus病毒能够凝集红细胞，所以用ha可以快速、简单的检测样本中的ferlavirus病毒，但是该方法在特异性和敏感性存在的严重的缺陷。用ha方法进行病毒检测易产生假阳性；相比敏感性，其远远低于rt-pcr反应。在临床上已经存在商业hi试剂盒对ferlavirus病毒进行快速检测，但是目前对于ferlavirus病毒的血清型分类目前尚未弄清楚，国外多位学者在用不同的毒株作为抗原检测临床样本时，结果差异较大。所以血清型的差异，用hi检测ferlavirus病毒可能会存在漏检。rt-pcr方法具有快速、特异性高、成本低、可操作性强等特点，是临床检测ferlavirus病毒的主要方法。目前有根据ferlavirus的f、hn、u等为靶基因设计的引物进行rt-pcr检测,但是由于ferlavirus至少存在着三个亚组，这些方法大多局限在某一亚组上，敏感性上还存在不足。因此能够设计出一对保守性强、特异性高、敏感性好的引物对于采用rt-pcr检测多样性的ferlavirus十分有必要。
技术实现要素：
本发明目的是提供低成本、快速、准确地检测ferlavirus病毒的rt-pcr引物及其应用。为实现本发明目的，使用如下的技术方案：
一种快速检测ferlavirus病毒的rt-pcr引物，所述rt-pcr引物由具有seqidno:1所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno:2所示核苷酸序列的下游引物组成，引物序列为：
引物上游序列l-f：5'-gcagagattttctctttctt-3'seqidno:1
引物下游序列l-r：5'-agctctcattttgtatgtcat-3'seqidno:2
优选的，所述的rt-pcr引物是依据ferlavirus病毒l基因进行设计，扩增的目的片段大小为627bp，扩增序列（627bp）为：
5'-agctctcattttgtatgtcattttggcaaatagcctccctgcttgtttgatctctttctccttgaggctataagatatgttaaaatcttggtcagctaagtaactacctgaagtgacataatctataatgtcctgaggattgaactccatgtcttctaggaacacatcaactagcctcctgctagtagagcttttaccaggggagtattgcatgttctcttgcggatatacggtatcccactcagatttgataggggacaatgctttatctttcatgaatatagttaggtcctcatcaagattgacctcctcaaacttatcgaatctgaatcccacaaaagattcccagtggttgacactcaactcatacgggatagcagcatgatttgccgcaactgcctttaactctggagaagcataatcaggaagagagcacggtggccaagaccctccatgcctttccctgaatccattgattatcattgaacagaatacagcatgccctttttgaagaacctcataatctaagatcttaggtttacacatatgatccctcaccttgtctgccgccgtaacagcctcgaggatagggtgaccgaaagatctaaagaaagagaaaatctctgc-3'
优选的，所述的rt-pcr引物在制备检测ferlavirus病毒试剂盒的应用。
本发明还提供一种快速检测ferlavirus病毒的rt-pcr试剂盒，包括具有seqidno:1所示核苷酸序列的上游引物以及具有seqidno:2所示核苷酸序列的下游引物。
优选的，所述rt-pcr剂盒还包括rt-pcr预混液和去离子水；所述的rt-pcr预混液由5×rtbuffer、dntps、反转录酶组成。
优选的，所述rt-pcr试剂盒的seqidno:1引物和seqidno:2引物使用浓度为25pmol。
优选的，所述的rt-pcr试剂盒中rt-pcr反应程序为94℃2min；随后进行35个循环，每个循环包括94℃30s，45℃30s，72℃60s；最后72℃延伸5min。
试剂盒的使用方法包括如下步骤：
<1>进行rt反应：提取组织rna样本，进行反转录（rt），获取cdna。
<2>pcr反应：取步骤<1>所得cdna样本作为模板进行pcr扩增，同时以去离子水为阴性对照样本进行pcr扩增；
pcr反应结束后，取pcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪凝胶成像系统观察结果。
pcr反应的反应体系和反应条件分别为：
<1>rt反应
反应体系：rt反应总体系20μl，其中dntpmix4μl，通用引物primermix2μl，rna模板4μl，缓冲液5×rtbuffer4μl，反转录酶supperrt(200u/μl)1μl，去离子水5μl。
反应程序：42℃孵育40min，85℃孵育5min，反应结束后置于冰上冷却。
<2>pcr反应
反应体系：pcr反应体系为25μl，其中10×pcr缓冲液2.5μl、25mmmgcl24μl、dntps1μl、引物l-f、l-r各1μl、待检样本3μl及去离子水12.5μl。
反应程序：94℃2min；随后进行35个循环，每个循环包括94℃30s，45℃30s，72℃60s；最后72℃延伸5min。
（5）结果判定
所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将pcr扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立，如果从样品中扩增出了627bp的特异性条带，则说明该样品存在测ferlavirus病毒；如果样品没有扩增出627bp的特异性条带，则说明该样品不含有测ferlavirus病毒。
本发明的实质性特点和显著的进步是：
本发明根据ferlavirus病毒的l基因组序列，设计了1对可扩增l基因的特异性引物，建立了rt-pcr快速检测方法。本发明pt-rcr具有以下优点，
1）特异性强
本发明提供的测ferlavirus病毒的rt-pcr扩增引物具有高度特异性，特异性检测出测ferlavirus病毒，所检测的阴性对照病原菌如禽流感病毒、新城疫病毒、呼肠孤病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒和水对照均无阳性结果。
2）灵敏度高，检测结果准确
使用传统方法检测ferlavirus病毒—体外分离培养，当样品的测ferlavirus病毒含量较低时，或者样品在保存运输不当时导致病原菌失活，会出现分离不到病原菌的情况，因而做出该样品不存在测ferlavirus病毒的误判。
本发明提供的测ferlavirus病毒的rt-pcr扩增引物具有灵敏度高的特点，最低检测限为5fg/μl的cdna。即使样品中测ferlavirus病毒含量低或已经失活，使用本发明的rt-pcr扩增引物进行扩增也可以检测到，因而做出正确的判定。
3）耗时少，迅速获得结果
传统方法检测鉴别测ferlavirus病毒的方法为：病原菌分离鉴定，测ferlavirus病毒在血平板上需要20小时以上才长出明显菌落。生化试验通常耗时24-72小时，做出正确的鉴定将花费3-4天时间，该方法耗时费力，且分离率低，不能很好的确定样品中是否存在测ferlavirus病毒。利用本发明提供的测ferlavirus病毒rt-pcr扩增引物所建立的检测方法，在时间成本、工作量等方面具有明显的优势，从核酸提取到琼脂糖凝胶电泳进行结果分析判定，可在5小时内完成。
附图说明
图1是ferlavirus病毒三个不同亚组毒株rt-pcr电泳图，其中m是marker2000，1、2、3分别是ferlavirus病毒三个不同亚组rt-pcr结果，4是阴性对照。
图2是rt-pcr退火温度优化的电泳图，其中marker2000，1~9分别对应退火温度40℃、41℃、43℃、45℃、47℃、49℃、51℃、52℃。
图3是rt-pcr特异性试验的电泳图，其中m是marker2000，1是ferlavirus病毒，2~7分别是禽流感病毒、新城疫病毒、呼肠孤病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、阴性对照。
图4是rt-pcr敏感性试验的电泳图，其中marker2000，1~9分别是50ng/μlcdna、5ng/μlcdna、500pg/μlcdna、50pg/μlcdna、5pg/μlcdna、500fg/μlcdna、50fg/μlcdna、5fg/μlcdna、500ag/μlcdna。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1rt-pcr快速检测方法构建
1.1材料与方法
1.1.1材料
1.1.1.1毒株
ferlavirus病毒的三个不同亚组（a、b、c）毒株由广西大学动物科学技术学院药理实验室保存，禽流感、犬细小病毒、犬瘟热病毒是市售疫苗，新城疫病毒由广西大学动物科学技术学院禽病研究室提供，呼肠孤病毒由广西兽医研究所提供。
1.1.1.2主要仪器和试剂
日本takara公司梯度pcr仪，美国alphainotech公司凝胶成像系统，美国thermo公司微量紫外分光光度计。病毒基因组rna提取试剂盒、pcr试剂、dnamarker2000、反转录试剂盒、puc-tta连接试剂盒、dh5α感受态细胞、质粒提取试剂盒均购买于北京康为世纪生物科技有限公司。
1.1.1.3引物设计
根据genbank收录ferlavirus的基因，应用引物设计软件dnastar和oligo6.0选择l基因作为引物设计区域，引物序列l-f为5'-gcagagattttctctttctt-3'和l-r为5'-agctctcattttgtatgtcat-3'，扩增片段长度为627bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.1.2方法
1.1.2.1病毒rna模板的制备
本实验采用病毒基因组rna提取试剂盒抽提病毒rna，提取方法按说明书进行。
1.1.2.2cdna的构建
对上一步获得的rna为模板，用反转录试剂盒进行反转录获得cdna，反应体系和反应条件如下：
rt反应总体系20μl，其中dntpmix4μl，通用引物primermix2μl，rna模板4μl，缓冲液5×rtbuffer4μl，反转录酶supperrt(200u/μl)1μl,去离子水5μl。将反应物置于42℃孵育40min，85℃孵育5min，反应结束后置于冰上冷却。
1.1.2.3基因的扩增、克隆、含有目的基因质粒构建
采用通用引物rt反应获取的cdna进行pcr扩增，pcr产物于2%的琼脂糖凝胶电泳后，用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收pcr产物。pcr产物与puc-t载体过夜连接后转化大肠杆菌dh5α。用小量质粒提取试剂盒提取转化长出的菌落质粒。
1.1.2.4测序鉴定
对获得质粒经pcr和双酶切鉴定，对含有目的基因的质粒送至北京华大基因测序有限公司测序。
1.1.2.5rt-pcr条件优化
对不同退火温度（40℃、41℃、43℃、45℃、47℃。49℃、51℃、52℃）在梯度pcr仪上进行pcr扩增，摸索pcr的最佳反应条件。
1.1.2.6rt-pcr方法的特异性
特异性试验毒株进行检测，评价rt-pcr方法的特异性,具体操作如下：
<1>制备rna样本：禽流感病毒、新城疫病毒、呼肠孤病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒rna按照病毒基因组rna提取试剂盒进行提取；
<2>rt反应获取cdna,反应同上。
<3>pcr反应：取步骤<2>所得cdna样本作为模板进行pcr扩增，去离子水为阴性对照样本进行pcr扩增；pcr反应的反应体系和反应程序分别为：
pcr反应体系为25μl，其中10×pcr缓冲液2.5μl、25mmmgcl24μl、dntps1μl、引物l1和l2各1μl、cdna3μl及去离子水12.5μl。
反应程序：94℃2min；随后进行35个循环，每个循环包括94℃30s，45℃30s，72℃60s；最后72℃延伸5min。
pcr反应结束后，取10μlpcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪凝胶成像系统拍照判断结果。
1.1.2.7rt-pcr方法敏感性试验
将50ng/μl的含有目的基因cdna进行10倍梯度稀释至500ag/μl，用优化的pcr方法分别对其进行检测，评价rt-pcr方法的敏感性。具体如下:
<1>制备ferlavirus病毒的rna样本,方法同上。
<2>rt反应获取cdna,反应同上。
<3>用紫外分光光度计测量cdna浓度，将其浓度调整为50ng/μl。
<4>rt-pcr敏感性检测：将50ng/μl的含有目的基因的cdna进行10倍梯度稀释至500ag/μl，用优化的rt-pcr方法分别对其进行检测，评价rt-pcr方法的敏感性。
实施例2实验结果
2.1目的基因的扩增、克隆和测序
采用设计的特异性引物对ferlavirus病毒三个亚组（a、b、c）毒株的rna进行rt-pcr扩增，如图1所示，rt-pcr产物电泳后出现与预期扩增长度相同的片段。rt-pcr产物经琼脂糖凝胶电泳和回收后，与puc-t载体过夜连接并转化大肠杆菌dh5α。获得的阳性质粒经pcr和双酶切鉴定后送北京华大基因测序有限公司测序，测序结果与参考序列完全一致，证实引物可特异性扩增出ferlavirus病毒的l基因。
2.2rt-pcr反应条件的优化
如图2所示，对rt-pcr退火温度进行优化，获得了rt-pcr扩增ferlavirus病毒l基因的最佳反应条件。从图中可知在40℃、41℃、43℃、45℃、47℃。49℃、51℃、52℃都能扩增出目的大小的基因片段，但是随着温度升高会同时出现200bp的非特异性条带，因此结合pcr反应液温度要求和特异性，确定最优应条件为：94℃预变性2min；随后进行35个94℃30s，45℃30s，72℃60s的循环；最后72℃延伸5min。
2.3rt-pcr方法的特异性试验
rt-pcr方法特异性试验结果如图3所示，对其他五种常见的rna病毒进行rt-pcr结果都显阴性，可知所建立的方法特异性强。
2.4rt-pcr方法的敏感性试验
用优化的rt-pcr方法分别对50ng/μl～500ag/μl的含有目的基因的cdna进行检测，如图4所示，电泳结果表明方法最低检测极限是5fg/μl的cdna。
本研究利用rt-pcr可以在基因水平上直接进行检测的优点，以ferlavirus的l基因为靶目标，针对基因特异性区域设计引物进行rt-pcr鉴定。结果表明，本检测方法对三个亚组的ferlavirus病毒都呈阳性，同时不能检出其他相关病毒，具有较高的特异性和保守性；最低可检测出5fg/μl的cdna，敏感性好。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
序列表
<110>广西大学
<120>一种快速检测ferlavirus病毒的rt-pcr引物及其应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequencelatin)
<400>1
gcagagattttctctttctt20
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequencelatin)
<400>2
agctctcattttgtatgtcat21