本发明涉及生物学领域，特别涉及一种含有人巨细胞病毒ul148基因的重组质粒、基因工程菌及其应用。
背景技术：
：根据流行病学调查发现，hcmv在人群中广泛感染，在发达国家，较下阶层的成人hcmv-igg阳性率为80％，中上阶层40％～60％；而发展中国家的情况则更为严重，hcmv的感染率达到95％以上。当母亲感染hcmv后，病毒可通过胎盘传播给胎儿，也可以通过产道，母乳进行传播，婴儿身体的各个组织器官尚未完全发育，免疫系统的防御功能较差，因而极易受到hcmv感染的侵害，特别是对刚出生的婴儿的危害性是非常巨大的。hcmv对人类影响如此巨大，在如何预防与检测该两方面是很值得我们去关注的。特别建立针对hcmv感染的早期检测方法用于孕妇的筛查，这对于优生优育及阻断hcmv传播有重要意义，可有效避免病毒激活产生的严重后果。检测是感染后无法避免要进行的工作，预防疾病比控制疾病相对更简单，付出的健康成本也是更低。简单的理解，人群中未受hcmv感染者存在风险，反复受感染者也有风险。似乎控制这种已与人体长期适应的病毒感染，在于使体内病毒量与机体免疫反应平衡在一定水平上。这就提示预防及控制hcmv感染，不仅对先天性感染是必要的，对整体人群的保健都是有意义的。特别免疫功能低下的人群，包括刚出生的免疫系统还没发育健全的婴幼儿，免疫抑制剂患者，还有艾滋病患者。当下研究一种可以对抗人巨细胞病毒的疫苗是最有希望的一种预防hcmv感染的策略。但现在还是没有获得上市许可的安全有效疫苗。理想的疫苗应该安全有效，既可用于高危人群的预防，又可用于疾病的治疗，有免疫原性，不排放病毒、不致癌，能引起宿主体液和细胞免疫，从而预防原发hcmv感染而不会引起慢性持续性感染。无论从健康和经济效益去考虑，有效病毒疫苗是十分重要的。在许多包膜病毒中，一种或两种病毒糖蛋白足以介导病毒进入的结合和膜融合事件。然而，在疱疹病毒中，通常涉及至少四种包膜糖蛋白。用于疱疹病毒进入的核心，包括三种高度保守的病毒糖蛋白，糖蛋白b(gb)，糖蛋白h(gh)和糖蛋白l(gl)，以及结合细胞表面受体所必需的一种或多种辅助糖蛋白。gb被认为是膜融合的近端介质，而gh和gl形成称为gh/gl的复合物，具有调节gb的促融合活性。在许多β和γ疱疹病毒中，包括人类病原体人巨细胞病毒(hcmv)、人类疱疹病毒6(hhv-6)和eb病毒(ebv)，在病毒颗粒包膜上发现两种不同的gh/gl复合物，这种复合物是病毒在感染时侵入所有细胞类型所必需的。在hcmv病毒颗粒中表达的两种gh/gl复合物中，具有糖蛋白o(go)的gh/gl复合物是gh/gl/go，用于hcmv侵入成纤维细胞，这种细胞是在质膜的融合事件引发感染。几种其他类型的细胞，包括单核细胞，树突状细胞，内皮细胞和上皮细胞的感染则需要gh/gl和三种小糖蛋白：ul128，ul130和ul131(ul128-131)所构成的五聚体复合物，并且似乎涉及内吞作用的膜融合。li等人的一项研究提供了一种如何构建病毒粒子gh/gl复合补体的机制，以及解释病毒粒子的补体如何有助于病毒定向扩散。作者将内质网上驻留的hcmvul148蛋白确定为将gh/gl/go复合物掺入病毒粒子的调节子。如果ul148从病毒基因组中缺失，三聚体gh/gl/go复合物在病毒体中的掺入将被强烈破坏，导致病毒颗粒在成纤维细胞培养物中建立感染的能力降低，并且当与成纤维细胞的感染相比时，在上皮细胞培养物中建立感染的能力增强。还表明，当go或ul128未结合gl时，ul148与gh/gl结合，这表明ul148的结合可能干扰go或ul128与gl的结合。有趣的是，ul130和ul131在gh/gl/ul148共沉淀中发现，li等人提出了可逆的gh/gl/ul130/148和gh/gl/ul131/148复合物与gh/gl/ul128-131形成竞争并指导gh/gl形成gh/gl/go的模型。gh/gl/ul128-131五聚体复物，是未来hcmv疫苗的一种发展方向。ul148的表达会增加gh/gl/go复合物的丰度，而gh/gl/ul128-131复合物丰度可能会降低，因此ul148基因功能的进一步研究对gh/gl/ul128-131五聚体复合物作为疫苗的发展具有很重要的影响。gh/gl/ul148共沉淀物中ul130和ul131的存在，可能仅反映ul148与多聚gh/gl复合物的装配期间形成的中间gh/gl/ul130和gh/gl/ul131复合物的结合，但不能有效地从内质网中输出。这些都显示出ul148在hcmv的致病过程中以及对gh/gl/ul128-131五聚体复合物疫苗的研究具有了重要的作用。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种含有人巨细胞病毒ul148基因的重组质粒。本发明的另一目的在于提供含有上述人巨细胞病毒ul148基因重组质粒的基因工程菌。本发明的又一目的在于提供上述含有巨细胞病毒ul148基因重组质粒的基因工程菌的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种含有人巨细胞病毒ul148基因的重组质粒，含有ul148基因片段，其中，ul148基因片段的核苷酸序列如seqidno：1所示。所述的含有人巨细胞病毒ul148基因的重组质粒的构建方法，通过常规方法将ul148基因片段插入到pet32a(+)载体中获得。一种含有人巨细胞病毒ul148基因重组质粒的基因工程菌，转化有上述含有人巨细胞病毒ul148基因的重组质粒。所述的含有人巨细胞病毒ul148基因重组质粒的基因工程菌的构建方法，为将上述含有人巨细胞病毒ul148基因的重组质粒转化入原核表达工程菌中。所述的基因工程菌优选为大肠杆菌；更优选为大肠杆菌bl21(de3)。所述的含有人巨细胞病毒ul148基因重组质粒的基因工程菌在ul148重组蛋白制备中的应用。一种ul148重组蛋白的制备方法，为将上述含有人巨细胞病毒ul148基因重组质粒的基因工程菌经过活化培养和发酵培养，再加入诱导剂iptg进行诱导表达，获得ul148重组蛋白；优选为：将上述工程菌接种至含有氨苄青霉素(amp)抗性的lb液体培养基中进行活化培养，然后转接到含有氨苄青霉素抗性lb液体培养基中进行发酵培养，再加入诱导剂iptg进行诱导表达，获得ul148重组蛋白。所述的诱导表达的条件优选为：37℃诱导5h。所述的诱导剂iptg的工作浓度为1mm/l。所述的ul148重组蛋白的制备方法，还包括将获得的ul148重组蛋白进行纯化的步骤。所述的含有人巨细胞病毒ul148基因重组质粒的基因工程菌在制备人巨细胞病毒ul148蛋白多克隆抗体中的应用；该工程菌可以表达出带有组氨酸标签的融合蛋白。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本发明提供了一种包含人巨细胞病毒ul148基因重组质粒的工程菌，通过将人巨细胞病毒的包膜蛋白ul148插入大肠杆菌克隆表达载体pet32a(+)中，获得重组载体pet32a(+)-ul148，然后将其转化入原核表达工程菌bl21(de3)中，获得重组质粒表达菌bl21(de3)-pet32a(+)-ul148，菌株可以表达带有组氨酸标签的融合蛋白。该融合蛋白可以作为抗原进行相关免疫学实验，该人巨细胞病毒ul148基因重组质粒的工程菌可为其他hcmv的基因重组质粒的工程菌的构建提供相关实验经验，研究针对人巨细胞病毒的材料和策略上再多一个思考的点。更重要的是，为人巨细胞病毒ul148蛋白多克隆抗体和单克隆抗体制备提供原材料，同时也为开发hcmv快速诊断试剂盒提供了研发方向，对研究该病毒蛋白是否可以研发成为亚单位疫苗打下了基础。2、本发明首先通过常规pcr技术克隆hcmvul148基因，接着构建ul148基因重组克隆菌株以及重组表达菌株，成功表达带有组氨酸标签的ul148重组蛋白。经实验鉴定，该重组蛋白在原核细胞内，以包涵体形式表达。在此基础上，简单摸索优化了表达菌株的表达条件。本实验的摸索的较好诱导表达重组蛋白的条件为：表达温度为37℃，iptg浓度为1mmol/l，时间为5h。经过iptg诱导表达后，收集该重组蛋白，经镍柱分离纯化，获得该重组蛋白。附图说明图1为重组质粒的构造示意图(直线的两个端点是插入ul148基因的两个酶切位点，分别是：ncoi和xhoi)。图2为pcr扩增产物电泳示意图；其中，泳道m为dnamarker；泳道1为ul148pcr扩增产物(箭头所述为目的基因，大小约为951bp)。图3为pet32a(+)-ul148重组表达载体的酶切鉴定结果图；其中，泳道m为dl5000dnamaker；泳道1、2、3为三个单克隆菌落的编号(黑色箭头分别为目的基因和pet32a(+)质粒)。图4为ul148目的基因在四种表达菌株中的表达情况图；其中，泳道m为蛋白maker；泳道1和2为pet32a(+)-ul148重组质粒转化bl21(de3)表达菌株；泳道3和4为pet32a(+)-ul148重组质粒转化c41(de3)表达菌株；泳道5和6为pet32a(+)-ul148重组质粒转化rosetta(de3)表达菌株；泳道7为和8为pet32a(+)-ul148重组质粒转化rosetta表达菌株(泳道1、3、5和7：经iptg诱导结果；泳道2、4、6和8：未经iptg诱导结果；箭头指示表达的重组蛋白位置)。图5为ul148目的基因在四种表达菌株中的表达分布情况图；其中，泳道m为蛋白maker；泳道1和2为pet32a(+)-ul148重组质粒转化bl21(de3)表达菌株后，经iptg诱导，菌体超声破菌；泳道3和4为pet32a(+)-ul148重组质粒转化c41(de3)表达菌株后，经iptg诱导，菌体超声破菌；泳道5和6为pet32a(+)-ul148重组质粒转化rosetta(de3)表达菌株后，经iptg诱导，菌体超声破菌；泳道7为和8为pet32a(+)-ul148重组质粒转化rosetta表达菌株后，经iptg诱导，菌体超声破菌(泳道1、3、5表示离心后沉淀；泳道2、4、6表示离心后上清；箭头指示表达的重组蛋白)。图6为诱导表达温度的优化结果图；其中，泳道m为蛋白maker；泳道1为pet32a(+)转化bl21(de3)表达菌株，经iptg诱导，菌体超声破菌，离心后沉淀；泳道2为pet32a(+)-ul148重组质粒转化bl21(de3)表达菌株后，未经iptg诱导，菌体超声破菌，离心后沉淀；泳道3～6为pet32a(+)-ul148重组质粒转化bl21(de3)表达菌株后，经iptg诱导，菌体超声破菌，离心后沉淀(箭头指示表达的重组蛋白大小)。图7为诱导表达iptg浓度的优化结果图；其中，泳道m为蛋白maker；泳道1为pet32a(+)-ul148重组质粒转化bl21(de3)表达菌株后，未经iptg诱导，菌体超声破菌，离心后沉淀；泳道2～9为pet32a(+)-ul148重组质粒转化bl21(de3)表达菌株后，经iptg诱导，菌体超声破菌，离心后沉淀(箭头指示表达的重组蛋白大小；泳道2～9的iptg诱导浓度依次为：0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.4mmol/l、0.6mmol/l、0.8mmol/l、1mmol/l、1.3mmol/l、1.5mmol/l)。图8为诱导表达时间的优化结果图；其中，泳道m为蛋白maker；泳道1为pet32a(+)-ul148重组质粒转化bl21(de3)表达菌株后，未经iptg诱导，菌体超声破菌，离心后沉淀；泳道2～9为pet32a(+)-ul148重组质粒转化bl21(de3)表达菌株后，经iptg诱导，菌体超声破菌，离心后沉淀(箭头指示表达的重组蛋白大小；泳道2～9的取样时间依次为：2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h)。图9为ul148重组蛋白纯化条件摸索电泳结果图；其中，泳道m为蛋白maker；泳道1为诱导表达的菌体超声破菌后，离心上清液；泳道2为诱导表达的菌体超声破菌后，离心沉淀用8m尿素溶解，再次离心所得不溶物，用8m尿素溶解液；泳道3为含20mm咪唑的待纯化蛋白样品；泳道4、5为用含20mm咪唑缓冲液冲洗所得溶液；泳道6～9为用不同浓度咪唑缓冲液冲洗，依次为：100mm、150mm、200mm、500mm(黑框所示为：纯化蛋白纯度较高的蛋白样品)。图10为纯化后的ul148重组蛋白sds-page分析结果图；其中，泳道m为蛋白maker；泳道1为pet32a(+)质粒转化bl21(de3)表达菌株，经iptg诱导，菌体超声破菌，离心后沉淀；泳道2为pet32a(+)-ul148重组质粒转化bl21(de3)表达菌株后，未经iptg诱导，菌体超声破菌，离心后沉淀；泳道3为pet32a(+)-ul148重组质粒转化bl21(de3)表达菌株后，经iptg诱导，菌体超声破菌，离心后沉淀；泳道4为纯化后重组蛋白样品(箭头指示纯化后的重组蛋白)。图11为纯化后的ul148重组蛋白westernblot分析结果图；其中，泳道m为蛋白maker；泳道1为纯化后的ul148重组蛋白样品(箭头指示纯化后的重组蛋白)。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1一、1.引物设计根据pet32a(+)质粒图谱和genebank上公布的ul148基因的序列，选取ncoi和hindiii两个酶切位点，用软件primer5.0和snapgene设计相应引物来扩增ul148基因，大小约为951bp(核苷酸序列如seqidno：1所示，蛋白翻译产物如seqidno：2所示)。设计后的引物合成由生工(生工生物工程(上海)股份有限公司)来完成。表1ul148引物设计引物引物序列ul148-sense-ncoi(p1)5′-catgccatgggcttgctgttcacgcttgt-3′ul148-anti-sense-xhoi(p2)5′-ccgctcgagccgacgccgcgaca-3′2.以hcmvbactowne(参考文献：humanembryoniclungfibroblaststreatedwithartesunateexhibitreducedratesofproliferationandhumancytomegalovirusinfectioninvitro)为模板扩增出ul148目的基因，在以下反应体系中进行pcr。表2pcr反应体系表3pcr反应条件温度时间98℃10sec60℃5sec72℃1min72℃10min4℃120min3.回收pcr产物(1)将上述的pcr产物，在已制备好的1％琼脂糖凝胶上点样，电泳参数设置为电压180v，时间25min左右。(2)电泳结束后取出凝胶，置于保鲜膜上，在凝胶成像仪中拍照分析保存数据。(3)在暗房中的紫外灯下，根据dnamaker的位置，用干净的刀片将琼脂糖凝胶中的目的基因片段切下。(4)将切下的含有目的基因的凝胶称重，放入已备好的1.5ml的ep管中，根据称重结果，按照1g加1ml的比例添加xp2溶液。(5)把含有目的基因凝胶和xp2溶液的ep管，置于已加热为57℃的水浴锅中，每隔数分钟上下颠倒混匀，直到凝胶融化完全即可。(6)融化完全的凝胶冷却后，在涡旋混合器上混匀并在离心机上短暂离心，之后用移液器将其移入备好的硅胶柱中，室温条件下10000×g离心1min。(7)弃去收集管中的滤液，然后向硅胶柱中添加300μlxp2，室温条件下，10000×g离心1min。(8)弃去收集管中的滤液，然后向硅胶柱中添加700μlspwwashbuffer，室温条件下，10000×g离心1min。(9)重复上一步实验一次。(10)为了除去残留的spwwashbuffer，在室温下12000×g，离心2min，空甩柱子1min。(11)将空甩后的柱子，放于新的已灭菌的ep管中，在室温下开盖放置数分钟，之后添加30μl左右的去离子水于膜的中央，室温放置数分钟，12000×g离心1min，目的dna被洗脱至ep管中。(12)吸取微量的样品以检测目的dna的纯度及浓度，之后样品置于-20℃冰箱中保存备用。实验结果：pcr扩增产物电泳结果如图2所示，目的基因的大小约为951bp，与预期大小结果一致。4.目的基因及载体质粒的酶切反应pet32a(+)载体和ul148基因pcr产物双酶切体系如下表：表4pcr产物双酶切体系用ncoi、xhoi进行酶切反应，条件为37℃水浴60min，完成酶切后进行酶切产物的纯化。5.纯化酶切产物利用cyclepurekit进行酶切产物的回收(1)按照酶切产物的体积，向其中添加5倍体积的cpbuffer，之后混匀。(2)在离心机中做短暂离心，将上述酶切产物混合液加入已备好的dna硅胶柱中(3)弃去收集管中的滤液，然后向硅胶柱中添加700μldnawashbuffer，室温条件下，10000×g离心1min。(4)重复上一步实验一次。(5)为了除去残留的dnawashbuffer，在室温下12000×g，离心2min，空甩柱子1min。(6)将空甩后的柱子，放于新的已灭菌的ep管中，在室温下开盖放置数分钟，之后添加30μl左右的去离子水于膜的中央，室温放置数分钟，12000×g离心1min，目的dna被洗脱至ep管中。(7)吸取微量的样品以检测目的dna的纯度及浓度，样品置于-20℃冰箱中保存备用。6.酶连接酶切纯化好的目的基因产物和质粒载体，利用t4dnaligase进行酶连接，反应体系如下表所示：表5连接反应体系成分体积pet32a(+)载体2μlpcr产物6μl5×t4ligationbuffer1μlt4dnaligase1μl总体积10μl酶连接反应条件：16℃，连接时间16h以上。7.重组质粒转化(1)在洁净工作台中，取出已制备好的每支75μldh5α感受态细胞，放于冰上解冻，之后向其中添加10μl的重组质粒，用移液器轻轻吹打，混合均匀，置于冰上30min。(2)冰浴结束后，置于42℃恒温水浴锅中热激90sec，之后迅速将感受态细胞置于冰上冰浴120sec。(3)随后向1.5mlep管中，加无抗生素的液体lb培养基200μl，放置在温度为37℃，转速为100rpm的恒温培养摇床中，摇菌45min左右。(4)摇菌结束后，用移液器吸取100μl的菌体涂布到含有amp(终浓度为100μg/ml)的lb固体培养基中，并用涂布棒涂抹均匀，之后放置到恒温培养箱中，正放30min左右后，倒置平板，37℃条件下培养12h。8.菌落pcr鉴定(1)挑选数个单克隆，分别接种到含有amp(终浓度为100μg/ml)抗性的lb液体培养基中，37℃条件下培养12～16h。(2)从已经培养好的菌液中抽取1μl，作为菌落pcr鉴定的模板，其余的菌液可质粒抽提后进行酶切鉴定。表6pcr反应体系表7pcr反应条件温度时间98℃4min98℃30sec60℃30sec72℃1min72℃10min4℃120min(3)pcr扩增后，将反应物点样于已备好的1％的琼脂糖凝胶中电泳，利用凝胶成像仪扫描分析并保存结果。9.酶切鉴定(1)将上述鉴定含有目的条带的对应的剩余菌液，除一部分保种外，其余进行质粒抽提。(2)将重组质粒抽提后，利用酶切进行鉴定。表8反应体系用ncoi、xhoi进行酶切反应，条件为37℃水浴60min。(3)完成酶切后，将反应物点样于已备好的1％的琼脂糖凝胶中电泳，利用凝胶成像仪扫描分析并保存结果。(4)将菌落pcr和酶切鉴定都正确的菌液或重组质粒，送于生工进行测序鉴定。实验结果：pet32a(+)-ul148重组表达载体的酶切鉴定结果如图3所示；其中，泳道m为dl5000dnamaker；泳道1、2、3为三个单克隆菌落的编号，送1号单克隆至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果正确，抽提1号单克隆质粒用于转化表达菌株。二、目的蛋白的诱导表达以上鉴定无误后，将pet32a(+)-ul148重组质粒分别转化到四种表达菌株(优宝生物有限公司)bl21(de3)、c41(de3)、rosetta(de3)、rosetta，通过菌落pcr鉴定，无误后进行目的蛋白的诱导表达。1.ul148重组蛋白在四种表达菌株中的表达量及分布经查看相关文献，pet32a(+)质粒所载目的基因诱导表达，iptg浓度多用1mmol/l。所以蛋白诱导表达条件的初期摸索时，诱导条件：诱导iptg浓度用1mmol/l。为确定目的蛋白的分布情况，初始诱导温度20℃。在含amp(终浓度为100μg/ml)的平板划线后12h左右，挑单克隆于含amp+的lb培养基中，在摇床中，37℃条件下摇菌12h。之后将菌液以体积比1：100的比例，把四种含有重组质粒的表达菌株bl21(de3)、c41(de3)、rosetta(de3)、rosetta分别接种于4瓶30ml含amp+(amp+与lb培养基的比例1：1000)的lb液体培养基中，37℃条件振荡培养至od600达到0.6左右时，分别加入iptg至培养基终浓度为1.0mmol/l，继续培养5h后取样用于检测。将各样品取样后，6000g，离心10min，将上清液倾倒，用与样品菌液等量的pbs重悬菌体后，6000g，离心10min，倾倒上清液，收集菌体，放于-80℃冰箱中冻存。实验结果：ul148目的基因在四种表达菌株中的表达情况如图4所示。ul148目的基因在四种表达菌株中的表达分布结果如图5所示。将pet32a(+)-ul148重组质粒转化成功的四种表达株，用相同的表达条件，分别进行iptg诱导表达。将诱导表达的菌体处理后，进行sds-page凝胶电泳分析，与未加iptg诱导的菌体相比，可知重组质粒在添加有iptg的四种表达株菌体中均有表达，且在bl21(de3)中的表达量较其他菌株略高些(图4)。将四种诱导表达后的菌体超声波破菌，离心后，分上清和沉淀两部分，沉淀部分用8m尿素处理后和上清部分，分别上样进行sds-page凝胶电泳分析，可知目的蛋白条带大部分分布在沉淀中，且在bl21(de3)中的表达量较其他菌株略高些(图5)，与图4结果一致。经分析，pet32a(+)-ul148重组质粒在bl21(de3)中表达情况较好，目的条带基本分布于包涵体中。2.诱导表达的温度条件摸索将菌液以1：100的比例(体积比)分别接种于4瓶30ml含amp+(amp+与lb培养基的比例1：1000)的lb液体培养基中，将各瓶分别放于预先设定好的20℃、25℃、30℃、37℃摇床中振荡培养至od600达到0.6左右时，加入iptg至培养基终浓度为1.0mmol/l，继续培养5h后取样用于检测。将各温度取样后，6000g，离心10min，将上清液倾倒，用与样品菌液等量的pbs重悬菌体后，6000g，离心10min，倾倒上清液，收集菌体，放于-80℃冰箱中冻存。实验结果：诱导表达温度的优化结果如图6所示，其中，诱导表达的条件，iptg浓度为1mmol/l；取样时间为6h；泳道1、2、3的表达温度为20℃；泳道4的表达温度为25℃；泳道5的表达温度为30℃；泳道6的表达温度为37℃。可以看出，最佳的诱导表达温度为37℃3.诱导表达的iptg浓度摸索将菌液以1：100的比例(体积比)分别接种于9瓶30ml含amp+(amp+与lb培养基的比例1：1000)的lb液体培养基中，放于20℃条件下振荡培养至od600达到0.6左右时，分别加入iptg至培养基终浓度为0mmol/l、0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.5mmol/l、0.7mmol/l、1mmol/l、1.3mmol/l、1.5mmol/l，在37℃下继续培养5h后取样用于检测。将各iptg浓度条件分别取样后，6000g，离心10min，将上清液倾倒，用与样品菌液等量的pbs重悬菌体后，6000g，离心10min，倾倒上清液，收集菌体，放于-80℃冰箱中冻存。实验结果：诱导表达的iptg浓度的优化结果如图7所示，可以看出，最佳的诱导表达的iptg浓度为1mmol/l。4.诱导表达的时间点摸索将菌液以1：100的比例(体积比)接种于30ml和300ml含amp+(amp+与lb培养基的比例1：1000)的lb液体培养基中，将其放于20℃振荡培养至od600达到0.6左右时，30ml中不加iptg(5h后取样)。300ml培养基加入iptg至培养基终浓度为1.0mmol/l，从第2h取样，取样时间点分别为2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h，取样后，6000g，离心10min，将上清液倾倒，用与样品菌液等量的pbs重悬菌体后，6000g，离心10min，倾倒上清液，收集菌体，放于-80℃冰箱中冻存。实验结果：诱导表达时间的优化结果如图8所示(诱导表达的温度为37℃)，可以看出，最佳的诱导表达时间为5h。5.目的蛋白的大量表达根据上面摸索的蛋白表达的条件，进行目的蛋白的大量表达。6.以上样品的处理(1)以上样品，从-80℃冰箱中取出后，每个ep管加入1ml细胞裂解液，100μl浓度为1mg/ml溶菌酶，10μlpmsf(1：100)，放于斡旋震荡器上，斡旋混匀，充分混匀菌体，室温放置30min。(2)30min过后，将ep管置于浮板上，并插入冰水混合物中，采用超声波破碎仪进行超声波破菌，破菌参数设置为：150w，工作5sec，停5sec，破碎(20min)至菌液变澄清即可。(3)裂解后，将ep管放入已预冷的4℃低温离心机中，转速为20000g，离心30min；离心后，将上清液倾倒于另一支ep管中，沉淀用等量pbs重悬洗涤，将ep管放入提前预冷的4℃低温离心机中，转速为20000g，离心30min；离心结束后，将上清液倾倒，沉淀用适量的无咪唑的8mol/l的尿素溶液溶解沉淀(若沉淀溶解不彻底，可用超声波破碎仪进行适当破碎，直至沉淀溶解彻底)；从溶解彻底的目的蛋白溶液中吸取75μl于另一个新的ep管中，并加入4×sds-pageloadingbuffer25μl，置于斡旋器上，斡旋振荡混匀，100℃煮沸10min后，短暂离心，放于4℃保存；其余放于-80℃冰箱中冻存。(4)混有4×sds-pageloadingbuffer的目的蛋白溶液跑蛋白胶鉴定及wb鉴定蛋白表达结果。实验结果：ul148重组蛋白纯化条件的电泳结果如图9所示。经过条件摸索，分别使用分别含有150mm、200mm咪唑的缓冲液就可将目的蛋白冲洗下来。7.sds-page凝胶电泳鉴定蛋白的表达的情况根据bio-rad凝胶试剂盒说明书进行配制：(1)用移液器分别吸取分离缓冲液a和分离缓冲液b3ml到50ml离心管中，再分别吸取10％aps30μl和temed3μl加到50ml离心管中，振荡仪混匀后，加到玻璃胶板中。(2)用移液器分别吸取浓缩缓冲液a和浓缩缓冲液b1ml到10ml离心管中，再分别吸取10％aps10μl和temed2μl加到10ml离心管中，振荡仪混匀后，加到浓缩胶的上层，并插入梳子，30min之后可点样。(3)在电泳槽中添加1×sds-page电泳缓冲液，拔掉梳子后，点样于胶板中。设置电压80v，时间30min。之后换成电压120v，时间40min。(4)电泳结束后，取出胶板，小心分离出凝胶，将凝胶置于玻璃器皿中，添加考马斯亮蓝染色液于玻璃器皿中染色30min以上。(5)凝胶染色后倒掉染色液，添加适量的凝胶脱色液，脱色数次后进行照胶分析。实验结果：纯化后的ul148重组蛋白sds-page分析结果如图10所示。8、目的蛋白的纯化在得到目的蛋白包涵体后，在室温下，适量的含20mm咪唑的8mol/l的尿素溶液溶解包涵体1h。之后，再次离心得上清液，并用0.45μm滤膜过滤，进行镍柱分离纯化蛋白，纯化步骤如下：表9目的蛋白的纯化步骤溶液体积流速冲洗1用去离子水2个柱体积4ml/min平衡/结合缓冲液20mm咪唑浓度缓冲液4个柱体积4ml/min上样待纯化的蛋白样品上样完成为止1-2ml/min冲洗220mm咪唑浓度缓冲液5个柱体积4ml/min冲洗3不同咪唑浓度缓冲液依据洗脱情况2ml/min冲洗4500mm咪唑浓度缓冲液5个柱体积4ml/min冲洗5用去离子水冲洗，5个柱体积4ml/min贮存再用20％酒精冲洗保存3个柱体积4ml/min以上各洗脱样品留样后，并电泳分析及wb。纯化后的ul148重组蛋白westernblot分析结果如图11所示。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>暨南大学<120>含有人巨细胞病毒ul148基因的重组质粒、基因工程菌及其应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>951<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ul148基因<400>1ctaccgacgccgcgacaccaggtaggttatcaaaacgcgagcccatatcgccgccatcat60tgtaatcagcaatgtgttgaggtactgcacgatgaatctgtctagtgacaccagccaacc120ctctgcttttgcgggcaagcgcgctttcggtgacagggtgtatcgtacgtagccgcgggt180caggcgcgcgttgtagcggtacacgcagaaatctatccacaggccaacgcccggctgtag240cttaggatggtggataatagcgcggtgacgtacgccacggggctttagaatctccacctg300taaggccatctcctccaggtagtgggtctgactgcgacgcagcgtccagttcatgtaaaa360gtcggtctcgccgtgtccggccacgtagaggctgcttactaaatcgggcgccagagctag420atcaggcgtatcaaattccactgccaggcgacctgattctaacggttccacgatccggga480gagcgtttctagatatagagcaaagcgtaccacgtctacctgcggtgtaaaaaactgttg540tgggcgttcaccgtcgttgaccacgtaagccacgtagaggccaacattttccaccacggg600ttctagctgcaggcggcacgtaaagcttagaaacgacggctgtacggtttggttcccgtg660aagctgaagcgtcacttccttgccggggctcaccgtgctgtaacgccgcaccgagtcggt720catctgctccagatcggtagaccagaagggcgtgcaatgcatactgtcccagtcgcgaca780cgcagcccagcctagctcggtgaagggtcgacgcacacccgaaaaagtgtgcttgaagac840cagggggtcgcctcggtagctcagtagccgaacatgcacatagtcgcggctagcgttgac900agacggcccgtagagggccagcaggacaagcgtgaacagcaagcgcaacat951<210>2<211>316<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ul148蛋白<400>2metleuargleuleuphethrleuvalleuleualaleutyrglypro151015servalasnalaserargasptyrvalhisvalargleuleusertyr202530argglyaspproleuvalphelyshisthrpheserglyvalargarg354045prophethrgluleuglytrpalaalacysargasptrpaspsermet505560hiscysthrprophetrpserthraspleugluglnmetthraspser65707580valargargtyrserthrvalserproglylysgluvalthrleugln859095leuhisglyasnglnthrvalglnproserpheleuserphethrcys100105110argleuglnleugluprovalvalgluasnvalglyleutyrvalala115120125tyrvalvalasnaspglygluargproglnglnphephethrprogln130135140valaspvalvalargphealaleutyrleugluthrleuserargile145150155160valgluproleugluserglyargleualavalglupheaspthrpro165170175aspleualaleualaproaspleuvalserserleutyrvalalagly180185190hisglygluthraspphetyrmetasntrpthrleuargargsergln195200205thrhistyrleugluglumetalaleuglnvalgluileleulyspro210215220argglyvalarghisargalaileilehishisprolysleuglnpro225230235240glyvalglyleutrpileaspphecysvaltyrargtyrasnalaarg245250255leuthrargglytyrvalargtyrthrleuserprolysalaargleu260265270proalalysalagluglytrpleuvalserleuaspargpheileval275280285glntyrleuasnthrleuleuilethrmetmetalaalailetrpala290295300argvalleuilethrtyrleuvalserargargarg305310315<210>3<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ul148引物-f<400>3catgccatgggcttgctgttcacgcttgt29<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ul148引物-r<400>4ccgctcgagccgacgccgcgaca23当前第1页12