本发明属于生物制药技术领域，特别涉及一种去除无细胞百日咳组分疫苗中内毒素的方法。
背景技术：
百日咳杆菌是百日咳的病原菌，嗜血杆菌属，呈革兰氏阴性，短杆状或椭圆形，百日咳菌可产生外毒素和内毒素，以及其他许多抗原性的生物活性物质。其中内毒素产生于革兰氏阴性菌的细胞外壁，是引起发热等疫苗副反应的物质，新的抗原纯化方法的改进使得内毒素的去除问题显现出来，《英国药典》联合疫苗dtap的内毒素要求为<100eu/剂，未来国内的质量标准对内毒素的要求也不能低于该规定。因此，无细胞百日咳疫苗生产中应尽量降低内毒素含量，以保证高质量的疫苗生产和使用。
内毒素的本质是脂多糖，是热源的活性部分，含3个不同的化学区：包括内层的引起毒性反应的类脂a区、中层的核心寡糖区和外层的特异性多糖链区。内毒素相对分子质量从几千到几万不等，具有耐热性和化学稳定性，性质极不均一，很难找到一种高效且通用的内毒素去除方法，将其一次性彻底去除，有的甚至经过多个步骤处理后，仍然达不到要求。尤其在生物制品生产过程中，需要有严格的工艺控制对内毒素进行去除或者限量控制。
百日咳组分疫苗的蛋白纯化需要考虑内毒素的去除问题。有厂家使用比较经典的非离子表面活性剂，如tritonx等，来去除内毒素，实际使用时我们发现该方法虽然简易，只需在纯化过程中加入合适剂量的表面活性剂，但是同时会使疫苗中增加与抗原无关的多余成分，增加后期的检定项目工作。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明的目的是提供一种去除无细胞百日咳组分疫苗中内毒素的方法，并在去除内毒素的同时，能够获得较高的目标蛋白回收率。
本发明的目的是通过以下方案实现的：
一种去除无细胞百日咳组分疫苗中内毒素的方法，包括以下步骤：
1）将百日咳杆菌发酵液离心，收集上清液经0.45μm滤膜过滤，再经超滤浓缩得到发酵上清，用含尿素的磷酸平衡缓冲液调节发酵上清的ph和电导，调整后样品上样于captospimpres柱中，洗脱并分别收集pt组分和fha组分；
2）将步骤1）得到的pt组分继续上样于captommc柱，洗脱得到进一步纯化后的pt组分；
3）用含尿素的磷酸平衡缓冲液调节步骤2）收集的进一步纯化后的pt组分和步骤1）收集的fha组分的ph和电导，而后分别上样于captoadhere柱中洗脱，通过层析纯化去除内毒素，收集样品穿透峰，即得到目的蛋白pt和fha。
进一步的，所述含尿素的磷酸平衡缓冲液为尿素浓度为1.5~2.5mol/l的磷酸平衡缓冲液。
进一步的，步骤1）中所述发酵上清上样前调至ph5.0~6.0、电导<8ms/cm。
进一步的，步骤1）中所述的洗脱是分别用含0.11mol/l、0.15mol/l和0.35mol/lnacl的洗脱液洗脱。
进一步的，步骤2）中所述的洗脱是用tris-hcl缓冲液进行洗脱。
进一步的，步骤3）中所述步骤2）收集的进一步纯化后的pt组分和步骤1）收集的fha上样前调节至ph5.3~6.3、电导10~18ms/cm。
本发明的另一目的是通过以下方案实现的：
一种利用上述方法制备得到的百日咳毒素和丝状凝血素。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、本发明所述的去除无细胞百日咳组分疫苗中内毒素的方法，依据内毒素内层和中层含有多个磷酸基和酸基、具有较低的等电点、在一般条件下带负电荷的特点，使用captoadhere这种新型的复合型阴离子层析填料，通过层析纯化去除内毒素，所述的新型复合型阴离子层析填料captoadhere，在处理样品时要求缓冲液的电导范围较广，减少了缓冲液置换的过程，相对于其它方法而言，在大批量制备pt和fha时，使用captoadhere层析介质去除内毒素是一种合理且高效的方法；
2、本发明所述的去除无细胞百日咳组分疫苗中内毒素的方法，可以在不带入外源物质的前提下，保持有效成分pt和fha生物活性和回收率的同时，将pt和fha中的内毒素去除至100eu/mg以下。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种去除无细胞百日咳组分疫苗中内毒素的方法，具体步骤如下：
1）开启1支百日咳杆菌工作种子批菌种于活性炭半综合培养基，36℃培养，菌种传至一定数量后接种于百日咳液体综合培养基（ssm）2代后，作为发酵罐种子，投入发酵罐培养。培养物于对数生长期后期或静止期前期收获。取52l百日咳杆菌发酵液离心分离菌体和上清，收集上清经0.45μm滤膜过滤，再超滤浓缩得到发酵上清2.5l，用含1.5mol/l尿素的磷酸平衡缓冲液调所述发酵上清的ph6.0、电导<8ms/cm；调整后8l样品上样于captospimpres柱中，平衡缓冲液冲洗未结合样品后，分别用含0.11mol/l、0.15mol/l和0.35mol/lnacl的洗脱液洗脱，收集pt组分260ml和fha组分180ml，备用；
2）将步骤1）得到的pt组分继续上样于captommc柱进一步纯化pt，pt在上样时吸附在柱上，通过含tris-hcl缓冲液进行洗脱，收集得到进一步纯化后的pt组分55ml；
3）用含1.5mol/l尿素的磷酸平衡缓冲液调步骤2）收集的55ml进一步纯化后的pt组分的ph5.5、电导16ms/cm；调整后240ml样品上样于captoadhere柱中，收集样品峰254ml，即得到目的蛋白pt组分；
取50ml步骤1）收集的fha组分，用含1.5mol/l尿素的磷酸平衡缓冲液调ph5.3、电导13ms/cm；调整后100ml样品上样于captoadhere柱中，收集样品峰147ml，即得到目的蛋白fha组分；
4）将收集的目的蛋白pt组分、fha组分分别检测内毒素含量和蛋白含量，并按下式计算蛋白回收率：
蛋白回收率（%）=（收获纯化液蛋白浓度*收获体积）/（上样样品蛋白浓度*上样体积）*100%
所述步骤1）中发酵过程中所使用的百日咳菌种为百日咳ⅰ相cs菌株（菌号为58003-3），购自中国食品药品检定研究院血清室。发酵所用培养基均由中国医学科学院医学生物研究所制备并提供。
本实施例中所述的captoadhere、captospimpres、captommc及层析柱购自美国ge公司。
本实施例中所述的超滤浓缩用缓冲液均由中国医学科学院医学生物研究所备并提供。
所述步骤4），内毒素含量的检测，按照《中国药典》三部（2015版）通则1143细菌内毒素检查法方法——凝胶法要求，采用凝胶限度试验法进行检测。细菌内毒素标准品及鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司，灵敏度0.25eu/ml。
所述步骤4），蛋白含量的检测，按照《中国药典》三部（2015版）通则0731蛋白质含量测定法第二法福林酚法（lowry法）进行测定。
所述步骤4），抗原含量的检测，按照中国食品药品检定研究院推荐的elisa法测定pt和fha抗原含量。mono-mouse-anti-pt和mono-mouse-anti-fha购自中国食品药品检定研究院。
实施例2
本实施例提供了一种去除无细胞百日咳组分疫苗中内毒素的方法，所用试剂、设备均与实施例1相同，具体步骤如下：
1）开启1支百日咳杆菌工作种子批菌种于活性炭半综合培养基，36℃培养，菌种传至一定数量后接种于百日咳液体综合培养基（ssm）2代后，作为发酵罐种子，投入发酵罐培养。培养物于对数生长期后期或静止期前期收获。取51l百日咳杆菌发酵液离心分离菌体和上清，收集上清经0.45μm滤膜过滤，再超滤浓缩得到发酵上清2l，用含2mol/l尿素的磷酸平衡缓冲液调所述发酵上清的ph6.0、电导<8ms/cm；调整后8l样品上样于captospimpres柱中，平衡缓冲液冲洗未结合样品后，分别用含0.11mol/l、0.15mol/l和0.35mol/lnacl的洗脱液洗脱，收集pt组分310ml和fha组分205ml，备用；
2）将步骤1）得到的pt组分继续上样于captommc柱进一步纯化pt，pt在上样时吸附在柱上，通过含tris-hcl缓冲液进行洗脱，收集得到进一步纯化后的pt组分48ml；
3）用含2mol/l尿素的磷酸平衡缓冲液调步骤2）收集的48ml进一步纯化后的pt组分的ph5.3、电导15ms/cm；调整后240ml样品上样于captoadhere柱中，收集样品峰252ml，即得到目的蛋白pt组分；
取50ml步骤1）收集的fha组分，用含2mol/l尿素的磷酸平衡缓冲液调ph5.5、电导16ms/cm；调整后95ml样品上样于captoadhere柱中，收集样品峰123ml，即得到目的蛋白fha组分；
4）将收集的目的蛋白pt组分、fha组分分别检测内毒素含量和蛋白含量，并计算蛋白回收率。
实施例3
本实施例提供了一种去除无细胞百日咳组分疫苗中内毒素的方法，所用试剂、设备均与实施例1相同，具体步骤如下：
1）开启1支百日咳杆菌工作种子批菌种于活性炭半综合培养基，36℃培养，菌种传至一定数量后接种于百日咳液体综合培养基（ssm）2代后，作为发酵罐种子，投入发酵罐培养。培养物于对数生长期后期或静止期前期收获。取50l百日咳杆菌发酵液离心分离菌体和上清，收集上清经0.45μm滤膜过滤，再超滤浓缩得到发酵上清2l，用含2.5mol/l尿素的磷酸平衡缓冲液调所述发酵上清的ph5.9、电导<8ms/cm；调整后8l样品上样于captospimpres柱中，平衡缓冲液冲洗未结合样品后，分别用含0.11mol/l、0.15mol/l和0.35mol/lnacl的洗脱液洗脱，收集pt组分270ml和fha组分162ml，备用；
2）将步骤1）得到的pt组分继续上样于captommc柱进一步纯化pt，pt在上样时吸附在柱上，通过含tris-hcl缓冲液进行洗脱，收集得到进一步纯化后的pt组分40ml；
3）用含2.5mol/l尿素的磷酸平衡缓冲液调步骤2）收集的40ml进一步纯化后的pt组分的ph5.5、电导13ms/cm；调整后240ml样品上样于captoadhere柱中，收集样品峰260ml，即得到目的蛋白pt组分；
取50ml步骤1）收集的fha组分，用含2.5mol/l尿素的磷酸平衡缓冲液调ph5.3、电导15ms/cm；调整后86ml样品上样于captoadhere柱中，收集样品峰119ml，即得到目的蛋白fha组分；
4）将收集的目的蛋白pt组分、fha组分分别检测内毒素含量和蛋白含量，并计算蛋白回收率。
各实施例的质量检测：
实施例1-3制备的各无细胞百日咳组分疫苗分别按《中国药典》三部（2015版）要求，将收集的pt和fha分别检测内毒素含量和蛋白含量，并计算蛋白回收率，结果见表1。
使用captoadhere可以将实施例1至3各样品中目的蛋白pt的内毒素值降至50eu/mg以下，将fha的内毒素值降至100eu/mg以下，而且在目前优化的条件下，pt目的蛋白回收率可达95%以上，fha目的蛋白回收率可达75%以上。