本发明涉及微生物技术领域，具体涉及红心猕猴桃共生短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)rfkf6菌株及其应用。
背景技术：
希瓦氏菌(shewanella)是近年来发现的一类海洋细菌，于1985年被正式命名。一方面，希瓦氏菌以其出色的生物修复功能及作为生物燃料的巨大潜能为人类所利用。另一方面，腐败希瓦氏菌等也是导致冷水鱼腐败的主要原因，更是作为致病菌对人类健康及水产养殖造成严重威胁。但是目前研究的焦点主要集中在其能源开发的有利方面，对其作为人-鱼共患的有害方面的研究却还处于起步阶段。
目前对希瓦氏菌的防治多采用化学合成药物和抗生素等传统方法，这不仅使细菌的耐药性增加，导致微生物的生态失调，产生二重感染，而且还使抗生素在生物体内残留，人体长期摄入可导致慢性中毒等，影响水产养殖业的可持续发展；滥用抗生素也使我国水产品出口屡屡受阻，给水产业造成了巨大损失。
技术实现要素：
本发明以抑制希瓦氏菌为目的，从红心猕猴桃中分离筛选拮抗菌，最终得到了一种短小芽孢杆菌rfkf6菌株。所述短小芽孢杆菌rfkf6菌株具有显著的希瓦氏菌抑菌活性，且能产生高活性的果胶酶和ε-聚赖氨酸。所述短小芽孢杆菌rfkf6菌株可应用于抑菌剂、果胶酶和ε-聚赖氨酸的制备，亦可以活菌形式替代抑菌剂、果胶酶和ε-聚赖氨酸应用于工业生产。
本发明提供了一种红心猕猴桃共生短小芽孢杆菌rfkf6菌株，其保藏编号为cgmccno.14873。
本发明提供了上述短小芽孢杆菌rfkf6的培养方法：将所述短小芽孢杆菌rfkf6接种于培养基中，25～40℃培养10～72h。
本发明提供了上述短小芽孢杆菌rfkf6菌株在非治疗抑菌中的应用。
优选的，所述抑菌包括抑制希瓦氏菌。
本发明提供了上述短小芽孢杆菌rfkf6菌株在制备治疗希瓦氏菌感染型疾病的药物中的应用。
本发明提供了上述短小芽孢杆菌rfkf6菌株在制备ε-聚赖氨酸中的应用。
本发明提供了上述短小芽孢杆菌rfkf6菌株在制备果胶酶中的应用。
有益效果：
本发明提供了一株红心猕猴桃共生短小芽孢杆菌rfkf6菌株，其保藏编号为cgmccno.14873。所属短小芽孢杆菌bfkf6菌株的代谢产物抑菌活性强，尤其对希瓦氏菌具有显著的抑制效果，抑菌圈直径达17mm，而作为阳性对照的75％乙醇的抑菌圈直径仅为8mm。所述短小芽孢杆菌bfkf6菌株及其代谢产物可应用于食物保鲜、防腐以及治疗希瓦氏菌感染型疾病的药物制备。
所述短小芽孢杆菌rfkf6还能产生高活性的果胶酶，可应用于果胶酶的制备，亦可以活菌形式替代果胶酶应用于果汁榨取澄清、改善果酒品质等食品领域，以及织物精炼、漂白、脱胶等医药纺织领域。
所述短小芽孢杆菌rfkf6还能产生ε-聚赖氨酸，可应用于ε-聚赖氨酸的制备，亦可以活菌形式替代ε-聚赖氨酸应用于和ε-聚赖氨酸相关的产业。
生物保藏说明
短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)rfkf6，于2017年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址为北京市中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.14873。
具体实施方式
本发明以抑制希瓦氏菌为目的，从红心猕猴桃中分离筛选拮抗菌，最终得到了一株短小芽孢杆菌rfkf6菌株。所述红心猕猴桃共生短小芽孢杆菌rfkf6菌株的保藏编号为cgmccno.14873，其革兰氏反应为阴性，芽孢菌落特征为圆形，较小，边缘光滑，不透明，白色，具有显著的希瓦氏菌抑菌活性，且能产生高活性的果胶酶和ε-聚赖氨酸。
本发明提供了上述短小芽孢杆菌rfkf6菌株的培养方法，将所述短小芽孢杆菌rfkf6接种于培养基中，25～40℃培养10～72h。本发明对所述培养基的类型和来源没有特殊限定，本领域常规用于细菌培养的完全培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、果胶琼脂培养基或m3g培养基均可；在本发明中，若以扩繁为培养目的，所述培养基优选为完全培养基，培养温度优选为27～33℃，更优选为30℃；培养时间优选为24～48h，更优选为30h。
本发明提供了上述短小芽孢杆菌rfkf6菌株在非治疗抑菌中的应用，所述非治疗抑菌中的应用包括食物保鲜、医疗保健器械抑菌等，优选包括抑制希瓦氏菌。将所述短小芽孢杆菌rfkf6活菌(终浓度103cfu/ml)或其代谢产物ε-聚赖氨酸
本发明提供了上述短小芽孢杆菌rfkf6菌株在制备治疗希瓦氏菌感染型疾病的药物中的应用。将短小芽孢杆菌rfkf6的代谢产物ε-聚赖氨酸
本发明还提供了上述短小芽孢杆菌rfkf6菌株在制备ε-聚赖氨酸和/或果胶酶中的应用。将所述短小芽孢杆菌rfkf6接种于发酵培养基中培养，得到发酵液；从所述培养液中分离、纯化得到ε-聚赖氨酸和/或果胶酶。在本发明中，所述分离和纯化的方法采用本领域常规的ε-聚赖氨酸/果胶酶分离、纯化方法，从发酵液中分离、纯化得到ε-聚赖氨酸/果胶酶。
下面结合实施例对本发明提供的红心猕猴桃共生短小芽孢杆菌rfkf6菌株及其应用作详细说明，但不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
对希瓦氏菌高抑制活性的短小芽孢杆菌rfkf6菌株的获得
a.将干净、新鲜红心猕猴桃在流水下冲洗掉表面的尘土，在无菌环境下依次用75％乙醇、2％次氯酸钠分别消毒5min，再用无菌水反复冲洗，在超净工作台上，用无菌剪刀去皮，将果肉剪成边长1cm的小块，每个完全培养基的培养皿上放5段；27℃恒温培养。
b.在无菌环境中，用接种针分别挑取平板上的菌落反复划线培养至出现纯菌株保存。
c.抑菌活性的检测：希瓦氏菌(shewanella)采用牛肉膏蛋白胨培养基。将菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，振荡培养24h作指示菌。用移液枪取指示菌液(od600＝0.9)100μl于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，用无菌三角涂棒涂抹均匀，然后用记号笔在培养皿底部的外面将牛肉膏蛋白胨固体培养基培养皿分成六个区，每个区分别放入一张滤纸片，再分别用移液枪移取红心猕猴桃内生菌株(纯菌株)发酵物样品10μl滴到滤纸片中央，置于37℃培养箱中培养三天。每个纯菌株做3次重复处理，阳性对照为75％酒精，阴性对照为空白液体培养基。观察指示菌的生长情况，测定抑菌圈的直径大小。其中rfkf6菌株发酵液对希瓦氏菌的抑菌圈直径为17mm，显著高于其他菌株及阳性对照75％乙醇(抑菌直径仅8mm)的抑菌活性；利用16srna分子鉴定rfkf6菌株，确定其为短小芽孢杆菌，菌落特征为圆形，较小，边缘光滑，不透明，白色。
实施例2
rfkf6保鲜效果验证实验
a.将rfkf菌株于完全培养基的液体培养基中，在30℃振荡培养30h。取发酵菌液，离心，分别收集菌体和收集发酵上清液，无菌水悬浮菌体至终浓度103cfu/ml，菌株发酵上清液用0.2μm滤膜过滤获得无菌发酵上清液。
b.分别将菌悬液和无菌发酵上清液喷洒于小黄鱼鱼体表面(空白对照不喷涂样品)，分别装袋于4℃冷藏。分别在第0、2、4d取样进行细菌总数、ph值的测定。
结果表明，随着贮藏时间的增加，各组小黄鱼的细菌总数均有增加，但菌体悬液和无菌发酵上清液处理的小黄鱼增加的幅度缓慢，第4天时对照组的细菌菌落总数已超过一级品的细菌总数达到106cfu/g，而菌体悬液和无菌发酵上清液处理的小黄鱼仍不不超过104cfu/g；从第2天后开始各组ph值均上升，但用菌体悬液和无菌发酵上清液处理的小黄鱼ph值增加上升得较慢，第4天时对照组的ph值为6.8，处理组分别为6.2和6.3。
实施例3
短小芽孢杆菌rfkf6生产果胶酶的验证实验
a.将干净、新鲜红心猕猴桃在流水下冲洗掉表面的尘土，在无菌环境下依次用75％乙醇、2％次氯酸钠分别消毒5min，再用无菌水反复冲洗，在超净工作台上，用无菌剪刀去皮，将果肉剪成边长1cm的小块，每个完全培养基的培养皿上放5段；27℃恒温培养。
b.在无菌环境中，用接种针分别挑取平板上的菌落反复划线培养至出现纯菌株保存。
c.筛选果胶酶产生菌试验：每个平板中均倒入15ml的果胶琼脂培养基(所述果胶琼脂培养基配方为：k2hpo41g，mgso40.5g，nano33g，feso4·7h2o0.01g，果胶2g，琼脂粉17g，蒸馏水定容至1000ml)，静置待培养基凝固后，挑取斜面培养基上的菌种点接于果胶培养基上，放于恒温培养箱中培养。筛选果胶酶产生菌时，在培养皿中加入刚果红染色液(1mg/ml)染色约40min，然后将其倒掉，用少量的蒸馏水轻轻的除去表面的刚果红，再加入蒸馏水静止脱色10min，对光观察，根据是否产生明显的绛红色水解圈来判定结果。结果rfkf6菌落周围出现明显的淡黄色水解圈，水解圈与菌落直径比为5。
实施例4
酶活力测定实验
a.将菌株rfkf6接种到完全培养基中，30℃恒温培养30h，在5000g条件离心，收集上清液即为粗酶液；
b.dns比色法测定发酵液酶活力：取a、b两只试管，分别加入0.5g/ml果胶底物1.5ml和乙酸－乙酸钠缓冲液2.5ml。a管中加入1ml粗酶液，摇匀，48℃水浴反应30min；反应完成后，再向b管中加入1ml粗酶液，迅速将两试管同时放入沸水浴中加热5min终止反应。待冷却后分别移取a、b反应液各2ml于另两只试管中，再加入蒸馏水2ml及dns试剂3ml，摇匀，沸水浴加热5min，冷却后定容至25ml。以b反应液为对照调零，540nm处测定a管的吸光值，参照葡萄糖标准曲线，计算酶活力。
结果显示：粗酶液的酶活力为1225u/ml。
实施例5
a.将干净、新鲜红心猕猴桃在流水下冲洗掉表面的尘土，在无菌环境下依次用75％乙醇、2％次氯酸钠分别消毒5min，再用无菌水反复冲洗，在超净工作台上，用无菌剪刀去皮，将果肉剪成边长1cm的小块，每个完全培养基的培养皿上放5段；27℃恒温培养。
b.在无菌环境中，用接种针分别挑取平板上的菌落反复划线培养至出现纯菌株保存。
c.ε-聚赖氨酸产物定性检测试验：
①每个平板中均倒入15ml的ε-聚赖氨酸初筛培养基(所述ε-聚赖氨酸初筛培养基配方：甘油10g，酵母膏0.1g，nah2po40.68g，kh2po40.25g，mgso4·7h2o0.25g，(nh4)2so40.66g，znso4·7h2o0.05g，feso4·7h2o0.01g，痕量矿物溶液140ml，美兰0.02g，k2cr7o70.05g和琼脂粉18g，双蒸水定容至1000ml)，静置待培养基凝固后，蘸取少量分离纯化后的菌株液体培养基点接于ε-聚赖氨酸初筛培养基上，放于30℃恒温培养箱中培养，根据无色透明圈的是否产生及大小来判定结果，rfkf6菌落周围有观察到明显的透明圈，初步表明该菌株有ε-聚赖氨酸产生。
②取1ml菌株的m3g发酵培养基(所述m3g发酵培养基配方：(nh4)2so410g，葡萄糖50g，酵母膏5g，mgso4·7h2o0.5g，znso4·7h2o0.04g，feso4·7h2o0.03g，k2hpo40.8g，kh2po41.36g，蒸馏水定容至1000ml)的发酵上清液，加入0.5ml碘化铋钾溶液，振荡反应并放于30℃下恒温培养箱中反应30min，观察是否有沉淀产生，rfkf6菌株发酵液有大量砖红色沉淀出现，同样表明该菌株有ε-聚赖氨酸产生。
③取1ml菌株的m3g发酵培养基发酵上清液，加入1ml甲基橙溶液，振荡并在30℃下反应30min，观察是否有沉淀产生，rfkf6菌株发酵液有大量砖红色沉淀出现，进一步表明表明该菌株有ε-聚赖氨酸产生。
d.ε-聚赖氨酸产物定量检测试验：取2ml菌株发酵液，在4000r/min下离心15min；取离心后的上清液0.1ml加入到试管中，并向其中依次加入1.9ml的磷酸盐缓冲液(0.1mol/l)和2ml的甲基橙溶液(1mmol/l)，放于30℃下的恒温培养箱中反应30min后，再次在4000r/min下离心15min。取离心后的上清液1ml，加入19ml的生理盐水稀释20倍，取m3g培养基的上清液1ml加入19ml的生理盐水稀释20倍作为参比液(只将甲基橙溶液换成去离子水，其他步骤一致)，测定od465，并根据ε-聚赖氨酸标准曲线计算出发酵液中ε-聚赖氨酸的质量浓度，结果rfkf6菌ε-聚赖氨酸产量达232.2mg/l。
实施例6
ε-聚赖氨酸的制备及抑菌效果验证
ε-聚赖氨酸制备：将菌株rfkf6在液体完全培养基培养30h，发酵液5000r/min离心10min，上清液用naoh调ph到8.5，然后12000r/min离心10min，上清液用阳离子(h+)交换树脂(d152)吸附，分别用0.2mol/l醋酸和0.1mol/l盐酸进行冲洗和洗脱，洗脱液用naoh中和到ph6.5，12000r/min离心10min，上清液转入透析袋3000中透析2d，然后冷冻干燥至粉末。
ε-聚赖氨酸保鲜效果：将上述粉末配制成终浓度
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。