本发明属于农业及植物检疫技术领域，具体涉及用于检测猕猴桃软腐病原菌botryosphaeriadothidea的高灵敏度特异性引物及检测方法和应用。
背景技术：
猕猴桃被称为水果之王和维生素c之冠，具有较高的经济效益，国内的主要种植区有四川、陕西和贵州等地。对于猕猴桃病害的检测、防控，是提高其经济价值，促进地区猕猴桃行业经济发展的必要手段。
软腐病是猕猴桃病害的主要病原菌之一。该病原菌在6月中旬至9月底有很高的产孢能力，当猕猴桃幼果感染该菌时，会严重影响果实的生长，在6月感染时，容易发生采前落果。该病原菌对于果底部和果中部均有较强的侵染能力。
利用特异性引物检测病原菌仅通过pcr扩増结果便可以实现病原苗的鉴定，其具有简便快捷的优点，在病害早期诊断和及时防治领域中得到了广泛的应用。具体在检测botryosphaeriadothidea方面，“apcr-basedtechniqueforidentificationoffusicoccumsp.frompistachioandvariousotherhostsincaliforniascientificsocieties”(doi:10.1094/pdis.2002.86.5.515)基于its序列设计了能特异性扩增botryosphaeriadothidea的引物对bdi/bdii，“anestedmultiplexpcrforspecies-specificidentificationanddetectionofbotryosphaeriaceaespeciesonmango”(doi：https://doi.org/10.1007/s10658-012-0003-8)基于rdna-its序列设计了一对扩增botryosphaeriadothidea的特异性引物bd318f/bd318r。
不过，上述技术存在检测方法不简便或引物特异性低的问题。为此，中国专利zl201310233134.3进行了改良，提出了一对特异性高的用于检测botryosphaeriadothidea的引物bzy-1/bzy-2。
目前，对于botryosphaeriadothidea的特异性引物的报道较少，且未成体系，所得的引物多为偶然获得。这种局面造成了botryosphaeriadothidea的检测只能依赖零星几种引物，限制了对由该菌引起的猕猴桃软腐病的检测。
在实际检测工作中，除了对引物有特异性要求之外，还要求引物具有高度的敏感性。引物的特异性可以保证对具体病原菌检测的准确性，而敏感性可以更易于病原菌的精确检测，可在低含量下检出病原菌，更利于病害初期的诊断。
在获得较好特异性的基础上，提高检测灵敏性方面，现有技术在其它病害菌的检测方面进行了有益的尝试，如授权公告号为cn102816835b的中国专利，不仅实现了玉米内州萎蔫病菌的特异性检测，同时还实现了该病菌的微量检测，使得该方法可以准确快速的对进境玉米样品中cmn的检测。
目前，虽然申请号为201310233134.3的中国专利实现了对botryosphaeriadothidea的特异性检测，但在微量检测时的灵敏性还不尽人意。
因此，如何在获得对botryosphaeriadothidea具有特异性且灵敏度高的引物，是现有技术所亟需的。
技术实现要素：
针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种高灵敏性检测猕猴桃软腐病原菌botryosphaeriadothidea的一组特异性引物，所述一组特异性引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物为：5＇-tcattcgtgatctcaagccaga-3＇如seqidno.1所示，所述反向引物为：5＇-tgctggtgaagatagacatctgc-3＇，如seqidno.2所示；
所述一组特异性引物的检测灵敏度为1pg菌体dna或者200cfubotryosphaeriadothidea。
本发明的另一个目的在于提供一种猕猴桃软腐病原菌botryosphaeriadothidea的高灵敏度检测方法，所述方法包括步骤：
(1)从猕猴桃果品中提取dna；
(2)以步骤(1)所得dna为pcr模板dna，进行pcr扩增；
(3)用琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)所得扩增产物，如产生目标大小条带，则证明猕猴桃果品感染软腐病；
步骤(2)中，进行所述pcr扩增时，所用的引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物为：5＇-tcattcgtgatctcaagccaga-3＇如seqidno.1所示，所述反向引物为：5＇-tgctggtgaagatagacatctgc-3＇，如seqidno.2所示。
在实际检测工作中，步骤(3)中，所述条带的位置为703bp处。
一般情况下，步骤(1)中，可选的提取dna的方法为植物基因组ctab法。
具体到本发明而言，所述ctab法可以具体以下述步骤进行：
1)取适量的猕猴桃果品放入1.5mlep管中，加入液氮后，用研磨棒快速研磨成粉末；
2)加入550μl65℃预热的ctab提取液，剧烈振荡后，放于65℃恒温箱中1h，其间间隔10min振荡混匀一次
3)加入550μl氯仿异戊醇，剧烈震荡并充分混匀，静置10min，于13000r/min转速下离心5min；
4)取上清，加入600μl冰乙醇，于13000r/min转速下离心5min，倒掉上清，用75％乙醇冲洗沉淀；重复该步骤至少1次；
5)于7500r/min转速下空离心3min，用移液器吸去底部多余的液体，放于室温自然干燥；
6)干燥后，加入适量的灭菌ddh2o充分溶解，然后保存于-20℃备用。
一般而言，步骤(2)中，进行所述pcr扩增时，所用的pcr反应体系包括10×pcrbuffer、dntpmixture、模板dna、extaq、ddh2o和所述引物。
作为本发明一个优选的方案，所述pcr反应体系为：pcr模板dna：1.0μl、2.0mm的dntpmixture：2.0μl、10×pcrbuffer：2.0μl、10mm的正向引物：0.5μl、10mm的反向引物：0.5μl、5units/μl的extaq：0.1μl、加入ddh2o至pcr反应体系体积为20μl。
作为本发明一个优选的方案，所述pcr扩增的程序为：
1)于94℃进行模板dna的预变性反应，反应时间为4min；
2)于94℃进行模板dna的变性反应，反应时间为30s；
3)于60℃进行退火，时间为30s；
4)于72℃下进行延伸，时间为1min；
5)循环步骤1)～4)30次；
6)于72℃延伸5min。
本发明的另外一个目的在于提供上述方法在检测由botryosphaeriadothidea引起的猕猴桃软腐病上的应用。具体而言，所述应用包括对猕猴桃种苗检疫、土壤病原菌检测、猕猴桃软腐病早期病害诊断以及botryosphaeriadothidea的检测和鉴定。
本发明的有益效果：
相对于现有技术而言，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明对于猕猴桃软腐病原菌botryosphaeriadothidea的检测流程简单，易于实施。
(2)本发明对于猕猴桃软腐病原菌botryosphaeriadothidea的检测是特异性的，可准确检测出是否含有猕猴桃软腐病原菌botryosphaeriadothidea。
(3)本发明的特异性引物对于猕猴桃软腐病原菌botryosphaeriadothidea具有高度的检测灵敏性，其检测灵敏度为1pg菌体dna。
附图说明
图1为本发明实施例对猕猴桃软腐病原菌botryosphaeriadothidea及其它菌的dna扩增结果图；
图2为本发明灵敏度检测的实验结果，其中，泳道b1及2～7中的菌体dna的添加量分别为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)从猕猴桃果品中提取dna；具体方法为：
1)取适量的猕猴桃果品放入1.5mlep管中，加入液氮后，用研磨棒快速研磨成粉末；
2)加入550μl65℃预热的ctab提取液，剧烈振荡后，放于65℃恒温箱中1h，其间间隔10min振荡混匀一次
3)加入550μl氯仿-异戊醇(24:1v/v)，剧烈震荡并充分混匀，静置10min，于13000r/min转速下离心5min；
4)取上清，加入600μl冰乙醇，于13000r/min转速下离心5min，倒掉上清，用75％乙醇冲洗沉淀；重复该步骤至少1次；
5)于7500r/min转速下空离心3min，用移液器吸去底部多余的液体，放于室温自然干燥；
6)干燥后，加入适量的灭菌ddh2o充分溶解，然后保存于-20℃备用。
(2)以步骤(1)所得dna为pcr模板dna，进行pcr扩增；
pcr反应体系为：pcr模板dna：1.0μl、2.0mm的dntpmixture：2.0μl、10×pcrbuffer：2.0μl、10mm的正向引物：0.5μl、10mm的反向引物：0.5μl、5units/μl的extaq：0.1μl、加入ddh2o至pcr反应体系体积为20μl。
pcr扩增的程序为：
1)于94℃进行模板dna的预变性反应，反应时间为4min；
2)于94℃进行模板dna的变性反应，反应时间为30s；
3)于60℃进行退火，时间为30s；
4)于72℃下进行延伸，时间为1min；
5)循环步骤1)～4)30次；
6)于72℃延伸5min。
所用的引物由正向引物和反向引物组成，正向引物为：5＇-tcattcgtgatctcaagccaga-3＇如seqidno.1所示，反向引物为：5＇-tgctggtgaagatagacatctgc-3＇，如seqidno.2所示。
(3)用琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)所得扩增产物，如产生特异性703bp目标条带，则证明猕猴桃果品感染软腐病。
实验结果如图1所示：图中，p1-p5：猕猴桃溃疡菌；b1-b5，猕猴桃软腐菌botryosphaeriadothidea，h1-h5：猕猴桃褐斑病，m1-m3：水稻稻瘟病，f1-f3：水稻稻曲病。由图可得：猕猴桃软腐病特异性引物只特异性检测猕猴桃软腐菌。其中，p1-p5为发明人分离出的5种不同的猕猴桃溃疡菌菌株，编号为cx-2、hy、djy、cd-3、jy；h1-h5为发明人分离出的5种不同的猕猴桃褐斑病病原菌菌株，编号为hj、hh、hc、ph5、63；m1-m3为发明人分离出的3种不同的水稻稻瘟病病原菌菌株，编号为guy-11、zb-13、za-49；f1-f3为发明人分离出的3种不同的水稻稻曲病病原菌菌株，编号为wj-1、pj、jy-3。
通过利用ncbi基因库的blast分析，本发明的evalue最低可达0.27，具有高度的特异性。
不过，需要指出的是，对提取的dna进行稀释以及对分离出的botryosphaeriadothidea菌悬液进行稀释，测试本发明方法的检测灵敏度时，发现本发明的检测灵敏度还可低至1pg菌体dna或者200cfubotryosphaeriadothidea，如图2所示，泳道6中的菌体dna添加量为1pg时，条带仍清晰可辨。利用申请号为201310233134.3的中国专利的引物进行相同的灵敏度测试，其灵敏度至少高于200pg菌体dna。
注：在检测灵敏度时，是从botryosphaeriadothidea中提取dna后进行稀释进行dna灵敏度测试，以及通过对botryosphaeriadothidea进行培养然后对培养物进行稀释后再提取全部dna进行。
sequencelisting
<110>四川省农业科学院植物保护研究所，绵阳市农业科学研究院
<120>用于检测猕猴桃软腐病原菌的引物及检测方法和应用
<130>2018
<160>2
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>22
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>1
tcattcgtgatctcaagccaga22
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>2
tgctggtgaagatagacatctgc23