一种黄精多糖的制备方法及应用与流程

本发明涉及中药有效成分的制备方法及其应用领域，具体涉及一种黄精多糖的制备方法及其在制备免疫增强药物中的应用。

背景技术：

黄精为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricum Red.或多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua的干燥根茎。性味甘平，归脾、肺、肾经，具有补气健脾之功效。黄精具有可食用、药用、观赏、美容等作用，常用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳，劳嗽咳血，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴。

黄精多糖是黄精的主要有效成分之一，具有抗肿瘤、抗衰老、抗动脉粥样硬化等功能。

黄精中的多糖含量普遍在10％以上，目前用于提取黄精多糖的提取分离方法包括热水提取、醇析分离、微波辅助提取、超声波提取等，但是提取的多糖纯度不高(<80％)。结合现代化学与药理研究成果，对黄精多糖类成分加以开发利用，发掘新药，将对传统中药黄精的开发与应用有现实意义。

环磷酰胺作为临床上常用的抗肿瘤药物，可杀伤肿瘤细胞，同时具有明显的免疫抑制作用。大量的药理学研究表明，一些多糖类的化合物能够调节免疫，激活机体的免疫细胞，提高机体的免疫功能。本发明旨在探究黄精多糖对环磷酰胺诱导小鼠免疫低下的影响，为黄精多糖作为环磷酰胺的免疫佐剂提供合理的依据。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供了一种黄精多糖的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种黄精多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将黄精生药材洗净，加水浸泡(10-20分钟)后堆积在干净的台面上4-10h，用湿布遮盖，期间喷洒清水，润至药材内无干心，然后蒸至黄黑色、柔软为度，关火继续焖至外表棕黑色、有光泽，出锅，晾至外干内润，切成(3～5)mm厚片，烘干；

(2)取步骤(1)的切片，研成粉末，用80～95％(v/v)的乙醇水溶液回流提取2-3次，过滤，所得药渣烘干；

(3)向步骤(2)的烘干后的药渣中加入蒸馏水于80℃回流提取2-4次，过滤，滤液浓缩至浸膏状态后，加入乙醇，至乙醇含量为70％-90％(v/v)，搅拌均匀，然后于4℃下放置(8-12)h，过滤，沉淀烘干，即得粗多糖；

(4)将步骤(3)所得粗多糖用Sevage法除去蛋白；

(5)将步骤(4)除去蛋白后的多糖用水溶解后，于流水中透析48h；取透析液真空冷冻干燥，得到黄精多糖。

进一步的，所述步骤(1)中加水浸泡后在蒸笼中蒸4～8h，关火继续焖4～8h，出锅；优选为在蒸笼中蒸6h，关火继续焖6h，出锅。

进一步的，步骤(1)中所述烘干为置于恒温烘干箱70℃烘干。

进一步的，步骤(2)中所述烘干温度低于50℃。

进一步的，步骤(2)中所述用80～95％(v/v)的乙醇水溶液回流提取的过程为：用95％(v/v)乙醇于60℃回流3h，过滤；然后向所得固体中加入80％(v/v)乙醇于60℃回流2h，过滤，药渣烘干；

进一步的，步骤(3)中所述加入蒸馏水于80℃回流提取过程为：向步骤(2)烘干后的药渣中加入蒸馏水于80℃下回流提取3次，每次3h，过滤，合并滤液。

进一步的，所述步骤(3)中烘干后的药渣与每次提取时蒸馏水用量比为1g：20-30mL，优选为1g：25mL。

本发明的另一个目的是提供了一种上述方法制备的黄精多糖作为抗肿瘤药物的辅助药的应用，具体为在制备治疗由环磷酰胺诱导的免疫低下疾病的药物中的应用。

本发明的第三个目的是提供了一种上述方法制备的黄精多糖在制备免疫增强药物中的应用。

实验表明黄精多糖对正常小鼠脾细胞增殖活力有所提高，也可提高由环磷酰胺诱导免疫低下的小鼠的脾脏与胸腺指数，增强刀豆蛋白A刺激下脾脏与胸腺细胞体外增殖能力，增强免疫低下小鼠巨噬细胞的吞噬功能和分泌IL-6和TNF-α的能力，在免疫缺陷病和肿瘤等疾病的治疗方面具有实际应用价值。

附图说明

图1为黄精多糖对免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响图，与正常组比较^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

图2为黄精多糖对正常小鼠脾细胞体外增殖活力的影响图，与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。

实施例中的黄精药材来自湖北恩施。

实施例1

一种黄精多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将黄精生药材洗净，加水浸泡15分钟后堆积在干净的台面上6h，用湿布遮盖，期间喷洒适量清水，保持湿润状态，使药材外部的水分徐徐渗透到药物组织内部，使药材润至无干心；然后置于蒸笼中蒸，水开后继续蒸6h，至药材呈黄黑色、柔软状，关火继续焖6h至外表棕黑色、有光泽，出锅，晾至黄精外干内润，然后切成3～5mm厚片，置于70℃恒温烘干箱烘干。

(2)取切片磨成粉末，先用95％乙醇((V/V，本说明书中所述乙醇的百分比浓度均指体积百分比浓度，后文不赘述)在60℃下回流3h，脱脂，再用80％乙醇于60℃回流2h，脱单糖和低聚糖，然后过滤，将药渣烘干(45℃)，加入蒸馏水(药渣与每次加入的蒸馏水用量比为1g:25mL)，于80℃下回流提取3次，每次3h。过滤，合并滤液浓缩至浸膏状态，加入乙醇，使含醇量为80％，搅拌均匀，在4℃放置过夜，过滤，将沉淀烘干，即得粗多糖。所得粗多糖用Sevage法除去蛋白，取除去蛋白后的多糖，加适量热水(60℃)溶解，于流水中透析48h；取透析液真空冷冻干燥，即得精多糖(黄精多糖)。所得黄精多糖按照硫酸-蒽酮法显色后于627nm处测吸光度，用葡萄糖标准品做多糖标准曲线，测得黄精总多糖含量为96.9％。

实施例2黄精多糖对环磷酰胺诱导免疫低下小鼠的调节作用

1.实验动物和试剂

8周龄SPF级雄性昆明小鼠(22±2)g，购自湖北省疾病预防控制中心，小鼠适应性喂养3天后开始实验。

黄精多糖：实施例1制备，刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)购自Sigma-Adrich(St.Louis，Missouri，USA)；IL-1β、IL-6和TNF-α含量测定ELISA试剂盒购于南京建成生物研究所。

PBS缓冲液：0.01M，pH＝7.4。

MTT溶液：将250mg MTT加入50mL PBS缓冲液中使其完全溶解，微孔滤膜过滤后，放入-20℃冰箱避光保存。

2.方法

2.1动物分组与模型制备方法

取昆明小鼠50只，随机分为正常对照组、模型组、黄精多糖低、中、高剂量组(剂量分别为50、100、150mg/kg)，每组10只。

正常组小鼠每天腹腔注射生理盐水(0.01mL/g)，其他各组每只小鼠腹腔注射环磷酰胺(2mg/d)，连续3d，建立免疫抑制模型。第4天开始，正常组和模型组小鼠每天灌胃生理盐水(0.01mL/g)，其他各组分别每天灌胃相应剂量黄精多糖溶液(0.01mL/g)(实施例1制备的黄精多糖用双蒸水配制而成)，连续1周。

2.2巨噬细胞悬液的制备

(1)将5mL的RPMI-1640培养液注射入小鼠腹腔，轻揉小鼠腹部，15min后收集腹腔液，用RPMI-1640培养液漂洗细胞悬液2次；

(2)然后将细胞悬液重悬于RPMI-1640培养液中，台盼蓝染色确定细胞存活率大于95％。最后用RPMI-1640完全培养液(含10％胎牛血清)稀释巨噬细胞悬液，使细胞密度为2×10⁶个/mL，备用。

2.3脾脏/胸腺指数测定及细胞悬液制备

颈椎脱臼处死小鼠，分别取出脾脏与胸腺称重，并计算胸腺指数与脾脏指数：

脾脏(胸腺)指数＝脾脏(胸腺)质量(mg)/小鼠体质量(g)。

取适量脾脏与胸腺，放置于含冰冷RPMI-1640培养液的培养皿内，剪碎研磨后，过滤，得脾脏或胸腺的单细胞悬液。再按“2.2”项下步骤(2)方法获得脾脏与胸腺细胞悬液，备用。

2.4巨噬细胞吞噬功能检测

分别将2.2得到的巨噬细胞悬液接种于96孔板中，使细胞密度为2×10⁵个/孔，于37℃、5％CO2条件下培养4h。弃掉原培养液，用PBS缓冲液洗去未贴壁细胞，每孔中加入100μL 0.04％的中性红生理盐水，继续培养。4h后弃上清液，每孔用100μL生理盐水清洗3次，加入200μL乙醇-乙酸(体积比1∶1)混合液，静置12h。待细胞完全溶解后，用酶标仪在570nm处测定每个孔的OD值，以OD值的大小来比较巨噬细胞的吞噬功能。

2.5ConA刺激脾脏与胸腺细胞增殖检测

将2.3制备好的脾脏或胸腺细胞悬液，去除红细胞后，接种于96孔板中，使细胞密度为5×10⁵个/孔，培养24h。然后向各孔中加入100μL含有ConA(2μg/mL)的RPMI-1640培养液，同时设置阴性对照孔(每孔100μL RPMI-1640培养液)。在37℃、5％CO 2下培养72h后，每孔加入10μL、5.0mg/mL MTT溶液，继续培养4h，弃去培养液，向每孔加入150μL DMSO，并充分混合。最后，于570nm处测定各孔的OD值。

刺激指数为实验孔和阴性对照孔光密度OD的比值，以ConA刺激指数代表ConA刺激下免疫细胞的增殖能力。

2.6巨噬细胞IL-1β、IL-6和TNF-α分泌能力检测

将2.2得到的巨噬细胞接种于24孔板中，使细胞密度为1×10⁶个/孔，向各孔中加入含LPS(20μg/mL)的RPMI1640培养液0.5mL。在37℃、5％CO 2下培养24h后收集上清液，按ELISA试剂盒说明书操作，检测各组小鼠巨噬细胞内IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

2.7黄精多糖对体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用

取正常小鼠的脾脏，获取脾细胞悬液，去除红细胞后，接种于96孔板中，使细胞密度为2×10⁵个/孔，分为6组，每组设6个复孔。各组分别加入0、25、50、100、200、400μg/mL的黄精多糖溶液，每孔100μL，黄精多糖溶液为0时表示加入100μL双蒸水作为空白组。在37℃、5％CO 2下培养48h后，向每孔中加入10μL、5mg/mL MTT溶液，继续培养4h，弃去培养液，向每孔中加入150μL DMSO，并充分混合。最后，于570nm处测定各孔的OD值。

2.8统计学处理

实验数据以均数±标准差(Mean±SE)表示，对数据进行统计分析。两组之间采用双尾t检验，进行分析。多组之间先采用单因素方差分析，再用SNK两两比较。P＜0.05，表示数据具有统计学意义；P<0.01，表示数据具有显著性差异。

3.结果

3.1黄精多糖对免疫低下小鼠脾脏指数及ConA刺激脾细胞增殖的影响

如表1所示，与正常对照组相比，模型组小鼠脾脏指数、ConA刺激指数降低(P<0.05)。相对于模型组，黄精多糖可使脾脏指数、ConA刺激指数增加，且呈剂量相关性；其中，黄精多糖高剂量组(150mg·kg^-1)使脾脏指数显著增加(P<0.01)，使ConA刺激指数增加(P<0.05)。

表1：黄精多糖对免疫低下小鼠脾脏指数及ConA刺激脾细胞增殖的影响(Mean±SE，n＝10)

与正常组比较^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，^**P<0.01.

3.2黄精多糖对免疫低下小鼠胸腺指数及ConA刺激胸腺细胞增殖的影响

如表2所示，模型组小鼠胸腺指数、ConA刺激指数与正常对照组相比有所下降(P<0.05)。而黄精多糖高剂量组(150mg·kg^-1)胸腺指数明显升高(P<0.01)、ConA刺激指数升高(P<0.05)；且黄精多糖组随剂量的增加，胸腺指数、ConA刺激指数相应升高。

表2：黄精多糖对免疫低下小鼠胸腺指数及ConA刺激胸腺细胞增殖的影响(Mean±SE，n＝10)

与正常组比较^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01.

3.3黄精多糖对免疫低下小鼠巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的影响

如表3所示，与正常对照组比较，模型组小鼠巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α的含量降低(P＜0.05)。与模型组比较，黄精多糖高剂量组(150mg·kg^-1)小鼠巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α的含量显著升高(P＜0.01)。

表3：黄精多糖对免疫低下小鼠巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的影响

与正常组比较^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01.

3.4黄精多糖对免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响

如图1所示，与正常对照组比较，模型组小鼠吞噬能力显著降低(^##P＜0.01)。与模型组比较，黄精多糖低、中、高剂量组小鼠有所升高(*P＜0.05)，并且呈现良好的量效关系。

3.5黄精多糖对正常小鼠脾细胞体外增殖活性的促进作用

如图2所示，与空白组相比，黄精多糖可促进正常小鼠脾细胞增殖，与剂量呈依赖关系；且剂量为200、400μg/mL时，可以明显促进脾细胞增殖(***P＜0.001)。