蔗糖致死基因SacB在基因缺失反向筛选标记中的应用及其无痕缺失自杀载体的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及蔗糖致死基因sacb在基因缺失反向筛选标记中的应用，还涉及含有蔗糖致死基因sacb的无痕缺失自杀载体。

背景技术：

基因敲除是研究细菌基因功能的一种重要方法，包括对鸭疫里默氏杆菌基因功能的研究。而基因敲除的方法主要包括由抗性基因介导的有痕缺失，以及由反向筛选基因介导的无痕缺失。目前用于鸭疫里默氏杆菌基因缺失的方法主要是有痕缺失，而有痕缺失会在基因组中留下抗性“疤痕”并导致下游基因的不转录，即“极性效应”。另外，由于鸭疫里默氏杆菌具有多重耐药性，所以用于鸭疫里默氏杆菌有痕缺失的抗性基因的选择范围有限。第三，为防止抗性基因扩散，制备鸭疫里默氏杆菌基因缺失疫苗需要无痕缺失的方法。在此背景下，急需一种无痕缺失的方法来对鸭疫里默氏杆菌基因功能进行研究。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种蔗糖致死基因sacb在作为基因缺失反向筛选标记中的应用；本发明的目的之二在于提供含有蔗糖致死基因sacb的无痕缺失自杀载体；本发明的目的之三在于提供所述无痕缺失自杀载体在鸭疫里默氏杆菌基因的无痕缺失中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.蔗糖致死基因sacb在作为基因缺失反向筛选标记中的应用。

2.含有蔗糖致死基因sacb的无痕缺失自杀载体，所述无痕缺失自杀载体由蔗糖致死基因sacb克隆至穿梭质粒plmf02的ncoi和xhoi酶切位点处，得质粒plmf02::sacb，然后将复制起始位点pra0726ori用orit片段替换。

优选的，所述蔗糖致死基因sacb由以下方法制得，以质粒pex18gm为模板，seqidno.1和seqidno.2所示序列为引物进行pcr扩增而得。

优选的，所述pcr扩增的条件如下：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，循环30次；最后72℃后延伸7min，16℃保存。

优选的，所述orit片段由以下方法制得：以pex18gm为模板，以seqidno.3和seqidno.4所示序列为引物进行pcr扩增，得orit片段。

优选的，所述自杀载体中orit片段通过hindiii和psti酶切位点替换质粒plmf02::sacb的复制起始位点pra0726ori。

3.所述无痕缺失自杀载体在鸭疫里默氏杆菌基因的无痕缺失中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明在于提供蔗糖致死基因sacb在作为基因缺失反向筛选标记中的应用，该方法能够简便高效进行基因的无痕缺失，可以用于鸭疫里默氏杆菌基因的功能研究；并且无需通过抗性基因来替代目的基因，避免了抗性标记对下游基因产生任何可能的极性作用；同时还具有生物普遍性，为研究其它细菌的无痕缺失提供了技术参考。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为sacb基因扩增电泳图(m为marker；1为sacb基因)。

图2为重组质粒plmf02::sacb的鉴定结果(a:pcr鉴定结果，1泳道为重组质粒plmf02::sacb，2泳道为阳性对照；b：双酶切鉴定结果，1泳道为双酶切重组质粒plmf02::sacb，m为marker)。

图3为菌株r.anatipestifeatccplmf02和r.anatipestifeatccplmf02::sacb对蔗糖的敏感性鉴定结果(1表示r.anatipestifeatccplmf02；2表示r.anatipestifeatccplmf02::sacb)。

图4为克隆orit基因电泳结果(m为marker；1为orit基因)。

图5为自杀质粒pobs构建过程。

图6为质粒plmf02::sacb-orit酶切验证结果(m为marker；1为质粒plmf02::sacb-orit)。

图7为ra0c_1705基因上游和下游扩增电泳图(1泳道为ra0c_1705的上游扩增片段ra0c_1705up，2泳道为ra0c_1705下游片段ra0c_1705down；m为marker)。

图8为ra0c_1705融合片段及酶切验证图(a:ra0c_1705融合片段电泳图，1泳道为ra0c_1705的上游和下游融合片段ra0c_1705up+down；b：酶切回收图，1泳道为进行双酶切后的ra0c_1705up+down，2泳道为双酶切后的质粒pobs；m为marker)。

图9为pcr鉴定融合后的片段与自杀质粒pobs连接电泳图(1泳道为分离的单克隆dh5αpobs::ra0c_1705up+down跑出的pcr条带，条带大小在1500bp左右；m为marker)。

图10为重组质粒pobs::ra0c_1705up+down用xhoi单酶切鉴定(1泳道为单酶切空载质粒poes，2泳道为单酶切重组质粒pobs::ra0c_1705up+down，m为marker)。

图11为鉴定单克隆s17.1pobs::ra0c_1705up+down(1泳道为分离的单克隆的ra0c_1705up+down全长片段，2泳道为阳性对照atcc的ra0c_1705up+down全长片段，3泳道为阴性对照。引物为ra0c_1705upp1和ra0c_1705downp2，m为marker)。

图12为第一次同源重组的阳性克隆pcr鉴定结果(1泳道为cfx基因片段，2泳道为16srdna基因片段，m为marker)。

图13为第二次同源重组阳性克隆pcr鉴定结果(a:sacb基因检测结果，泳道1为缺失株raatccδra0c_1705的sacb，泳道2为sacb阳性对照；b:缺失株raatccδra0c_1705检测ra0c_1705结果，泳道1为用引物ra0c_1705upp1和ra0c_1705downp2扩增缺失株raatccδra0c_1705，泳道2为用引物ra0c_1705upp1和ra0c_1705downp2扩增野生株raatcc11845)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明利用蔗糖致死基因sacb作为一种用于在鸭疫里默氏杆菌r.anatipestife基因缺失中的反向筛选的标记，进而发明一种自杀载体并利用此自杀载体发明一种无痕缺失的方法。其原理是：sacb基因编码蔗糖果聚糖酶，该酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且将果糖聚合成高分子量的果聚糖。但高分子量果聚糖积累对细胞存在潜在的毒性作用,可造成细胞死亡。

本发明以鸭疫里默氏杆菌r.anatipestifeatccra0c_1705基因的无痕缺失为例，来说明本发明的具体操作方法。

实施例1、sacb基因的扩增

以质粒pex18gm(gene.1998；212(1):77–86)为模板扩增sacb基因，引物为sacbp1：5’-catgccatggcaatgaacatcaaaaagtttgc-3’(seqidno.1)，sacbp2：5’-ccgctcgagttatttgttaactgttaattgtcc-3’(seqidno.2)，反应程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，循环30次；最后72℃后延伸7min，16℃保存。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。

实施例2、检验sacb基因作为无痕缺失的反向筛选标记实验

将扩增的sacb片段克隆到穿梭质粒plmf02(scirep.2016,6:37159)的ncoi和xhoi酶切位点处，再通过接合转移的方式将其转入r.anatipestifeatcc，得到菌株r.anatipestifeatccplmf02::sacb；同时将质粒plmf02转入r.anatipestifeatcc，得到r.anatipestifeatccplmf02，重组质粒鉴定结果如图2所示。分别将菌株r.anatipestifeatccplmf02与r.anatipestifeatccplmf02::sacb在含有蔗糖的血平板上培养，r.anatipestifeatccplmf02::sacb表现出对蔗糖的敏感性，而对照r.anatipestifeatccplmf02并不对蔗糖敏感。此结果说明，sacb基因可用于后续的无痕缺失研究。

实施例3、蔗糖敏感性试验

分别将含有10⁷cfu的r.anatipestiferatccplmf02::sacb和r.anatipestiferatccplmf02菌液涂至含有不同浓度蔗糖(0％、2.5％、5％)的血平板上，37℃培养箱培养18h，生长情况如图3所示。结果显示，在蔗糖浓度为5％时，携带有sacb基因的菌株不生长。

实施例4、用于无痕缺失的自杀载体pobs的构建

克隆orit基因，以质粒pex18gm(gene.1998；212(1):77–86)为模板，引物为oritp1:5’-cccaagcttcgcctgatgcggtattttctcc-3’(seqidno.3)，oritp2:5’-aaaactgcagccaactagagtcgatcttcgccagc-3’(seqidno.4)，扩增orit基因。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。

将orit片段(提高质粒的转移效率)克隆至质粒plmf02::sacb上hindiii和psti酶切位点处，将plmf02的复制起始位点pra0726ori用orit片段替换，得质粒plmf02::sacb-orit，其构建过程如图5所示。将质粒plmf02::sacb-orit用hindiii和psti内切酶进行双酶切，鉴定orit是否替代了复制起始位点pra0726ori。结果如图6所示，结果显示orit替代了复制起始位点pra0726ori成为了自杀质粒，将该质粒命名为pobs。

实施例5.自杀载体pobs介导的鸭疫里默氏杆菌无痕缺失方法的建立

以ra0c_1705(951bp)基因为例，具体步骤如下：

(1)将该基因的上游800bp和下游800bp通过相应引物扩增出来，分别采用如下两对引物:

上游引物：

ra0c_1705upp1：5’-ccgctcgagcggcattggttacggtaaatgttc-3’(seqidno.5)；

ra0c_1705upp2：5’-gcaagttcaggcaacaatgtgagttcctttacttccatttc-3’(seqidno.6)；

下游引物：

ra0c_1705downp1：5’-gaaatggaagtaaaggaactcacattgttgcctgaacttgc-3’(seqidno.7)；

ra0c_1705downp2：5’-gactagtccttgattaatttctggcgactgc-3’(seqidno.8)；

然后以r.anatipestifeatcc为模板，进行pcr扩增，反应程序均为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃后延伸7min，最后22℃保存。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如7所示。

之后将上游片段和下游片段进行pcr融合，融合后的片段与自杀质粒pobs均使用酶切位xhoi和spei同时进行双酶切，之后回收片段和质粒后进行琼脂糖电泳，电泳图8所示。用t4连接酶将酶切片段与酶切载体进行连接，将连接产物转化至dh5α，待在抗性平板上长出克隆后，用pcr的方法鉴定片段是否与载体连接，结果如图9所示。

从dh5α中提取重组质粒pobs::ra0c_1705up+down，用xhoi进行单酶切鉴定，结果如图10所示。

从dh5α中提取重组质粒，将重组质粒pobs::ra0c_1705up+down转化至供体菌s17.1，pcr鉴定转化结果，结果如图11所示。

通过接合转移的方法将质粒pobs::ra0c_1705up+down转移至鸭疫里默氏杆菌野生株raatcc中。将其涂在含有1μg/ml头孢西丁(cfx)的血平板上，筛选出第一次同源重组的阳性克隆，并用pcr的方法鉴定，结果如图12所示。

之后将该菌株在4ml的tsb培养基中37℃180rpm摇菌过夜，第二天早上测od之后，按照1od含有鸭疫里默氏杆菌2×10⁹个来计算，将10⁷个菌涂板在含有5％蔗糖的血平板上，使其进行第二次同源重组，即将ra0c_1705基因的上游和下游基因整合到基因组，以此来缺失掉ra0c_1705基因。第三天长出来的单克隆进行分离培养之后，鉴定缺失株sacb基因是否已经从基因组中移除,鉴定ra0c_1705基因是否被缺失。检测结果如图13所示。

以上结果表明，自杀载体pobs可以用于鸭疫里默氏杆菌基因的无痕缺失。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>四川农业大学

<120>蔗糖致死基因sacb在基因缺失反向筛选标记中的应用及其无痕缺失自杀载体

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

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<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

catgccatggcaatgaacatcaaaaagtttgc32

<210>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccgctcgagttatttgttaactgttaattgtcc33

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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