本发明涉及一种pncassa-bec质粒及其应用。
背景技术：
金黄色葡萄球菌是一种重要的人类病原体细菌，可以引发各种各样的感染疾病，既能引起轻微的皮肤感染，也能造成危及生命的重大感染，例如毒素休克综合症、坏死性肺炎、心内膜炎等。金黄色葡萄球菌具有超强的感染力主要归因于其精致的毒力调控系统、分泌的多种多样的细胞毒素以及多功能的细胞表面蛋白，如聚集因子、纤粘蛋白结合蛋白、胶原蛋白结合蛋白等。这些表面蛋白通过与人体细胞直接作用，能够使金黄色葡萄球菌逃避宿主免疫反应、促进其生物膜的形成和细菌定植等，为其生长创造一系列有利条件。近年来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)和耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vrsa)的爆发给治疗金黄色葡萄球菌感染带来极大挑战。因此，迫切需要开发针对耐药性金黄色葡萄球菌的新型治疗手段。
高效基因组编辑技术对研究基因功能、发现新型药物靶标以及开发新型治疗手段具有重大意义。传统的在金黄色葡萄球菌中的基因组编辑技术主要是通过分步的双交换过程实现。此类方法步骤繁琐，费时费力。近期开发的金黄色葡萄球菌中的crispr/cas9基因组编辑技术(pcassa)一步实现基因组编辑，大大缩减了金黄色葡萄球菌中的编辑步骤。然而，此技术仍旧需要利用同源修复模板并且会大大降低编辑后细菌成活率，因而限制了其在许多转化效率低下的临床菌株中的应用。
近期，“碱基编辑器”的发明为金黄色葡萄球菌中的基因编辑提供了新的途径。它能够通过催化反应，直接实现基因组上的碱基变换。到目前为止，人们已经发明了两种碱基编辑器(胞嘧啶编辑器和腺嘌呤编辑器)，它们分别由失活的cas9(cas9d10a，h840a)蛋白或cas9nickase(cas9d10a)和脱氨基酶组成。胞嘧啶脱氨酶可通过cas9/sgrna复合物导向基因组的任何位点，在cas9nickase/sgrna结合后产生的单链dna中，将胞嘧啶转化成尿嘧啶以实现碱基编辑。crispr/cas9基因组编辑方法依赖于同源重组修复机制(在细菌中)，并且需要供体修复模板。相比于产生双链断裂的crispr/cas9基因组编辑方法，碱基编辑器通过脱氨基反应直接催化胞嘧啶转化成尿嘧啶，同时切割未编辑的链，并使用dna复制机制实现胞嘧啶到胸腺嘧啶的转化。此类方法由于不涉及基因组双链断裂，因而不会损失转化cfu。
以下项目得到国家自然科学基金，项目编号：91753127；项目名称：细菌细胞壁回收调控机制以及生物学功能探究；国家自然科学基金，项目编号：31700123；项目名称：利用crispr/cas9筛选金黄色葡萄球菌中影响生物膜形成的细胞壁表面蛋白；上海市科委，项目编号：17zr1449200；项目名称：基于新型基因组编辑技术crispr/cas9的高效天然产物合成基因簇的抓取技术开发；以及科技部重点研发计划，项目编号：2017yfa0506800；项目名称：信使rna腺嘌呤m6a甲基转移酶复合机器的工作机理的资助。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种pncassa-bec质粒及其应用。
为了达到上述目的，本发明提供了一种pncassa-bec质粒，其特征在于，其序列为seqidno：1。
本发明还提供了一种pncassa-bec质粒，其特征在于，含有apobec1蛋白和cas9nickase蛋白基因表达的启动子、apobec1蛋白基因片段、apobec1蛋白基因和cas9nickase蛋白基因的连接区域以及cas9nickase蛋白基因片段。
优选地，所述的pncassa-bec质粒还含有金黄色葡萄球菌中温度敏感的质粒复制子、金黄色葡萄球菌中氯霉素抗性基因片段、大肠杆菌中卡那霉素抗性基因片段、大肠杆菌中的质粒复制子、酶切位点、sgrna表达的启动子以及sgrna。
本发明还提供了上述的pncassa-bec质粒在金黄色葡萄球菌株中高效碱基编辑的应用。
本发明还提供了上述的pncassa-bec质粒在金黄色葡萄球菌株中高效基因失活的应用。
本发明还提供了上述的pncassa-bec质粒在金黄色葡萄球菌株中高效基因突变的应用。
本发明还提供了含有上述的pncassa-bec质粒的大肠杆菌dh5α菌株，其分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：escherichiacoli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号为：cctccm2018031。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明涉及在金黄色葡萄球菌中基于工程化cas9nickase和胞苷脱氨酶结合的碱基编辑技术形成的pncassa-bec质粒以及相关应用。本发明的质粒(1)能够在各种金黄色葡萄球菌菌株中高效快速地进行碱基编辑，其中包括碱基突变和基因失活；(2)能够通过dna复制机制实现碱基编辑而不会损失转化cfu，获得极高的转化效率。所述技术在金黄色葡萄球菌感染治疗、药物靶标发现、药物开发、金黄色葡萄球菌生理研究等方面具有广阔地应用前景。
本发明通过工程化将cas9nickase和胞嘧啶脱氨酶融合，在金黄色葡萄球菌中开发了高效便利的碱基编辑系统pncassa-bec。pncassa-bec系统可以在不使用修复模板或牺牲转化cfu的情况下实现高效的基因组。通过把相应位点(caa，cag，cga，tgg)编辑成终止密码子(taa，tag，tga，taa)，此系统能够实现基因失活。除了能快速高效的将基因失活之外，pncassa-bec系统还能够编辑基因组中的其他位点，例如启动子区域和编码小rna的区域。pncassa-bec系统的未来应用可以显着加速金黄色葡萄球菌的基础科学和应用研究，特别是在低转化效率的菌株中。pncassa-bec系统的开发将为其他微生物的碱基编辑系统开发打下基础。
含有pncassa-bec质粒的大肠杆菌dh5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：escherichiacoli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2018.01.15，保藏编号为：cctccm2018031。
附图说明
附图1：编辑质粒pncassa-bec图谱；bsai位点：用于goldengateassembly技术插入spacer片段；cap1apromoter：sgrna表达的启动子；rpslpromoter：apobec1蛋白和cas9nickase蛋白基因表达的启动子；xtenlinker：apobec1蛋白基因和cas9nickase蛋白基因的连接区域；repf：金黄色葡萄球菌中温度敏感的质粒复制子，用于质粒消除；cm：金黄色葡萄球菌中氯霉素抗性基因片段；kanr：大肠杆菌中卡那霉素抗性基因片段；cole1：大肠杆菌中的质粒复制子。
附图2：pncassa-bec在金黄色葡萄球菌中实现高效碱基编辑示意图；图a.采用pncassa-bec系统在金黄色葡萄球菌中进行碱基突变的原理示意图，以及该系统的特点。图b.胞嘧啶脱氨酶的脱氨反应示意图。图c.采用pncassa-bec系统在金黄色葡萄球菌(newman菌株)中进行碱基突变的测序结果。
附图3：pncassa-bec质粒基因失活溶血试验。图a.在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(newman)中使用pncassa-bec将agra基因失活后的溶血实验。图b.在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(usa300)中使用pncassa-bec将agra基因失活后的溶血实验。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。
以上所述仅为本发明较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
各实施例中使用的生物材料来源如下：
pcassa质粒(美国addgene公司，货号：98211)；
puc57-apobec1质粒(购于生工生物工程(上海)股份有限公司，由生工生物工程(上海)股份有限公司按照常规的方法，将全基因合成的apobec1基因片段使用双酶切(xbai和xmai)后连接的方法插入puc57质粒构成puc57-apobec1质粒，其序列为seqidno：41，apobec1基因的序列参考文献：doi：10.1038/nature17946，puc57质粒的货号：b522201。
金黄色葡萄球菌rn4220菌株(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：l2956)；
金黄色葡萄球菌newman菌株(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：l3963)；
金黄色葡萄球菌usa300菌株(购自美国atcc公司，货号：atccbaa-1717)；
感受态大肠杆菌dh5α菌株(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：cc0014)。
含有pncassa-bec质粒的大肠杆菌dh5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：escherichiacoli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2018.01.15，保藏编号为：cctccm2018031。
各实施例中使用的tsb液体培养基购自国药集团化学试剂有限公司，货号：69110963。tsb固体培养基由tsb液体培养基中加入琼脂粉(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a505255-0250)配制而成。每100mltsb液体培养基中加入1.5g琼脂粉。lb液体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a507002-0250，lb固体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a507003-0250。
实施例一：pncassa-bec质粒构建：
pncassa-bec质粒的组成如附图1所示，其序列为seqidno：1。pncassa-bec质粒的具体构建方法如下：
(1)为了构建pncassa-bec质粒，首先构建含有cas9nickase(cas9d10a)基因的pncassa质粒。以pcassa质粒为模板，用含有突变(d10a)的引物将pcassa质粒扩增为两个dna片段，通过gibsonassembly组装生成pncassa质粒。
用于pcr扩增的引物序列为：
扩增ncas9蛋白基因和温度敏感的repf复制子5’引物序列(seqidno：2)：5’-catggataagaaatactcaataggcttagctatcggcacaaatagcgtcgg-3’
扩增ncas9蛋白基因和温度敏感的repf复制子3’引物序列(seqidno：3)：5’-cgattatgtcttttgcgcagtc-3’
扩增rpsl基因启动子、氯霉素抗性基因、cole1复制子和卡那霉素抗性基因的dna片段5’引物序列(seqidno：4)：
5’-cgcaccagcgaaaactggt-3’
扩增rpsl基因启动子、氯霉素抗性基因、cole1复制子和卡那霉素抗性基因的dna片段3’引物序列(seqidno：5)：
5’-ccgacgctatttgtgccgatagctaagcctattgagtatttcttatccatg-3’
使用takara公司的primerstarhsdnapolymerase对上述两个dna片段分别进行扩增，反应体系为：10μl5×primestarbuffer，4μldntpmixture(每种2.5mm)，3μl5’primer(10μm)，3μl3’primer(10μm)，0.5μl模板dna(100ng/μl)，0.5μlprimerstarhsdnapolymerase，加ddh2o至50μl。体系配好以后进行聚合酶链式反应(pcr)，循环如下：98℃30s；之后98℃10s，55℃30s，72℃4min，共30个循环；最后72℃10min。
使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对pcr产物分别进行回收。pcr产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。将上述两个dna片段，通过gibsonassembly组装成pncassa质粒。反应体系为：gibsonassemblymastermix(neb)5μl，每个dna片段2.5μl(100ng/μl)。然后50℃反应1小时。
将上述10μl反应产物转化到感受态大肠杆菌dh5α菌株中，并平铺在含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株接种到5ml新的含50μg/ml卡那霉素的lb培养基，摇菌过夜后用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒抽提质粒。质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
(2)以pncassa质粒为模板pcr扩增得到：ncas9nickase蛋白基因的dna片段；温度敏感的repf复制子、cole1复制子、氯霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的dna片段；sgrna和rpsl启动子的dna片段。从puc57-apobec1质粒中pcr扩增得到apobec1蛋白基因的dna片段。
用于pcr扩增的引物序列为：
扩增ncas9nickase蛋白基因的dna片段5’引物序列(seqidno：6)：
5’-gtcgaccgagaccattggtctcagataagaaatactcaataggcttagctatcggc-3’
扩增ncas9nickase蛋白基因的dna片段3’引物序列(seqidno：7)：
5’-cgcagcacgatataaagtcactgtacta-3’
扩增温度敏感的repf复制子、cole1复制子、氯霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的dna片段5’引物序列(seqidno：8)：
5’-gctagtacagtgactttatatcgtgctg-3’
扩增温度敏感的repf复制子、cole1复制子、氯霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的dna片段3’引物序列(seqidno：9)：
5’-agtatttcttatctgagaccaatggtctcggtcgacaacgcaggaaagaacatgt-3’
扩增apobec1蛋白基因的dna片段5’引物序列(seqidno：10)：
5’-
cacatgttctttcctgcgttgtcgaccgagaccattggtctcaatgagtagcgaaaccggtcc-3’
扩增apobec1蛋白基因的dna片段3’引物序列(seqidno：11)：
5’-gctaagcctattgagtatttcttatcactttccggggttgcgctttc-3’
扩增sgrna和rpsl启动子的dna片段5’引物序列(seqidno：12)：
5’-tgctcacatgttctttcctgcgttgtcgacagagtttgcaaaatatacaggggattatatataa-3’
扩增sgrna和rpsl启动子的dna片段3’引物序列(seqidno：13)：
5’-cactgcaaccggaccggtttcgctactcatgtgatatgtcctcctctcttcactt-3’
使用takara公司的primerstarhsdnapolymerase对上述四个dna片段分别进行扩增，反应体系为：10μl5×primestarbuffer，4μldntpmixture(每种2.5mm)，3μl5’primer(10μm)，3μl3’primer(10μm)，0.5μl模板dna(100ng/μl)，0.5μlprimerstarhsdnapolymerase，加ddh2o至50μl。体系配好以后进行聚合酶链式反应(pcr)，循环如下：98℃30s；之后98℃10s，55℃30s，72℃4min，共30个循环；最后72℃10min。
使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对pcr产物分别进行回收。pcr产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
首先，将ncas9nickase蛋白基因的dna片段和温度敏感的repf复制子、cole1复制子、氯霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的dna片段用gibsonassembly组装成pncas质粒。使用bsai酶将pncas质粒线性化，再用gibsonassembly将其与apobec1蛋白基因的dna片段连接形成pncasbec质粒。再次使用bsai酶将pncasbec质粒线性化，然后用gibsonassembly将sgrna和rpsl启动子的dna片段与之连接形成pncassa-bec质粒。反应体系为：gibsonassemblymastermix(neb)5μl，每个dna片段2.5μl(100ng/μl)。然后50℃反应1小时。
将上述10μl反应产物转化到感受态大肠杆菌dh5α菌株中，并平铺在含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株接种到5ml新的含50μg/ml卡那霉素的lb培养基，摇菌过夜后用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒抽提质粒。质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行，所得pncassa-bec质粒图谱如图1所示。含有正确pncassa-bec质粒的大肠杆菌dh5α菌株已由发明人保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为：cctccm2018031。
该pncassa-bec质粒的特征在于是一种穿梭质粒，能够在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中复制传代；该质粒在大肠杆菌中为卡那霉素抗性，在金黄色葡萄球菌中为氯霉素抗性，能用于菌株筛选；该质粒能在金黄色葡萄球菌中稳定表达cas9nickase蛋白，进行基因组碱基编辑，实现基因失活、单碱基突变的功能；具有金黄色葡萄球菌中温度敏感的repf复制子，在42℃时不能复制，能够在菌株中完成质粒的消除；含有两个bsai位点，能够用来插入spacer片段。
实施例二：pncassa-bec质粒在各种金黄色葡萄球菌中实现碱基突变：
使用pncassa-bec质粒可以在各种金黄色葡萄球菌中实现对不同基因的高效碱基突变(c→t)。实验中选取agra和cnta基因为例，在金黄色葡萄球菌rn4220，newman和usa300菌株中进行碱基突变实验。附图2a为采用pncassa-bec系统在金黄色葡萄球菌中进行碱基突变的示意图。附图2b为胞嘧啶脱氨酶的脱氨反应示意图。
(1)先在目标基因上选定某一ngg(n为任意碱基)序列前面20个碱基的dna片段(20个碱基被称为spacer，ngg不包含在其中)。该步骤的基本要求：为使spacer片段能插入到pncassa-bec质粒中，需使用以下模板设计引物：
5’-gaaannnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
3’-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnncaaa-5’
例如该实验中选定的基因cnta的spacer序列(seqidno：14)为：5’-caagcaattaacgtatacga-3’，则具体序列设计如下：
5’-gaaacaagcaattaacgtatacga-3’(seqidno：15)
3’-gttcgttaattgcatatgctcaaa-5’(seqidno：16)
在生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述两条引物，并按实施例五的步骤将spacer插入到实施例一中得到的pncassa-bec质粒中，得到pncassa-bec-cntasp质粒。将得到的pncassa-bec-cntasp质粒用于后续实验，同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认，测序引物序列(seqidno：13)为：
5’-cactgcaaccggaccggtttcgctactcatgtgatatgtcctcctctcttcactt-3’。
(2)将构建的pncassa-bec-cntasp质粒按实施例七的操作步骤转入金黄色葡萄球菌rn4220菌株中。挑取单克隆菌落，接种到3mltsb(胰蛋白胨大豆肉汤)液体培养基中，在30℃摇床中摇过夜。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒从菌株中抽提基因组dna。以该基因组dna为模板pcr扩增cnta基因(约1kbp)片段。反应体系为：10μl5×primestarbuffer，4μldntpmixture(2.5mmeach)，3μl5’primer(10μm)，3μl3’primer(10μm)，0.5μl基因组dna(100ng/μl)，0.5μlprimerstarhsdnapolymerase，加ddh2o至50μl。将上述实验中成功扩增的pcr产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
cnta碱基突变的pcr验证引物序列为：
5’引物：5’-tcaatttagaaagaggaaaagcaa-3’(seqidno：17)
3’引物：5’-tggaaacatgagcgcaatac-3’(seqidno：18)
实验结果发现，在选取的12个菌落中，碱基c7全部成功突变。
(3)使用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒从碱基突变成功的rn4220菌株中抽提pncassa-bec-cntasp质粒。质粒抽提时，向试剂盒中的bufferp1中加入生工生物工程(上海)股份有限公司生产的溶葡球菌酶(溶葡球菌酶终浓度为100ng/ml)以帮助裂解rn4220细菌。质粒抽提的其他步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
(4)将从rn4220菌株中抽提的pncassa-bec-cntasp质粒按实施例七的操作步骤转入金黄色葡萄球菌newman和usa300菌株中。pcr验证的过程和使用引物与步骤(2)中rn4220菌株相同。实验结果发现，在选取的12个单克隆菌落中，碱基c7全部成功突变。图2c为采用pncassa-bec系统在金黄色葡萄球菌newman菌株中进行碱基突变的测序结果。此外，在spacer上不同位点的cn突变效率不同，所以设计了不同位点的cn筛选在spacer可能的突变位置区域。具体实验操作按(2)的操作步骤进行。
筛选不同位置碱基cn突变的spacer的引物序列如下：
筛选c2碱基突变的5’引物序列(seqidno：19)：
5’-gaaatctgatattaatattaaaac-3’
筛选c2碱基突变的3’引物序列(seqidno：20)：
5’-aaacgttttaatattaatatcaga-3’
筛选c3碱基突变的5’引物序列(seqidno：21)：
5’-gaaaagcaatactacagtaaaaac-3’
筛选c3碱基突变的3’引物序列(seqidno：22)：
5’-aaacgtttttactgtagtattgct-3’
筛选c4碱基突变的5’引物序列(seqidno：23)：
5’-gaaatgtctacaaagttgcagcga-3’
筛选c4碱基突变的3’引物序列(seqidno：24)：
5’-aaactcgctgcaactttgtagaca-3’
筛选c5碱基突变的5’引物序列(seqidno：25)：
5’-gaaaagaacgaaaggtaccattgc-3’
筛选c5碱基突变的3’引物序列(seqidno：26)：
5’-aaacgcaatggtacctttcgttct-3’
筛选c6碱基突变的5’引物序列(seqidno：27)：
5’-gaaaggattcaacggtaatgttac-3’
筛选c6碱基突变的3’引物序列(seqidno：28)：
5’-aaacgtaacattaccgttgaatcc-3’
筛选c7碱基突变的5’引物序列(seqidno：29：
5’-gaaaatatatcgaaccgatcataa-3’
筛选c7碱基突变的3’引物序列(seqidno：30)：
5’-aaacttatgatcggttcgatatat-3’
筛选c8碱基突变的5’引物序列(seqidno：31)：
5’-gaaaaatgttactggtgatgatac-3’
筛选c8碱基突变的3’引物序列(seqidno：32)：
5’-aaacgtatcatcaccagtaacatt-3’
筛选c9碱基突变的5’引物序列(seqidno：33)：
5’-gaaaaggtataacgaatgttaaat-3’
筛选c9碱基突变的3’引物序列(seqidno：34)：
5’-aaacatttaacattcgttatacct-3’
筛选c10碱基突变的5’引物序列(seqidno：35)：
5’-gaaagaaaatatactaattaaaaa-3’
筛选c10碱基突变的3’引物序列(seqidno：36)：
5’-aaactttttaattagtatattttc-3’
筛选c11碱基突变的5’引物序列(seqidno：37)：
5’-gaaagaagaaggtgctaacaaaag-3’
筛选c11碱基突变的3’引物序列(seqidno：38)：
5’-aaaccttttgttagcaccttcttc-3’
筛选c12碱基突变的5’引物序列(seqidno：39)：
5’-gaaaggaaaaattggcggccttat-3’
筛选c12碱基突变的3’引物序列(seqidno：40)：
5’-aaacataaggccgccaatttttcc-3’
实验结果显示，在spacer的5’起c4～c8突变效率最高，其中c5～c7均为100％的突变效率，c4和c8的突变效率随spacer中碱基的差异而不同。
(5)对已经确认基因敲除成功的金黄色葡萄球菌各菌株，按实施例四的操作步骤可以消除菌株中的质粒。
实施例三：pncassa-bec质粒在各种金黄色葡萄球菌中实现基因失活：
使用pncassa-bec质粒可以对金黄色葡萄球菌各种菌株中不同基因进行基因失活。实验中选取agra基因为例，在金黄色葡萄球菌rn4220、newman和usa300菌株中进行基因失活实验。附图3为采用pncassa-bec系统在金黄色葡萄球菌(mrsa菌株)中进行基因失活的溶血实验。
(1)选定目标基因的spacer，并设计引物构建质粒。实验中选定agra基因中179位的谷氨酰胺q(caa)，将其突变为终止密码子(taa)。这样就能得到基因agra失活的菌株。设计本实验选定的spacer引物的基本要求如下：首先，要满足实施例二中(1)的要求；其次，选定的目标cn突变后必须使得该基因的cn碱基对应的密码子突变为终止密码子。实验选定agra基因为例，其spacer引物为：
5’-gaaaaaccgtcaaattgaatttta-3’(seqidno：14)
3’-ttggcagtttaacttaaaatcaaa-5’(seqidno：15)
按实施例五的步骤将spacer插入到pncassa-bec质粒中，得到pncassa-bec-agrasp质粒。将得到的pncassa-bec-agrasp质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认，测序引物序列(seqidno：13)为：
5’-cactgcaaccggaccggtttcgctactcatgtgatatgtcctcctctcttcactt-3’。。
(2)将构建的pncassa-bec-agrasp质粒按实施例七的操作步骤转入金黄色葡萄球菌rn4220菌株中。挑取单克隆菌落，接种到3mltsb(胰蛋白胨大豆肉汤)液体培养基中，在30℃摇床中摇过夜。使用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒从碱基突变成功的rn4220菌株中抽提pncassa-bec-agrasp质粒。质粒抽提时，向试剂盒中的bufferp1中加入生工生物工程(上海)股份有限公司生产的溶葡球菌酶(溶葡球菌酶终浓度为100ng/ml)以帮助裂解rn4220细菌。质粒抽提的其他步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
(3)将从rn4220菌株中抽提的pncassa-bec-agrasp质粒按实施例七的操作步骤转入金黄色葡萄球菌newman和usa300菌株中。挑取单克隆菌落(12个)，接种到3mltsb(胰蛋白胨大豆肉汤)液体培养基中，在30℃摇床中摇过夜。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒从菌株中抽提基因组dna。以该基因组dna为模板pcr扩增agra基因(约1kbp)片段。反应体系为：10μl5×primestarbuffer，4μldntpmixture(每种2.5mm)，3μl5’primer(10μm)，3μl3’primer(10μm)，0.5μl基因组dna(100ng/μl)，0.5μlprimerstarhsdnapolymerase，加ddh2o至50μl。将上述实验中成功扩增的pcr产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
agra碱基突变的pcr验证引物序列为：
5’引物：5’-ggtgaaggtcgtggtttagg-3’(seqidno：16)
3’引物：5’-gccagctatacagtgcatttg-3’(seqidno：17)
实验结果发现，上述的所有金黄色葡萄球菌菌株的12个菌落，目标碱基c7全部成功突变。
(4)金黄色葡萄球菌newman和usa300菌株中的agra基因与细菌的溶血能力相关。当agra基因失去功能时，会使菌株失去溶血能力。按实施例八的操作步骤，将步骤(3)中选取的12个单克隆菌落进行溶血实验，其结果与测序结果完全一致，12个突变成功的菌落全部失去溶血能力，该实验以对应菌株的野生型菌株的溶血能力做对照。
实施例四：金黄色葡萄球菌中pncassa-bec质粒的消除：
从含有pncassa-bec质粒的金黄色葡萄球菌中挑取一个单克隆，接种到3mltsb液体培养基中，在30℃下振摇过夜。第二天，取3μl菌液，以1∶1000比例稀释到新鲜的tsb液体培养基中，在42℃下振摇直至菌液浑浊。用接种环取适量菌液，在tsb固体培养基上划线，并在37℃培养箱中倒置培养过夜。由于pncassa-bec质粒中含有温度敏感的repf复制子，使得该质粒在42℃下无法复制而被消除。从tsb固体培养基上挑取单克隆菌落，接种在10μltsb液体培养基中，分别在tsb固体培养基和含有5μg/ml氯霉素的tsb固体培养基上划线。37℃培养箱中培养过夜后能在tsb固体培养基生长，但是不能在含有5μg/ml氯霉素的tsb固体培养基上生长的菌落，即为消除了pncassa-bec质粒的菌落，将其培养并保种。
实施例五：将spacer片段插入pncassa-bec质粒：
首先将设计合成的两个spacer引物进行磷酸化，具体反应体系如下：5μl10×t4dnaligasebuffer(neb公司)，1μlspacer5’primer(100μm)，1μlspacer3’primer(100μm)，1μlt4polynucleotidekinase(takara公司)，42μlddh2o。在37℃下反应1小时。
上述反应结束后，再在反应产物中加入0.5μl5mnacl，在95℃加热5min，然后用pcr仪缓慢地降低至室温，使磷酸化的两条单链引物通过碱基配对形成双链dna。然后用ddh2o将得到的产物稀释10倍。
将上述得到的双链dna片段插入到pncassa-bec质粒的bsai位点，反应体系为：1μl10×t4dnaligasebuffer，1μl上述得到的双链dna片段，20fmol的pncassa-bec质粒，0.5μlt4dnaligase，0.5μlbsai-hf，最后加ddh2o至总体积10μl。该反应中所用buffer和酶均由neb公司生产。在pcr仪中进行反应，循环如下：37℃2min；16℃5min，共25个循环；然后50℃5min，80℃15min。
将该10μl反应产物转化到感受态大肠杆菌dh5α菌株中，并平铺在含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基上。待转化液被固体培养基吸收后置于30℃培养箱培养过夜。将培养基上长出的转化菌株转接保存，同时抽提质粒在生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
实施例六：制备金黄色葡萄球菌电转感受态细胞
将保种的金黄色葡萄球菌菌株在tsb固体培养基上划线，于30℃培养箱倒置培养过夜。挑取培养基上长出的一个单克隆菌落，接种到3mltsb液体培养基中，在30℃摇床中以250rpm转速振摇过夜。第二天取其中1ml菌液接种到100ml新鲜的tsb培养基中，在30℃摇床中继续振摇。当菌液的od600达到0.3～0.4时，将菌液放在冰上冷却十分钟。在4℃离心机中以5000rpm转速离心5分钟收菌，弃去培养基上清，将底部的细菌沉淀用20ml0.5m蔗糖溶液(已灭菌)重悬。以同样的转速离心，弃去上清，将底部的细菌沉淀用10ml0.5m蔗糖溶液重悬。以同样的转速再一次离心，弃去上清后用1ml0.5m蔗糖溶液重悬底部的细菌沉淀。将得到的细菌溶液分装到ep管中，每管50μl菌液。将分装的菌液先在液氮中快速冷却，然后放入-80℃冰箱中保存。
实施例七：将质粒通过电转转入金黄色葡萄球菌感受态细菌中
取一管实施例六中制备的金黄色葡萄球菌感受态细菌，在冰上放置5分钟后，加入1μg质粒。混合均匀后转入1mm电转杯(bio-rad公司)，室温下在genepulserxcell电击仪(bio-rad公司)中进行电击。电击参数为：21kv/cm，100ω，25μf。电击后立即加入1mltsb培养液，混合均匀后转入干净的ep管中，在30℃摇床中振摇1.5个小时。从ep管中取100μl菌液，均匀的平铺在含有氯霉素的tsb固体培养基上(对于rn4220菌株，氯霉素浓度为5μg/ml；对于newman和usa300菌株，氯霉素浓度为10μg/ml)。待菌液被固体培养基吸收后，于30℃培养箱倒置培养过夜，只有成功转入质粒的细菌能在培养基上生长。
实施例八：金黄色葡萄球菌菌株在血平板上的溶血实验
将不同金黄色葡萄球菌菌株在tsb液体培养基中培养过夜，取1μl菌液(od600在1.0～1.5之间)点在血平板上。待菌液被血平板吸收后，于30℃培养箱倒置培养过夜。第二天，再将其置于4℃冰箱过夜，观察各菌株在血平板上的溶血情况，并拍照记录。
序列表
<110>上海科技大学
<120>一种pncassa-bec质粒及其应用
<130>2018.1.3
<160>41
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>10972
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成序列)
<400>1
cttagagcgtaagcgaaagtagtagcgacagctattaactttcggttgcaaagctctagg60
atttttaatggacgcagcgcatcacacgcaaaaaggaaattggaataaatgcgaaatttg120
agatgttaattaaagacctttttgaggtctttttttcttagatttttggggttatttagg180
ggagaaaacataggggggtactacgacctcccccctaggtgtccattgtccattgtccaa240
acaaataaataaatattgggtttttaatgttaaaaggttgttttttatgttaaagtgaaa300
aaaacagatgttgggaggtacagtgatggttgtagatagaaaagaagagaaaaaagttgc360
tgttactttaagacttacaacagaagaaaatgagatattaaatagaatcaaagaaaaata420
taatattagcaaatcagatgcaaccggtattctaataaaaaaatatgcaaaggaggaata480
cggtgcattttaaacaaaaaaagatagacagcactggcatgctgcctatctatgactaaa540
ttttgttaaatgtattagcaccgttattatatcatgagcgaaaatgtaataaaagaaact600
gaaaacaagaaaaattcaagaggacgtaattggacatttgttttatatccagaatcagca660
aaagccgagtggttagagtatttaaaagagttacacattcaatttgtagtgtctccatta720
catgatagggatactgatacagaagataggatgaaaaaagagcattatcatattctagtg780
atgtatgagggtaataaatcttatgaacagataaaaataattacagaagaattgaatgcg840
actattccgcagattgcaggaagtgtgaaaggtcttgtgagatatatgcttcacatggac900
gatcctaataaatttaaatatcaaaaagaagatatgatagtttatggcggtgtagatgtt960
gatgaattattaaagaaaacaacaacagatagatataaattaattaaagaaatgattgag1020
tttattgatgaacaaggaatcgtagaatttaagagtttaatggattatgcaatgaagttt1080
aaatttgatgattggttcccgcttttatgtgataactcggcgtatgttattcaagaatat1140
ataaaatcaaatcggtataaatctgaccgatagattttgaatttaagagtgtcacaagac1200
actcttttttcgcaccagcgaaaactggtttaagccgactgcgcaaaagacataatcgat1260
tcacaaaaaataggcacacgaaaaacaagttaagggatgcagtttatgcatcccttaact1320
tacttattaaataatttatagctattgaaaagagataagaattgttcaaagctaatattg1380
tttaaatcgtcaattcctgcatgttttaaggaattgttaaattgattttttgtaaatatt1440
ttcttgtattctttgttatcttggttacccgtcttcttaatatgcgtaattgcatctact1500
ctaaatccatcaatgcctttatcaaaccaccagttcatcatttcaaatacagcatctcta1560
acttccggattaccccaattcaaatcaggttgttttttactgaataaatggaaataatat1620
tgctcagtattagcatcatattcccgcgcgccaattgagctcccctttctatgtatgttt1680
tttactagtcatttaaaacgatacattaataggtacgaaaaagcaactttttttgcgctt1740
aaaaccagtcataccaataacttaagggtaactagcctcgccggcaatagttacccttat1800
tatcaagataagaaagaaaaggatttttcgctacgctcaaatcctttaaaaaaacacaaa1860
agaccacattttttaatgtggtcttttattcttcaactaaagcacccattagttcaacaa1920
acgaaaattggataaagtgggatatttttaaaatatatatttatgttacagtaatattga1980
cttttaaaaaaggattgattctaatgaagaaagcagacaagtaagcctcctaaattcact2040
ttagataaaaatttaggaggcatatcaaatgaaatttaataaaattgatttagacaattg2100
gaagagaaaagagatatttaatcattatttgaaccaacaaacgacttttagtataaccac2160
agaaattgatattagtgttttataccgaaacataaaacaagaaggatataaattttaccc2220
tgcatttattttcttagtgacaagggtgataaactcaaatacagcttttagaactggtta2280
caatagcgacggagagttaggttattgggataagttagagccactttatacaatttttga2340
tggtgtatctaaaacattctctggtatttggactcctgtaaagaatgacttcaaagagtt2400
ttatgatttatacctttctgatgtagagaaatataatggttcggggaaattgtttcccaa2460
aacacctatacctgaaaatgctttttctctttctattattccatggacttcatttactgg2520
gtttaacttaaatatcaataataatagtaattaccttctacccattattacagcaggaaa2580
attcattaataaaggtaattcaatatatttaccgctatctttacaggtacatcattctgt2640
ttgtgatggttatcatgcaggattgtttatgaactctattcaggaattgtcagataggcc2700
taatgactggcttttataatatgagataatgccgactgtactttttacagtcggttttct2760
aatgtcactaacctgccccgttagttgaagaaggtttttatattacagctccagatccat2820
atccttctttttctgaaccgacttctcctttttcgcttctttattccaattgctttattg2880
acgttgagcctcggaaccggtacccaggaaacagctatgaccatgtaatacgactcacta2940
tacggggatatcgtcggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctg3000
caaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatc3060
tgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg3120
ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcgg3180
ctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaa3240
gaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggct3300
ggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaaggga3360
ctggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgc3420
cgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctac3480
ctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagc3540
cggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaact3600
gttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcga3660
tgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtgg3720
ccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctga3780
agagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccga3840
ttcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctgggg3900
ttcgagagctcgcttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctg3960
gatttgttcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttattggtgagaatccaagcact4020
agtcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtaga4080
aaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaac4140
aaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttt4200
tccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagcc4260
gtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaat4320
cctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaag4380
acgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcc4440
cagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaag4500
cgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaac4560
aggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgg4620
gtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcct4680
atggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgc4740
tcacatgttctttcctgcgttgtcgacagagtttgcaaaatatacaggggattatatata4800
atggaaacgagaccattggtctcagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggct4860
agtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttgagatctgtccat4920
acccatggtctagaatgctcgagtcagaaaaatatacctgtatcttttttcaaaagcaaa4980
catgctttgggtaaacatgtaggtattaacgtcaatgcgacaatagtagcattgattaaa5040
tgagaattagtaagtgttttacttactaaattttatttaacctaaaaatgaaccacctgg5100
atgtgtgggattaaaaagtgaagagaggaggacatatcacatgagtagcgaaaccggtcc5160
ggttgcagtggatccgaccctgcgccgtcgcattgaaccgcacgagtttgaagtgttctt5220
tgatccgcgcgagctgcgcaaagaaacttgcctgctgtacgagattaactggggtggccg5280
ccatagcatctggcgccataccagccagaacaccaataagcacgtggaagtgaattttat5340
tgaaaaatttaccaccgagcgctacttctgccctaatacccgctgcagcatcacctggtt5400
tctgagctggagcccgtgcggcgaatgtagtcgcgccattaccgagttcctgagccgcta5460
tccgcatgtgaccctgttcatctacatcgcccgtctgtaccatcacgccgatccgcgcaa5520
tcgccaaggtctgcgtgatctgattagcagcggtgtgaccatccagatcatgaccgaaca5580
agagagcggctattgctggcgcaacttcgtgaactattctccgagcaacgaagcccactg5640
gccgcgttatccgcatctgtgggtgcgcctgtatgtgctggagctgtactgcatcatcct5700
gggcctgccgccttgcctgaatattctgcgccgtaaacagccgcaactgacattcttcac5760
catcgcactgcagagctgccattatcagcgcctgccgccgcacattttatgggccaccgg5820
tctgaaaagcggtagtgaaactccgggcacaagcgaaagcgcaaccccggaaagtgataa5880
gaaatactcaataggcttagctatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactga5940
tgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtat6000
caaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcg6060
tctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctaca6120
ggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaaga6180
gtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaatatagt6240
agatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaaattggt6300
agattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaa6360
gtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgatgtggacaa6420
actatttatccagttggtacaaacctacaatcaattatttgaagaaaaccctattaacgc6480
aagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatcaagacgattaga6540
aaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgc6600
tttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaa6660
attacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcgcaaattgg6720
agatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatcagatgctattttactttc6780
agatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaa6840
acgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttagttcgacaacaact6900
tccagaaaagtataaagaaatcttttttgatcaatcaaaaaacggatatgcaggttatat6960
tgatgggggagctagccaagaagaattttataaatttatcaaaccaattttagaaaaaat7020
ggatggtactgaggaattattggtgaaactaaatcgtgaagatttgctgcgcaagcaacg7080
gacctttgacaacggctctattccccatcaaattcacttgggtgagctgcatgctatttt7140
gagaagacaagaagacttttatccatttttaaaagacaatcgtgagaagattgaaaaaat7200
cttgacttttcgaattccttattatgttggtccattggcgcgtggcaatagtcgttttgc7260
atggatgactcggaagtctgaagaaacaattaccccatggaattttgaagaagttgtcga7320
taaaggtgcttcagctcaatcatttattgaacgcatgacaaactttgataaaaatcttcc7380
aaatgaaaaagtactaccaaaacatagtttgctttatgagtattttacggtttataacga7440
attgacaaaggtcaaatatgttactgaaggaatgcgaaaaccagcatttctttcaggtga7500
acagaagaaagccattgttgatttactcttcaaaacaaatcgaaaagtaaccgttaagca7560
attaaaagaagattatttcaaaaaaatagaatgttttgatagtgttgaaatttcaggagt7620
tgaagatagatttaatgcttcattaggtacctaccatgatttgctaaaaattattaaaga7680
taaagattttttggataatgaagaaaatgaagatatcttagaggatattgttttaacatt7740
gaccttatttgaagatagggagatgattgaggaaagacttaaaacatatgctcacctctt7800
tgatgataaggtgatgaaacagcttaaacgtcgccgttatactggttggggacgtttgtc7860
tcgaaaattgattaatggtattagggataagcaatctggcaaaacaatattagatttttt7920
gaaatcagatggttttgccaatcgcaattttatgcagctgatccatgatgatagtttgac7980
atttaaagaagacattcaaaaagcacaagtgtctggacaaggcgatagtttacatgaaca8040
tattgcaaatttagctggtagccctgctattaaaaaaggtattttacagactgtaaaagt8100
tgttgatgaattggtcaaagtaatggggcggcataagccagaaaatatcgttattgaaat8160
ggcacgtgaaaatcagacaactcaaaagggccagaaaaattcgcgagagcgtatgaaacg8220
aatcgaagaaggtatcaaagaattaggaagtcagattcttaaagagcatcctgttgaaaa8280
tactcaattgcaaaatgaaaagctctatctctattatctccaaaatggaagagacatgta8340
tgtggaccaagaattagatattaatcgtttaagtgattatgatgtcgatcacattgttcc8400
acaaagtttccttaaagacgattcaatagacaataaggtcttaacgcgttctgataaaaa8460
tcgtggtaaatcggataacgttccaagtgaagaagtagtcaaaaagatgaaaaactattg8520
gagacaacttctaaacgccaagttaatcactcaacgtaagtttgataatttaacgaaagc8580
tgaacgtggaggtttgagtgaacttgataaagctggttttatcaaacgccaattggttga8640
aactcgccaaatcactaagcatgtggcacaaattttggatagtcgcatgaatactaaata8700
cgatgaaaatgataaacttattcgagaggttaaagtgattaccttaaaatctaaattagt8760
ttctgacttccgaaaagatttccaattctataaagtacgtgagattaacaattaccatca8820
tgcccatgatgcgtatctaaatgccgtcgttggaactgctttgattaagaaatatccaaa8880
acttgaatcggagtttgtctatggtgattataaagtttatgatgttcgtaaaatgattgc8940
taagtctgagcaagaaataggcaaagcaaccgcaaaatatttcttttactctaatatcat9000
gaacttcttcaaaacagaaattacacttgcaaatggagagattcgcaaacgccctctaat9060
cgaaactaatggggaaactggagaaattgtctgggataaagggcgagattttgccacagt9120
gcgcaaagtattgtccatgccccaagtcaatattgtcaagaaaacagaagtacagacagg9180
cggattctccaaggagtcaattttaccaaaaagaaattcggacaagcttattgctcgtaa9240
aaaagactgggatccaaaaaaatatggtggttttgatagtccaacggtagcttattcagt9300
cctagtggttgctaaggtggaaaaagggaaatcgaagaagttaaaatccgttaaagagtt9360
actagggatcacaattatggaaagaagttcctttgaaaaaaatccgattgactttttaga9420
agctaaaggatataaggaagttaaaaaagacttaatcattaaactacctaaatatagtct9480
ttttgagttagaaaacggtcgtaaacggatgctggctagtgccggagaattacaaaaagg9540
aaatgagctggctctgccaagcaaatatgtgaattttttatatttagctagtcattatga9600
aaagttgaagggtagtccagaagataacgaacaaaaacaattgtttgtggagcagcataa9660
gcattatttagatgagattattgagcaaatcagtgaattttctaagcgtgttattttagc9720
agatgccaatttagataaagttcttagtgcatataacaaacatagagacaaaccaatacg9780
tgaacaagcagaaaatattattcatttatttacgttgacgaatcttggagctcccgctgc9840
ttttaaatattttgatacaacaattgatcgtaaacgatatacgtctacaaaagaagtttt9900
agatgccactcttatccatcaatccatcactggtctttatgaaacacgcattgatttgag9960
tcagctaggaggtgactgatggctggttggcgtactgttgtggtaaatacccatgggtat10020
ggacagttttcccgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaatag10080
gcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgaca10140
catgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagc10200
ccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatc10260
agagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaag10320
gagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcg10380
atcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcg10440
attaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgc10500
caagcttgcatgcctgcagaacggattgttgatgattacgaaaatattaagagcacagac10560
tattacacagaaaatcaagaattaaaaaaacgtagagagagtttgaaagaagtagtgaat10620
acatggaaagaggggtatcacgaaaaaagtaaagaggttaataaattaaagcgagagaat10680
gatagtttgaatgagcagttgaatgtatcagagaaatttcaagctagtacagtgacttta10740
tatcgtgctgcgagggcgaatttccctgggtttgagaaagggtttaataggcttaaagag10800
aaattctttaatgattccaaatttgagcgtgtgggacagtttatggatgttgtacaggat10860
aatgtccagaaggtcgatagaaagcgtgagaaacagcgtacagacgatttagagatgtag10920
aggtacttttatgccgagaaaactttttgcgtgtgacagtccttaaaatata10972
<210>2
<211>51
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>2
catggataagaaatactcaataggcttagctatcggcacaaatagcgtcgg51
<210>3
<211>22
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>3
cgattatgtcttttgcgcagtc22
<210>4
<211>19
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>4
cgcaccagcgaaaactggt19
<210>5
<211>51
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>5
ccgacgctatttgtgccgatagctaagcctattgagtatttcttatccatg51
<210>6
<211>56
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>6
gtcgaccgagaccattggtctcagataagaaatactcaataggcttagctatcggc56
<210>7
<211>28
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>7
cgcagcacgatataaagtcactgtacta28
<210>8
<211>28
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>8
gctagtacagtgactttatatcgtgctg28
<210>9
<211>55
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>9
agtatttcttatctgagaccaatggtctcggtcgacaacgcaggaaagaacatgt55
<210>10
<211>63
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>10
cacatgttctttcctgcgttgtcgaccgagaccattggtctcaatgagtagcgaaaccgg60
tcc63
<210>11
<211>47
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>11
gctaagcctattgagtatttcttatcactttccggggttgcgctttc47
<210>12
<211>64
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>12
tgctcacatgttctttcctgcgttgtcgacagagtttgcaaaatatacaggggattatat60
ataa64
<210>13
<211>55
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>13
cactgcaaccggaccggtttcgctactcatgtgatatgtcctcctctcttcactt55
<210>14
<211>20
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>14
caagcaattaacgtatacga20
<210>15
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>15
gaaacaagcaattaacgtatacga24
<210>16
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>16
gttcgttaattgcatatgctcaaa24
<210>17
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>17
tcaatttagaaagaggaaaagcaa24
<210>18
<211>20
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>18
tggaaacatgagcgcaatac20
<210>19
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>19
gaaatctgatattaatattaaaac24
<210>20
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>20
aaacgttttaatattaatatcaga24
<210>21
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>21
gaaaagcaatactacagtaaaaac24
<210>22
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>22
aaacgtttttactgtagtattgct24
<210>23
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>23
gaaatgtctacaaagttgcagcga24
<210>24
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>24
aaactcgctgcaactttgtagaca24
<210>25
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>25
gaaaagaacgaaaggtaccattgc24
<210>26
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>26
aaacgcaatggtacctttcgttct24
<210>27
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>27
gaaaggattcaacggtaatgttac24
<210>28
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>28
aaacgtaacattaccgttgaatcc24
<210>29
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>29
gaaaatatatcgaaccgatcataa24
<210>30
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>30
aaacttatgatcggttcgatatat24
<210>31
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>31
gaaaaatgttactggtgatgatac24
<210>32
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>32
aaacgtatcatcaccagtaacatt24
<210>33
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>33
gaaaaggtataacgaatgttaaat24
<210>34
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>34
aaacatttaacattcgttatacct24
<210>35
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>35
gaaagaaaatatactaattaaaaa24
<210>36
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>36
aaactttttaattagtatattttc24
<210>37
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>37
gaaagaagaaggtgctaacaaaag24
<210>38
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>38
aaaccttttgttagcaccttcttc24
<210>39
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>39
gaaaggaaaaattggcggccttat24
<210>40
<211>24
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>40
aaacataaggccgccaatttttcc24
<210>41
<211>3437
<212>dna
<213>artificialsequence(人工合成)
<400>41
gaattcgagctcggtacctcgcgaatgcatctagaatgagtagcgaaaccggtccggttg60
cagtggatccgaccctgcgccgtcgcattgaaccgcacgagtttgaagtgttctttgatc120
cgcgcgagctgcgcaaagaaacttgcctgctgtacgagattaactggggtggccgccata180
gcatctggcgccataccagccagaacaccaataagcacgtggaagtgaattttattgaaa240
aatttaccaccgagcgctacttctgccctaatacccgctgcagcatcacctggtttctga300
gctggagcccgtgcggcgaatgtagtcgcgccattaccgagttcctgagccgctatccgc360
atgtgaccctgttcatctacatcgcccgtctgtaccatcacgccgatccgcgcaatcgcc420
aaggtctgcgtgatctgattagcagcggtgtgaccatccagatcatgaccgaacaagaga480
gcggctattgctggcgcaacttcgtgaactattctccgagcaacgaagcccactggccgc540
gttatccgcatctgtgggtgcgcctgtatgtgctggagctgtactgcatcatcctgggcc600
tgccgccttgcctgaatattctgcgccgtaaacagccgcaactgacattcttcaccatcg660
cactgcagagctgccattatcagcgcctgccgccgcacattttatgggccaccggtctga720
aaagcggtagtgaaactccgggcacaagcgaaagcgcaaccccggaaagtcccgggcccg780
tcgactgcagaggcctgcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgt840
gaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaag900
cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctt960
tccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagag1020
gcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcg1080
ttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaat1140
caggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgta1200
aaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaa1260
atcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttc1320
cccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgt1380
ccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctca1440
gttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccg1500
accgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttat1560
cgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgcta1620
cagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatct1680
gcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaac1740
aaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaa1800
aaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaa1860
actcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttt1920
taaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgaca1980
gttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca2040
tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggcc2100
ccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataa2160
accagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatcc2220
agtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgca2280
acgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcat2340
tcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag2400
cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcac2460
tcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgctttt2520
ctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagtt2580
gctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgc2640
tcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat2700
ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcacca2760
gcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcga2820
cacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagg2880
gttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaatagggg2940
ttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatga3000
cattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatg3060
acggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcgg3120
atgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggct3180
ggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaa3240
taccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgc3300
gcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaag3360
ggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgtt3420
gtaaaacgacggccagt3437