本发明涉及植物育种和遗传学领域，特别是，涉及用于提高植物耐诸如干旱和冷胁迫等非生物胁迫的重组dna构建体。
背景技术：
生物和非生物原因可以对植物产生胁迫，例如造成生物胁迫的原因包括病原菌感染、昆虫取食、一种植物对另一种植物的寄生，例如槲寄生；非生物胁迫包括诸如有效水分的过量或者不足、极限温度和诸如除草剂的合成化学药品。
非生物胁迫是造成世界范围内农作物减产的主要原因，造成主要农作物平均减产50％以上(boyer,j.s.(1982)science218：443-448；bray,e.a.等(2000)inbiochemistryandmolecularbiologyofplants,editedbybuchannan,b.b.等,amer.soc.plantbiol.,pp.1158-1249)。植物固着于地面，必须调整以适应周围的环境条件，这就导致了植物发育中基因调控、形态形成和新陈代谢的巨大可塑性。植物的适应和防御策略包括激活编码重要蛋白的基因，这些蛋白可以使植物适应或防御不同胁迫条件。
干旱(有效水分不足)是一种主要的非生物胁迫，限制了世界范围内农作物的生产。在植物生长发育阶段，将植物暴露于水分限制环境下，将会激活植物各种不同生理和发育变化。遗传学研究表明植物的耐旱性是一个由多基因调控的数量性状，分子标记辅助育种能够提高农作物的耐旱性，转基因途径提高农作物的耐旱性已经取得了很大进展(vinocurb.andaltmana.(2005)curr.opin.biotechnol.16:123-132；lawlordw.(2013)j.exp.bot.64：83-108)。
发明概述
本发明包括以下具体实施例：
在一个实施例中，本发明包括一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与seqidno：1的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与seqidno：2的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与seqidno：3的序列一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列，其中增加所述多核苷酸的表达量能够提高植物的耐旱性。所述分离的多核苷酸包括seqidno：1或2所示的核苷酸序列；所述多肽包括seqidno：3所示的氨基酸序列。进一步的，增加所述多核苷酸的表达量提高植物在正常生长条件下的籽粒产量。
在另一个实施例中，本发明包括一种重组dna构建体，所述重组dna构建体包括一种分离的多核苷酸和与其可操作的连接至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与seqidno：1或2的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与seqidno：3的序列一致性至少为90％；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。
在另一个实施例中，本发明包括一种修饰的植物或种子，所述植物或种子包含编码ftr1多肽的至少一个多核苷酸，其中与对照植物或种子相比，所述至少一个多核苷酸的表达量是增加的；其中所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与seqidno：1或2的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸序列，其编码的多肽的氨基酸序列与seqidno：3的序列一致性至少为90％。
所述修饰的植物在其基因组中包含一种重组dna构建体，所述重组dna构建体包含一种多核苷酸和与其可操作连接的至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与seqidno：1或2的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与seqidno：3的序列一致性至少为90％；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列，其中，与对照植物相比，所述植物表现出提高的耐旱性，所述提高的耐旱性能可以表现为干旱条件下种子结实率增加或籽粒产量增加。
所述修饰植物包含修饰的调控元件用于提高内源多聚核苷酸的表达量，其中所述多核苷酸包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与seqidno：1的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与seqidno：2的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与seqidno：3的序列一致性至少为90％；其中，与对照植物相比，所述植物表现出提高的耐旱性。
与对照植物相比，所述植物在正常条件下表现出提高的籽粒产量。
在另一个实施例中，公开了提高植物耐旱性的方法，所述方法包括，与对照植物相比，提高植物中编码ftr1多肽的至少一个多核苷酸的表达，其中所述多聚核苷酸包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与seqidno：1的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与seqidno：2的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与seqidno：3的序列一致性至少为90％；其中，与对照植物相比，所述获得植物表现出提高的耐旱性，所述提高的耐旱性表现为干旱条件下，提高的结实率、或增加的籽粒产量。
进一步的，所述多核苷酸的表达量通过以下方式提高：(a)通过向植物中转入重组dna构建体以提高编码ftr1多肽的多核苷酸的表达，其中所述重组dna构建体包括编码ftr1多肽的多核苷酸，和与其可操作连接的至少一个异源调控元件，其中，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seqidno：3的序列一致性至少为90％；(b)增加内源多核苷酸的表达量，所述内源多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seqidno:3的序列一致性至少为90％。
在另一实施例中，公开了提高水稻或玉米植株籽粒产量的方法，其中，与对照植物相比，所述植物在正常和/或胁迫条件下表现出提高的籽粒产量，所述方法包括增加内源osftr1基因表达或者增加异源ftr1基因在水稻或玉米植株中的表达。
在另一个实施例中，公开了一种方法，所述方法中，当与对照植物中野生型ftr1多肽的活性相比，增加植物中内源ftr1多肽的表达或活性，与所述对照植物相比，所述植物显示出至少一种表型，所述表现选自增加的耐旱性、增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐性或增加的生物量，所述方法包括的步骤为在内源基因ftr1基因的基因组区域(包括调控元件和基因区域)(i)导入一个dna片段或删除一个dna片段或(ii)导入一个或多个核苷酸的改变，其中所述dna片段或核苷酸的改变能够有效增加内源ftr1多肽的表达或活性；所述dna片段或者核苷酸的改变可以通过锌指核酸酶、转录激活子样效应核酸酶(talen)、成簇的规则间隔的短回文重复序列技术(crispr)cas、引导cas核酸内切酶、归位核酸酶切酶或crispr-cas核糖核蛋白复合体介导实现。
在另一个实施例中，本发明包括任一公开的植物，所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷。
在另一个实施例中，公开了一种在水稻植株群体中鉴定一个或多个等位基因的方法，所述等位基因与籽粒产量的增加相关，所述方法包括的步骤为(a)检测水稻植株群体中一个或多个多态性，所述多态性位于(i)多肽编码的基因组区域或(ii)调控所述多肽表达的调控区域，所述多肽包含的氨基酸序列选自seqidno：3,或与seqidno：3序列一致性为90％以上的氨基酸序列；所述多肽编码基因组区域或所述调控多肽表达的调控区域的一个或多个多态性与籽粒产量相关；和(b)鉴定一个或多个等位基因，所述等位基因位于增加产量相关的一个或多个多态性中，所述增加产量相关的一个或多个等位基因可用于分子标记辅助选择增加籽粒产量的水稻植株。所述一个或多个多态性位于多核苷酸的编码区，所述调控区域是启动子。
在另一个实施例中，本发明涉及重组dna构建体，所述重组dna构建体包含本发明任一分离的多核苷酸和与其可操作连接至少一个调控元件；以及含有所述重组dna构建体的细胞、植物或种子。所述细胞可以是真核细胞，如酵母、昆虫或植物细胞；也可以是原核细胞，诸如细菌细胞。
序列表的详细描述
根据以下发明详述和序列表，可以更全面的理解本发明，以下发明详述和序列表形成本发明的一部分。
表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列的编号
序列描述以及关联的序列表遵循如37c.f.r.§1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照iupac-iubmb标准所定义的，该标准在nucleicacidsres.13：3021-3030(1985)以及在biochemicalj.219(no.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本发明。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37c.f.r.§1.822中列出的规则。
详细描述
本发明中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本发明。
如本发明所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。
如本发明所述：
“osftr1”是铁氧还蛋白硫氧还蛋白还原酶1(ferredoxin-thioredoxinreductase1)，涉及水稻基因位点loc_os04g44650.1及其相关的等位基因变异体编码的能够赋予植物耐旱性表型水稻多肽。“ftr1多肽”此处涉及osftr1多肽和源于其他植物的同源物。
osftr1多肽(seqidno：3)是水稻基因位点loc_os04g44650.1及其相关的等位基因变异体的编码序列(cds)(seqidno：2)或核酸序列(seqidno：1)编码的氨基酸序列。该多肽在tigr中(theinternetatplantbiologymsu.edu/index.shtml)注释为“铁氧还蛋白硫氧还蛋白还原酶，可变链，推测，表达”。
本发明中的单子叶植物包括禾本科的植物；双子叶植物包括十字花科、豆科和茄科的植物。
“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“子代”包括植物的任何后续世代。
“修饰的植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸或修饰的基因或启动子的植物。例如异源多核苷酸能够稳定地整合进基因组中，并遗传连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组dna构建体的部分整合进基因组中。t0植物直接源于转化和再生过程，t0植物的子代为t1代(第一个子代)，t2代(第二个子代)等。
针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“转基因的”指其基因组因异源核酸(如重组dna构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本发明所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因，测试的植物或植物细胞可以是转基因植物或转基因植物细胞的子代。
对照植物或对照植物细胞包括，例如：(a)相同基因型并用于基因改变产生受测植物或细胞的野生型植物或细胞；(b)相同基因型作为起始材料但是转入空载体(如带有标记基因的并对目标的性状没有影响的载体)的植物或植物细胞；(c)转基因植物或植物细胞性状分离，获得的非转基因的子代植物或植物细胞；(d)没有暴露于可以诱导基因表达的条件或刺激下的，与转基因植物或植物细胞基因组相同的植物或植物细胞；(e)特定的目标基因不表达情况下的，转基因植物或者植物细胞本身。对照可以包括多种代表上述一种或多种类型的个体，例如，(c)中性状分离后非转基因的材料的混合通常认为是bulknull。
本发明中，zh11-tc、dp0158和bn指对照植物。zh11-tc表示通过组织培养中花11获得的水稻植株；dp0158表示转化空载体dp0158获得水稻植株；bn表示bulknull对照，包括转化过程中与阳性事件同时出现的不同事件分离种子的混合。
“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理的、形态的、生化的或物理的特征。在一些实施例中，这些特征可以是肉眼可见的，比如种子、植株的大小等；可用生物化学技术测定的指标，如种子或叶片中蛋白、淀粉或油份的含量等；可观察的代谢或生理过程，如测定对水分胁迫、特定盐、糖或氮浓度的耐性；可检测的基因表达水平；或可观察渗透胁迫的耐性或产量等农艺性状。
“农艺性状”是可测量的指标参数，包括但不限于：叶片绿色、籽粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物营养组织氮含量、植物总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、植物营养组织游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序的大小、早期苗的活力和低温胁迫下的出苗状况。
“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。
“干旱”指植物可用水分的减少，特别是较长时间的缺水或者在植物重要的生长阶段发生，会造成植物损伤，或阻止植物的生长(限制植物的生长，降低籽粒的产量)。
“耐旱性”指干旱胁迫下植物能够存活并且没有实质性的生理或物理改变的能力，和/或一段时间干旱后复水能够恢复的能力。“
多肽的“耐旱能力”表示与参照或对照植物相比，过表达该多肽可以提高转基因植物的耐旱性能。
植物“增强的耐旱性”是与参照或对照植物相比测定的，反映了植物在干旱胁迫下存活的能力，并且与参照或对照相比，具有较小的生理或物理损伤，或者干旱胁迫后复水时，恢复较快的能力。
“环境条件”指植物生长的环境，诸如可用的水分、可用的营养物质或昆虫或病害的存在。
“百草枯”(1,1-二甲基-4,4-联吡啶二氯化物)是一类叶片喷施的非选择性的吡啶除草剂，能够引起光氧化胁迫，并进一步造成植物的损害或者阻止植物的正常生长。
“百草枯耐性”是植物的一种性状，反映了百草枯溶液处理后，与参照或对照植物相比，植物的存活或生长良好的能力。
植物“增加的百草枯耐性”是相对于参照或对照植物测定的，反映了植物在百草枯溶液处理后，与参照或对照植物相比，能够存活并具有较小的生理或物理伤害的能力。通常，针对较低浓度的百草枯溶液的耐性用作诸如干旱胁迫的非生物胁迫耐性的一种指标。
“氧化胁迫”反映了活性氧分子的生成和生物系统清除活性氧中间体或修复损伤的能力之间的不平衡。扰乱细胞正常的氧化还原状态会导致产生过氧化氢和自由基的毒性效应，过氧化氢和自由基能够损害包括蛋白、脂质和dna在内的细胞组成部件。
“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体dna，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器dna。
“全长互补序列”是指给定核苷酸序列的互补序列，互补序列和核苷酸序列含有相同的核苷酸数，并且100％的互补。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链rna或dna聚合物。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“a”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应rna或dna)，“c”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“g”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“u”表示尿苷酸，“t”表示脱氧胸苷酸，“r”表示嘌呤(a或g)，“y”表示嘧啶(c或t)，“k”表示g或t，“h”表示a或c或t，“i”表示肌苷，并且“n”表示任何核苷酸。
“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和adp-核糖基化。
“信使rna(mrna)”指无内含子并且可通过细胞翻译成蛋白质的rna。
“cdna”指与mrna模板互补并且利用逆转录酶从mrna模板合成的dna。cdna可为单链的或者可用dna聚合成酶i的klenow片段合成双链形式。
“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。
“前体”蛋白质指mrna的翻译初级产物；即带有前肽和原肽的蛋白质。前肽和原肽可为并且不限于细胞内定位信号。
“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上是游离的，或者以其他方式从通常与自然环境中的物质相伴或者相互作用的组份中分离出来的。分离的多核苷酸可从它们天然存在的宿主细胞中纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
“重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。
“重组dna构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组dna构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
术语“入门克隆”和“入门载体”本发明可互换使用。
“调控序列”、“调控元件”和“调控区域”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
“植物中有功能启动子”是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。
“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。
“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成mrna或功能rna)和/或rna翻译成前体或成熟蛋白质。
有关将核酸片段(例如重组dna构建体)插入细胞内的“导入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体dna)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mrna)。
“转化细胞”是将核酸片段(如重组dna构建体)导入其中的任何细胞。
本发明所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。
“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含dna的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。
“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。
“基因”是一段可表达功能分子的核苷酸片段，所述功能分子，包括但不限于，特定蛋白，所述基因包括位于编码序列上游的调控序列(5’非编码序列)和下游序列(3’非编码序列)。“天然基因”是拥有自身调控序列的自然存在的基因。
“突变基因”是通过人工干预后的产生的基因。由此产生的“突变基因”的序列与非突变基因的序列相比，至少有一个核苷酸增加，删除或替换。“突变植物”是指含有突变基因的植物。
应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明中“靶向突变”是指通过双链断裂诱发剂诱导靶序列dna双链断裂，改变内源基因的特定序列，从而导致内源基因突变。
“遗传修饰”指通过蓄意人为活动而导入植物的基因组核苷酸序列的改变。
“核定位信号”是指靶向核蛋白的信号多肽(raikhel，(1992)plantphys.100：1627-1632)。
“crispr-相关基因”是指编码成簇规律间隔短回文重复(crispr)-相关系统(cas)的多肽组合物的核苷酸序列，所述基因通常耦合存在，与crispr位点侧翼片段相关或相邻。术语“cas基因”和“crispr-相关基因”在本发明中可互换使用。例如包括但不限于，cas3和cas9,它们分别为crispr类型i和crispr类型ii系统编码的内切酶。
“cas内切酶”是指一个由cas基因编码的cas蛋白，所述cas蛋白能导致dna靶序列双链断裂。向导多核苷酸引导cas内切酶识别，并有选择性导致细胞基因组特定位点的双链断裂。
“向导rna(grna)”是指一个由可改变的dna元件编码的crrna(crisprrna)：tracrrna融合的杂合rna分子，grna通常包括一个拷贝的与基因组特定位点的前间区序列互补的间隔序列，和一个用于crispr复合体的相关cas内切酶结合的结合域。
“向导多核苷酸”是指一个可与cas内切酶形成复合体、且使cas内切酶识别和选择dna剪切靶位点的多核苷酸序列。所述向导多核苷酸由一个单分子或一个双分子组成。
术语“向导多核苷酸/cas内切酶体系”是指含有一个cas内切酶和一个前导多核苷酸的复合体，可导致dna靶序列的双链断裂。如果正确的前间区序列邻近基序(pam)大致定位于靶序列的3'末端后，一旦向导rna识别靶序列，cas内切酶才能解开基因组靶位点附近的dna双链序列，并对dna双链进行剪切。
“基因组靶位点”是指定位于宿主基因组的用于定点突变和/或双链断裂的一个前间区和一个前间区序列邻近基序(pam)。
“前间区”是指一段靶向突变和/或双链断裂的短的dna序列(12-40个核苷酸)，所述前间区是基于crrna或sgrna的间隔序列的碱基互补配对，以crispr体系内切酶而导致酶促断裂。
“前间区序列邻近基序(pam)”包括一段3-8个核苷酸序列，紧邻基因组靶位点前间区序列。
crispr位点(成簇规律间隔短回文重复，也称为spidrs-间隔散布定向重复)组成最近描述的dna位点家族。crispr位点由短的、高度保守的dna重复序列(一般24-40个核苷酸，重复1-140次，因此也称为crispr-重复单元)组成，所述dna重复序列部分是回文重复。所述重复序列(通常存在物种特异性)被固定长度(一般20-58个核苷酸，依赖于crispr位点)的可变序列间隔(wo2007/025097公开于2017年3月1日)。
核酸内切酶是可切断多核苷酸链的磷酸二酯键的酶类，包括在特定位点切割dna而不破坏碱基的限制性核酸内切酶。所述限制性核酸内内切酶包括类型i、类型ii、类型iii和类型iv核酸内切酶及其亚类型。在类型i和类型iii系统中，单复合体具有甲基化酶和限制活性。核酸内切酶也包括归巢核酸内切酶(meganucleases或heases)，其类似于限制性核酸内切酶，能结合和剪切特定识别位点，然而归巢核酸内切酶识别位点通常更长，约18个核苷酸或更长(专利申请wo-pctpct/us12/30061，提交日期2012年3月22日)。根据保守序列基序，归巢核酸内切酶可分为四个家族，分别为laglidadg、giy-yig、h-n-h和his-cys盒子家族。这些基序参与到金属离子和磷酸二酯键的水解过程的协调。归巢核酸内切酶的显著点在于其长识别位点和在其dna底物中容忍一些序列多态性。
tal效应因子核酸酶是一种新的序列特异性核酸酶，能导致植物或其他生物基因组特定靶序列双链断裂。tal效应因子核酸酶通过将一个天然或人工合成的转录激活样(tal)效应因子或其功能区，融合到核酸内切酶的催化结构域而产生的，诸如foki内切酶。所述独特的、模块化的tal效应因子dna结合域允许设计具有潜在给定dna识别特异性的蛋白(milleretal.(2011)naturebiotechnology29：143-148)。锌指核酸酶(zfns)是一种人工合成的双链断裂诱发剂，含有一个锌指dna结合结构域和一个双链断裂诱导剂结构域。锌指结构域赋予识别位点特异性，其一般包括2、3或4个锌指结构，例如，有一个c2h2结构，然而其他锌指结构也是已知并是可改造的。锌指结构域是可设计的多肽，能特异结合选定的多核苷酸识别序列。zfns由一个设计的dna结合锌指结构域和与其链接的一个非特异性内切核酸酶结构域构成，例如，源于诸如foki的类型l的核酸内切酶的核酸酶结构域。其它功能可融入锌指结合域，包括转录激活结构域，转录阻遏结构域和甲基化酶。在一些例子中，剪切活性需要核酸酶的二聚作用。每一个锌指可识别靶dna的3个碱基对。例如，一个含有3个锌指结构域能识别9个连续的核苷酸序列，两组含3个锌指结构域经二聚化作用后，则能识别18个核苷酸序列。
“靶位点”、“靶序列”、“靶dna”、“靶位置”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”和“基因组靶位置”在本发明中可互换使用，具体指植物细胞基因组中的一段多核苷酸序列(包括叶绿体dna和线粒体dna)，且在植物细胞基因组中能被cas内切酶诱导双链断裂。靶位点可以是植物基因组中的内源位点，也可以是非自然发生在基因组中的植物异源位点，或靶位点可以是与自然存在的基因组位点异源的位点。本发明中“内源靶序列”和“天然靶序列”可以互换使用，具体指植物基因组内源或天然基因组的靶序列，且是植物基因组靶序列的内源或天然位点。
“变异靶位点”、“变异靶序列”、“修饰靶位点”、“修饰靶序列”在本发明中可互换使用，具体指本发明公开的靶序列，其与未改变的靶序列相比，包括至少有一处变异。所述变异包括，例如：(i)至少一个核苷酸替换，(ii)至少一个核苷酸删除，(iii)至少一个核苷酸插入，或(iv)上述(i)-(iii)的任意组合。
“序列一致性百分比(％)”是经过序列比对和引入缺口后，待测序列(query)相对于参考序列(subject)的氨基酸残基或核苷酸的一致性百分比，如果必须，所述序列一致性百分比是达到最大比例的序列一致性，且不考虑属于序列一致性的氨基酸保守型替换。例如，利用诸如blast,blast-2的公开电脑软件确定序列一致性比例的比对是本领域技术人员熟知的。决定序列比对的合适参数，包括与待测全序列比对达到最大化匹配的算法。本发明中两个序列的“序列一致性百分数”是指序列匹配一致性的数量的函数(例如，待测序列的序列一致性计算包括，将两个序列中相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置数目，获得匹配位置数，然后将匹配的位置数除以比对窗口中位置总数再乘以100)。
本发明中使用的标准重组dna和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：sambrook，j.，fritsch，e.f.和maniatis，t.，molecularcloning：alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress：coldspringharbor，1989(下文称为“sambrook”)。
现在转向实施方案：
实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、赋予耐旱性的重组dna构建体、包含重组dna构建体的诸如植物或种子的组合物、以及利用这些重组dna构建体的方法。
分离的多核苷酸和多肽：
本发明包括如下分离的多核苷酸和多肽：
一种分离的多核苷酸，包括(i)一种核酸序列，其编码的多肽的氨基酸序列与seqidno：3相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列，其中核酸序列(i)与全长互补序列具有相同数目的核苷酸，并且100％的互补。前述任一分离的多核苷酸可用于构建本发明的任一重组dna构建体，提高所述编码的多肽的表达量提高植物的耐旱性和/或百草枯耐性。提高所述编码的多肽的表达量提高植物在正常条件下的籽粒产量。
一种分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列与seqidno：3相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。所述多肽优选为耐旱性多肽，提高所述多肽的表达量增加植物的耐旱性和/或百草枯耐性。提高所述编码的多肽的表达量提高植物在正常条件下的籽粒产量。
一种分离的多核苷酸，包括(i)一种核酸序列，其核苷酸序列与seqidno：2相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；(ii)一种核酸序列，其核苷酸序列与seqidno：1相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(iii)核酸序列(i)或(ii)的全长互补序列。前述任一分离的多核苷酸可用于构建本发明任一重组dna构建体。所述分离的多核苷酸优选为编码耐旱性的多肽，提高所述多肽的表达量提高植物的耐旱性和/或百草枯耐性。提高所述编码的多肽的表达量提高植物在正常条件下的籽粒产量。
应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。例如，丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的n-末端和c-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。
重组dna构建体：
一方面，本发明包括重组dna构建体。
在一个实施方案中，一个重组dna构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件(如植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸包括(i)一种核酸序列，其编码的多肽的氨基酸序列与seqidno：3相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。
在另一个实施方案中，一个重组dna构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件(如植物中有功能的启动子)，其中，所述多核苷酸包括(i)一种核酸序列，其核苷酸序列与seqidno：2相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；(ii)一种核酸序列，其核苷酸序列与seqidno：1相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(iii)核酸序列(i)或(ii)的全长互补序列。
在一个实施方案中，一个重组dna构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件(如植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码一个耐旱性的多肽，所述多肽优选为具有耐旱性和/或百草枯耐性，并可来自，例如水稻(oryzasativa)、拟南芥(arabidopsisthaliana)、玉米(zeamays)、大豆(glycinemax)、烟豆(glycinetabacina)、野大豆(glycinesoja)和短绒野大豆(glycinetomentella)。
调控元件：
本发明的重组dna构建体包含至少一个调控元件。
调控元件可以是启动子或增强子。
多个启动子可用于本发明的重组dna构建体，启动子根据期望的结果选择，可包括宿主生物体中表达的组成型、组织特异型、诱导型、或其他启动子。
一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子称为“组成型启动子”。
当组成型启动子驱动候选基因表达时能够评估候选基因的效应，但候选基因在35s或ubi启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留提高植物耐旱性的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应(kasuga等人(1999)naturebiotechnol.17：287-91)。
适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)rsyn7启动子的核心启动子和在wo99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；camv35s核心启动子(odell等人，(1985)nature313：810-812)；稻肌动蛋白(mcelroy等人，(1990)plantcell2：163-171)；泛素启动子(christensen)等人，(1989)plantmol.biol.12：619-632和christensen等人，(1992)plantmol.biol.18：675-689)；pemu(last等人，(1991)theor.appl.genet.81：581-588)；mas(velten等人，(1984)emboj.3：2723-2730)；als启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。
在选择启动子用于本发明方法时，期望使用组织特异性启动子或发育调节启动子。
组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的dna序列，其调节dna序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并通常限制这种dna序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。
本领域的技术人员知道多种叶片优选的启动子(yamamoto等(1997)plantj.12(2)：255-265；kwon等(1994)plantphysiol.105：357-367；yamamoto等(1994)plantcellphysiol.35(5)：773-778；gotor等(1993)plantj.3：509-518；orozco等(1993)plantmol.biol.23(6)：1129-1138；和matsuoka等(1993)proc.natl.acad.sci.usa90(20)：9586-9590)。
可用于本发明的种子或胚特异性启动子包括大豆kunitz胰蛋白酶抑制剂(kti3，jofuku和goldberg，(1989)plantcell1：1079-1093)，convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子叶)(rerie，w.g.等，(1991)mol.gen.genet.259：149-157；newbigin，e.j.等，(1990)planta180：461-470；higgins，t.j.v.等，(1988)plant.mol.biol.11：683-695)，玉米蛋白(玉米胚乳)(schemthaner，j.p.等，(1988)emboj.7：1249-1255)，菜豆蛋白(菜豆子叶)(segupta-gopalan，c.等，(1985)proc.natl.acad.sci.u.s.a.82：3320-3324)，植物血球凝集素(菜豆子叶)(voelker，t.等，(1987)emboj.6：3571-3577)，b-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(chen，z-l等，(1988)emboj.7：297-302)，谷蛋白(稻胚乳)，大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(marris，c.等，(1988)plantmol.biol.10：359-366)，麦谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(colot，v.等，(1987)emboj.6：3559-3564)。可操作地连接至嵌合基因构建体异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的实施例包括在拟南芥和甘蓝型油菜(brassicanapus)种子中表达脑啡肽的拟南芥属2s种子储藏蛋白基因启动子(vanderkerckhove等，(1989)bio/technology7：l929-932)，表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子(riggs等，(1989)plantsci.63：47-57)，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(colot等，(1987)emboj6：3559-3564)。
诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操纵连接的dna序列。诱导启动子或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。
用于本发明的启动子包括以下启动子：1)胁迫诱导型rd29a启动子(kasuga等，(1999)naturebiotechnol.17：287-91)；2)胁迫诱导启动子rab17(vilardell等，(1991)plantmol.bio.17:985-993；kampbusk等(1997)plantj11(6)：1285-1295)；3)大麦启动子b22e；b22e是发育中玉米籽粒中的柄所特异表达的启动子(“primarystructureofanovelbarleygenedifferentiallyexpressedinimmaturealeuronelayers”(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构)klemsdal,s.s.等，(1991)mol.gen.genet.228(1/2)：9-16)；和4)玉米启动子zag2(“identificationandmolecularcharacterizationofzag1，themaizehomologofthearabidopsisfloralhomeoticgeneagamous”，schmidt，r.j.等，(1993)plantcell5(7)：729-737；“structuralcharacterization，chromosomallocalizationandphylogeneticevaluationoftwopairsofagamous-likemads-boxgenesfrommaize”，theissen等，(1995)gene156(2)：155-166；ncbigenbank登录号x80206))。zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(dap)7至8天被检测到，并且引导ciml在发育中的雌花序的心皮中表达，ciml是发育玉米籽粒的籽仁特异的启动子。ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。
对于在发育种子组织中表达的多聚核苷酸，特定的启动子包括种子优选的启动子，尤其是早期籽粒/胚胎启动子和晚期籽粒/胚乳启动子，授粉后籽粒的发育大致可以分为三个基本阶段，籽粒生长的停滞期起始于授粉后0天到10-12天，在此期间，籽粒不再明显的生长，但是决定籽粒活力的重要事件将在此期间发生(如细胞建成数目)。线性籽粒灌浆期起始于授粉后的10-12天并延续到授粉后的40天左右，在此籽粒发育期间，籽粒达到最终的质量，并产生多种储藏物质如淀粉、蛋白质和油等；成熟期起始于授粉后大约40天到收获，在这一过程中，籽粒开始休眠，变干并为萌芽前的种子休眠做准备。本发明中的“早期籽粒/胚胎启动子”指主要在种子发育的停滞期(也就是授粉第0天到授粉后第12天期间)驱动基因表达的启动子；“后期籽粒/胚乳启动子”主要驱动基因在授粉后12天到成熟过程中的种子中基因表达；表达窗口可能会有一些重叠，将根据使用的aba偶联的序列和期望的表型选择启动子。
早期籽粒/胚胎启动子包括，cim1，其在授粉后第5天活跃在特定组织中(wo00/11177)；其它的早期籽粒/胚胎启动子包括种子偏爱启动子end1，其在授粉后7-10天表达，和end2，其在授粉后9-14天在整个籽粒中表达，在授粉后10天在胚乳和果皮中表达(wo00/12733)，此处以全文引用方式并入本文。本发明中的特定方法使用的其它早期籽粒/胚胎启动子包括种子偏爱启动子ltp2(美国专利号5,525,716)；玉米zm40启动子(美国专利号6,403,862)；玉米nuc1c(美国专利号6,407,315)；玉米ckx1-2启动子(美国专利号6,921,815和美国专利申请公开号2006/0037103)；玉米lec1启动子(美国专利号7,122,658)；玉米esr启动子(美国专利号7,276,596)；玉米zap启动子(美国专利申请公开号20040025206和20070136891)；玉米启动子eep1(美国专利申请公开号20070169226)；和玉米启动子adf4(美国专利申请号60/963,878，2007年8月7日申请)。
本发明中调控核酸序列在植物中表达的其它启动子是茎特异启动子，包括苜蓿s2a启动子(genbank登录号ef030816；abrahams等(1995)plantmol.biol.27：513-528)和s2b启动子(genbank登录号ef030817)和类似的启动子。
启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的dna片段。
用于本发明特定实施例的启动子包括：rip2、mlip15、zmcor1、rab17、camv35s、rd29a、b22e、zag2、sam合成酶、泛素、camv19s、nos、adh、蔗糖合成酶、r-等位基因、维管组织偏爱启动子s2a(genbank登录号ef030816)和s2b(genbank登录号ef030817)及来自玉米的组成型启动子gos2。其他启动子还包括根偏爱启动子，例如玉米nas2启动子、玉米cyclo启动子(us2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米rootmet2启动子(wo05063998，公开于2005年7月14日)、crlbio启动子(wo06055487，公开于2006年5月26日)、crwaq81(wo05035770，公开于2005年4月21日)和玉米zrp2.47启动子(ncbi登录号：u38790；gino.1063664)。
本发明的重组dna构建体也可包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在特定实施方案中，重组dna构建体还包括增强子或沉默子。
内含子序列可加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mrna和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见buchman和berg，mol.cellbiol.8：4395-4405(1988)；callis等人，genesdev.1：1183-1200(1987)。
组合物：
本发明的组合物是其基因组中包含本发明的任何重组dna构建体(例如上面所讨论的任何一种构建体)的植物。组合物也包括任何植物的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组dna构建体。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和自交系。
在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的自交系植物。该自交系植物产生含有新导入的重组dna构建体的种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性的植物(例如水分限制条件下改良农艺特征)，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性的植物。所述种子可为玉米种子或水稻种子。
植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如水稻、玉米或大豆植物，如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可为向日葵、高梁、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、黍、甘蔗或柳枝稷。
重组dna构建体可稳定地整合进植物的基因组中。
实施方案包括但不限于以下实施方案：
1.在基因组中包含重组dna构建体的转基因植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，所述重组dna构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接至少一种异源调控元件，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列在与seqidno：3进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性，并且其中，与对照植物相比，所述植物表现出增加的耐旱性和/或百草枯耐性，且所述植物进一步表现出至少一个改变的农艺性状。
2.在其基因组中包含重组dna构建体的转基因植物，如水稻、玉米或大豆植物，所述重组dna构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接至少一个调控元件，其中所述多核苷酸编码一个多肽，与对照植物相比，所述植物表现出增加的耐旱性和/或百草枯耐性，且所述植物进一步表现出至少一个改变的农艺性状。
3.在其基因组中包含重组dna构建体的转基因植物，例如水稻、玉米或大豆植物，所述重组dna构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件，其中所述多核苷酸编码一个多肽，与对照植物相比，所述植物表现出至少一个农艺性状的变化。
4.实施方案1-3所述的植物的任何子代植物，实施方案1-3所述的植物的任何种子，实施方案1-3所述的植物的任何子代植物的种子，和源于实施方案1-3的植物和其子代植物的细胞。
前述实施方案1-4或其它实施方案中，所述耐旱性多肽可来自水稻(oryzasativa)、野生稻(oryzaaustraliensis)、短舌野生稻(oryzabarthii)、非洲型稻(oryzaglaberrima)、阔叶稻(oryzalatifolia)、长雄野生稻(oryzalongistaminata)、南方野生稻(oryzameridionalis)、药用野生稻(oryzaofficinalis)、斑点野生稻(oryzapunctata)、普通野生稻(oryzarufipogon)(红稻)、印度野生稻(oryzanivara)、拟南芥(arabidopsisthaliana)、玉米(zeamays)、大豆(glycinemax)、烟豆(glycinetabacina)、野大豆(glycinesoja)和短绒野大豆(glycinetomentella)。
前述实施方案1-4或其它实施方案中，重组dna构建体包含至少一个植物中有功能的启动子作为调控元件。
前述实施方案1-4或其它实施方案中，至少一种农艺性状的变化可以是增加也可以是减少。
前述1-4实施方案或其它实施方案中，与对照植物相比，所述植物在水分限制条件下表现出至少一个农艺性状的变化。
前述实施方案1-4或其它实施方案中，与对照植物相比，所述植物在氧化胁迫即百草枯胁迫下表现出至少一个农艺性状的变化。
下面的例子描述一些代表性的方法或技术用于模拟干旱条件和/或评估耐旱性；模拟氧化条件。
本领域的技术人员也可以测试模拟或者自然发生的干旱条件下的植物保持足够产量(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的产量)的能力评估耐旱性，例如，干旱条件下产生与非干旱条件下相比实质相当的产量；与对照或参照植物相比，干旱条件下产量减少较少。
参数包括与对照细胞或对照植物相比的恢复度、存活率、百草枯抗性率、基因表达水平、水分利用效率、编码蛋白的水平或活性和其他参数。
本领域技术人员很容易找到适当的对照或参照植物，当采用本发明描述的组合物或方法评估或测定转基因植物一个农艺性状或表型时。例如，但不限于下述举例：
1.转化植物的子代，所述转化植物对于重组dna构建体来说是半合子的，所述子代分离成包含或不包含该dna构建体的植株：包含该重组dna构建体的子代将通常相对于不包含该重组dna构建体的子代来进行测量(即，不包含该重组dna构建体的子代是对照或参照植物)。
2.重组dna构建体基因渗入至近交系中，例如在水稻和玉米中，或基因渗入进变种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或变种品系进行测量(即，亲本近交系或品种品系是对照或参照植物)。
3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组dna构建体：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参照植物)。
4.包含重组dna构建体的植物：该植株可以相对于这样的对照植物进行评价或测量，该对照植物不包含重组dna构建体，但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组dna构建体的植株相比较，该核遗传物质具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。
方法：
方法包括但不限于：提高植物耐旱性的方法，评估植物耐旱性的方法，提高植物百草枯耐受性的方法，改变植物农艺性状的方法，确定植物农艺性状变化的方法，和生产种子的方法。
方法包括但不限于：
转化细胞方法包括将本发明公开的任意一个或多个分离的多核苷酸转化细胞，其中，在特定的实施方案中，所述细胞是真核细胞，如酵母、昆虫或植物细胞；或原核细胞如细菌细胞。
产生转基因植物的方法包括转化将本发明公开的任意分离的核苷酸或重组dna构建体转化植物细胞和由转化的植物细胞再生转基因植物，其中本方法获得转基因植物和转基因种子可用于本发明的其他方法。
从细胞或细胞培养物中分离本发明的多肽的方法，其中，所述细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含本发明的一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件，所述宿主细胞在适于重组dna构建体表达的条件下生长。
改变本发明多肽在宿主细胞中表达水平的方法包括：(a)将本发明重组dna构建体转化宿主细胞；和(b)使转化宿主细胞在适于重组dna构建体表达的条件下生长，其中重组dna构建体的表达导致转化宿主细胞中本发明多肽含量的变化。
提高植物耐旱性的方法包括：提高植物中编码ftr1多肽的至少一个多核苷酸的表达，其中所述多核苷酸包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与seqidno：1的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与seqidno：2的序列一致性至少为85％；和(c)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与seqidno：3的序列一致性至少为90％。
提高植物耐旱性和/或百草枯耐受性的方法，包括(a)将重组dna构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组dna构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接至少一种调控元件(例如在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与seqidno：3进行比较时，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组dna构建体并且在与对照植物进行比较时表现出提高的耐旱性和/或百草枯耐性；和(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组dna构建体，与对照植物相比，表现出提高的耐旱性和/或百草枯耐性。
评估植物耐旱性和/或百草枯耐性的方法，包括(a)获得转基因植物，所述转基因植物在其基因组中包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件(如，植物中有功能的启动子)，其中，所述多核苷酸编码一个多肽，所述多肽的氨基酸序列与seqidno：3相比，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；(b)获得源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组dna构建体；和(c)与对照植物相比，评估子代植物的耐旱性和/或百草枯耐性。
确定植物一种农艺性状变化的方法，包括(a)获得转基因植物，所述转基因植物在其基因组中包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接至少一个调控元件(如，植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码一个多肽，所述多肽的氨基酸序列与seqidno：3相比，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；(b)获得源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物的基因组中包含重组dna构建体；和(c)水分限制条件下，确定与对照植物相比，所述子代植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。
生产种子的方法包括前述的任一方法，进一步还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含重组dna构建体。
在前述任一的方法或本文其他实施方案披露的任意方法中，所述引入步骤中所述再生植物细胞可包括愈伤细胞、胚胎愈伤细胞、配子细胞、分生细胞、或不成熟的胚胎细胞。可再生植物细胞可源于自交玉米植株。
在前述任一方法或本文披露的其他实施方案中的任一方法中，所述再生步骤可包括：(i)在含有胚促激素培养基上培养所述转化的植物细胞直至长出愈伤组织；(ii)将步骤(i)所述的转化植物细胞转移至含有组织促激素的第一培养基上；和(iii)将步骤(ii)所述转化植物细胞接种到第二培养基上，使其茎伸长、根发育或两者均发育。
在前述任一方法或本发明的其他实施方案的方法中，确定转基因植物农艺性状的变化的步骤，如果可行，可包括在可变的环境条件下，确定与不含有重组dna构建体的对照植物相比，转基因植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。
在前述任一方法或者本发明其他实施方案的任一方法中，如果可能，确定子代植物农艺性状变化的步骤包括可变的环境条件下，确定与不含有重组dna构建体的对照植物相比，所述子代植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。
在前述任一方法或者本发明其他实施方案的任一方法中，与对照植物相比，植物在水分限制条件下表现出至少一个农艺性状的变化。
在前述任一方法或者本发明其他实施方案的任一方法中，存在将重组dna构建体导入可再生植物的供选方案，所述重组dna构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件，例如可以将一个调控元件(如一个或多个增强子、任选的转座子元件的一部分)导入可再生植物细胞，接着筛选带有调控元件和与其可操作连接的编码本发明多肽的内源基因的转基因事件。
可以通过任何适当的技术将本发明的重组dna构建体导入植物中，所述技术包括但不限于直接dna吸收、化学药品处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的dna转移、基因枪轰击或农杆菌的转化。植物转化和再生的技术在国际专利公开号wo2009/006276中描述，其全部内容并入作为参考。
另外，也有修饰或改变宿主内源基因组dna的方法，包括改变宿主天然dna序列或包括调控元件、编码或非编码序列等前体转基因序列。这些方法也可以用于将核酸序列靶向到基因组中改造目标识别序列。例如本文中转基因修饰的细胞或植物使用传统的基因工程核酸酶如产生修饰植物基因组的归位核酸内切酶产生(例如wo2009/114321；gao等(2010)plantjournal1：176-187)。其他的位点定向工程是通过使用锌指结构域识别偶联的限制性内切酶的限制性特点修饰内源基因(例如urnov等(2010)natrevgenet.11(9)：636-46；shukla等(2009)nature459(7245)：437-41)。转录激活样(tal)效应因子-dna修饰酶(transcriptionactivator-likeeffector-dnamodifyingenzyme，tale或talen)可用于基因工程修饰植物基因组，参见例如us20110145940,cermak等(2011)nucleicacidsres.39(12)和boch等(2009)，science326(5959)：1509-12。植物基因组定点修饰也可以使用细菌ii型crispr(成簇的规律的间隔的短回文的重复序列，clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/cas(crispr关联蛋白，crispr-associated)系统，参考例如belhaj等(2013)，plantmethods9:39.crispr/cas系统可以允许可定制的小的非编码rna引导的基因组dna靶向切割。
本领域的技术人员熟悉将编码期望多肽的外源基因转化植物和培育再生植物的方法。再生植物可以自花授粉产生纯合子转基因植物，或者将再生植物的花粉与种子长出的农艺重要的植物杂交，或者农艺重要的植物的花粉与再生的转基因植物杂交。本领域的技术人员熟知培育本文披露的含有期望多肽的转基因植物的方法。
转基因植物中性状的重叠
转基因植物可包含本发明公开的一个或多个耐旱性多核苷酸与一个或多个另外的多核苷酸的堆叠，从而导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列堆叠的转基因植物可通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一者或两者来获得。这些方法包括但不限于培育各自包含靶多核苷酸的单独品系，用后续基因转化包含本发明公开的基因的转基因植物，以及将基因共转化进单个植物细胞中。如本发明所用，术语“堆叠”包括具有存在于同一植物中的多种性状(例如，两种性状均掺入核基因组中，一种性状掺入核基因组中且一种性状掺入质体的基因组中，或者两种性状均掺入质体的基因组中)。在一个非限制性例子中，“堆叠性状”包含序列彼此物理相邻的分子堆叠。如本发明所用的性状是指衍自特定序列或序列群组的表型。可使用包含多个基因的单个转化载体或单独地携带于多个载体上的基因进行基因的共转化。如果序列通过遗传转化植株来堆叠，则靶多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。可以用共转化方案将性状与靶多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)，可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况中，可能期望引入会抑制靶多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，wo1999/25821、wo1999/25854、wo1999/25840、wo1999/25855和wo1999/25853，上述专利均以引用的方式并入本文。
实施例
本文的具体实施进一步在下列实例中示明。在这些实例中，除非特别说明，采用摄氏/公制。在这些实例中，仅用举例说明具体的实施过程。通过上述讨论和具体事例，本领域的专业人员可以查明本发明的基本特征，经过各种改变和修改将本发明应用于各种用途和条件，并不偏离本发明主体和范围。因此，除了本专利表述和讨论的各种修改外，本领域内的专业人员所做的不偏离本发明主题的修改也将落入本专利的权力要求范围内。
实施例1.耐旱基因osftr1的克隆和载体的构建
根据水稻激活标签突变体库初步的筛选结果和基因id为loc_os04g44650.1的序列信息，以中花11号水稻叶、茎和根混合的cdna库为模板，采用常规方法和下述引物克隆了水稻耐旱基因osftr1的cdna。
gc-5898：5'-caatcggcatctcttatcctcac-3'
gc-5899：5'-gacgacgagagcacattattctg-3'
pcr扩增产物长度为577bp，琼脂糖凝胶电泳后，采用试剂盒回收，并与ta克隆载体连接。测序验证构建体中的序列和连接方向后，将基因克隆入双元载体dp0158中(pcambia1300-dsred)。dp0691构建体中克隆序列和osftr1的编码序列如seqidno：1和2所示，osftr1的氨基酸序列如seqidno：3所示。
实施例2.转化获得转基因水稻
过表达载体和空载体(dp0158)采用林拥军和张启发((2005)plantcellrep.23：540-547)描述的农杆菌介导的方法转化入中花11号水稻。中花11号水稻为中国农业科学院作物研究所培育的品种，第一批种子由北京未名凯拓农业生物公司提供。转化实验室获得的t0代转基因幼苗移栽至田间水田中获得t1种子，t1和t2代种子储藏在4℃冷库中。过表达载体含有标记基因，t1和t2代种子在绿色荧光灯下发红色荧光的为转基因种子，并用于下列性状验证试验。
实施例3.基因表达分析
采用标准的rt-pcr程序和实时rt-pcr分析转基因水稻植株中基因的表达水平。ef1α基因用作内参显示转基因水稻和对照植物的扩增和上样量类似。以ef1αmrna水平为参照确定基因表达量。
实施例4.osftr1转基因水稻植株的田间干旱试验
开花期干旱胁迫是农业生产中严重的问题。转基因水稻在田间干旱条件下进行验证。田间干旱试验中，每个基因载体选择12个转基因株系。t2代种子首先消毒，萌发的种子种植在田间苗床上，三叶期时，将水稻幼苗移栽到田间试验地，设置四个重复，每个重复每转基因株系10棵苗，并将四个重复种植在同一地块。同一地块中，邻近转基因株系种植的zh11-tc和dp0158用作统计分析中的对照。
水稻苗期正常管理，并使用相应的杀虫剂和化肥，穗分化期停止浇水，因此开花期时产生干旱胁迫，干旱时间长短取决于温度和湿度等天气条件。干旱期间，使用tdr30(spectrumtechnologies，inc.)在每块地的10个位点每四天测定土壤相对含水量。
试验过程中，观察并记录植株表型，植株的表型主要包括抽穗期、卷叶程度、敏旱性和抗旱性，尤其关注中午时植株的卷叶程度。种植季结束时，每个株系在每行中间挑选约6株具有代表性的植株收获，并称量每株水稻籽粒的重量，利用混合线性模型(mixedlinearmodel)对籽粒重量进行统计分析。p＜0.1时，认为转基因株系为阳性株系，基因具有提高耐旱性功能。
osftr1(dp0691)转基因水稻的田间drt验证结果
第一次田间试验中，使用12个osftr1转基因水稻株系在海南省进行验证，zh11-tc和dp0158用作对照。主茎穗处于幼穗分化ⅱ-ⅲ期，停止浇水。幼穗抽穗过程中，土壤体积含水量从40％降到10％。断水后19天，主茎穗处于幼穗分化ⅷ,分蘖穗处于幼穗分化ⅵ-ⅶ期，一些水稻植株展现出诸如卷叶的表型；断水后33天，50％的幼穗抽出。6个osftr1转基因水稻株系dp0691.01、dp0691.04、dp0691.07、dp0691.11、dp0691.12和dp0691.01在成熟期表现出较好的结实率。
籽粒产量分析表明，载体水平上，osftr1转基因水稻的单株籽粒产量高于zh11-tc对照和dp0158对照；转基因株系水平上，4个osftr1转基因水稻株系的单株籽粒产量显著高于zh11-tc对照，2个转基因株系的单株籽粒产量显著高于dp0158对照(表2)。这些结果表明osftr1转基因水稻耐受干旱胁迫，过量表达osftr1基因提高耐旱性，并提高花期干旱胁迫后植物单株籽粒产量。
表2.osftr1转基因水稻在田间干旱条件下的产量分析(第一次试验)
同样的12个osftr1转基因株系再次在海南进行了测试。当主茎穗处于幼穗分化ⅳ期，停止灌水。断水后21天，50％的穗抽出，水稻植株开始出现干旱胁迫表型。抽穗和成熟过程中，土壤体积含水量从35％降至8％。
籽粒产量分析表明，载体水平上，osftr1转基因水稻的单株籽粒产量显著高于zh11-tc和dp0158对照；转基因株系水平，5个osftr1转基因株系的单株籽粒产量显著高于zh11-tc和dp0158对照(表3)。这些结果表明osftr1转基因水稻获得了耐旱性，并提高了单株籽粒产量。
表3.osftr1转基因水稻在田间干旱条件下的产量分析(第二次试验)
实施例5.osftr1转基因水稻植株的实验室百草枯试验
百草枯(1,1-二甲基-4,4-联吡啶二氯化物)是一类叶片喷施的非选择性的吡啶除草剂，是世界范围内广泛应用一种除草剂，能够控制大量作物如玉米、水稻、大豆等中生长的杂草。在植物细胞中，百草枯主要靶向叶绿体，百草枯通过接受光系统i的电子，然后与氧气发生化学反应生成过氧化物和过氧化氢，而过氧化物和过氧化氢可以导致产生光氧化胁迫。干旱胁迫通常导致植物中产生活性氧(ros)，有时，植物的耐旱性与增强的抗活性氧能力相关。百草枯是强有力的氧化胁迫诱导剂，能够大大的增加活性氧(ros)的产生，同时抑制抗氧化系统活性所需的的还原物和化合物的再生。非生物胁迫增加了ros的产生，而植物响应耐性到死亡的范围取决于胁迫力度和与其相关的ros水平。相对较低水平的百草枯能够模拟胁迫相关的ros产生，并用作植物胁迫生物学中胁迫耐性的标记(hasaneenm.n.a.(2012)herbicide-properties,synthesisandcontrolofweedsbook)。因此，进一步采用百草枯验证耐旱性的转基因水稻。
百草枯试验方法：
每个载体的水稻选择10个转基因株系用于百草枯试验，组培中花11(zh11-tc)和转空载体对照dp0158用作对照。t2代种子参照常规方法消毒和萌发。百草枯试验在温度28-30℃，湿度30％的生长室中进行。萌发的种子放置在底部有孔的离心管中，采用水稻水培方法，培养5天，至一叶一心期；然后选择高度大约3.5～4cm的一致的幼苗用于百草枯试验。本实验采用随机区组设计，在同一个筛选水槽内设置5个区组；区组内包含所有测试的10个转基因株系、zh11-tc和dp0158；区组的行列为16*12，每一行为一份测试材料，故每个转基因株系在区组内各12株，对照zh11-tc和dp0158在区组内各3行；区组内的所有转基因株系和对照均随机排布。幼苗用终浓度为0.8μm的百草枯溶液进行处理7天，光周期为10h黑暗/14h光照，每两天更换一次溶液，在处理和更换溶液后，保证幼苗首先进入光周期的黑暗时期。处理7天后，计算绿色的幼苗。绿色没有损伤的幼苗为百草枯耐性幼苗；叶片、茎部变白褪色的幼苗为非百草枯耐性的幼苗。
耐性率是百草枯试验的一个指标，指保持绿色并显示百草枯耐性表型的幼苗数除以总幼苗数的百分数。
试验数据在载体水平(所有的转基因幼苗与对照幼苗相比)和转基因株系水平(不同的转基因株系与对照相比)进行分析，采用的统计模型为“y～seg+line(seg)+rep+error”，随机效应为“rep”，统计方法是“
osftr1(dp0691)转基因水稻的百草枯验证结果
第一次试验中，百草枯溶液处理7天后，600株osftr1转基因幼苗中，328株保持绿色并显示出百草枯耐性表型，osftr1转基因幼苗的百草枯耐性率为55％；而180株zh11-tc幼苗中，64株具有百草枯耐性表型；180株dp0158幼苗中，54株显示百草枯耐性表型。zh11-tc幼苗和dp0158幼苗的百草枯耐性率分别为36％和30％。载体水平上，所测试的osftr1转基因幼苗的耐性率显著高于zh11-tc和dp0158对照。
进一步在转基因株系水平的分析表明7个osftr1转基因株系的百草枯耐性率高于zh11-tc对照和dp0158对照，6个株系的百草枯耐性率显著高于zh11-tc和dp0158对照(表4)。这些结果表明，与zh11-tc和dp0158两个对照相比，osftr1转基因水稻在载体水平和转基因株系水平均提高了幼苗的百草枯耐性，osftr1在提高转基因植物百草枯耐性或抗氧化能力中起作用。
表4.osftr1转基因水稻的百草枯耐性分析(第一次试验)
第二次试验中，对同样的10个osftr1转基因株系进行测试，百草枯溶液处理7天后，600株osftr1转基因幼苗中，362株保持绿色并显示出百草枯耐性表型，osftr1转基因幼苗的百草枯耐性率为60％；而180株zh11-tc幼苗中，99株具有百草枯耐性表型；180株dp0158幼苗中，90株显示百草枯耐性表型。zh11-tc幼苗和dp0158幼苗的百草枯耐性率分别为55％和50％载体水平上，载体水平上，所测试的osftr1转基因幼苗的耐性率高于zh11-tc对照，并显著高于dp0158对照。
进一步在转基因株系水平的分析表明2个osftr1转基因株系的百草枯耐性率显著高于zh11-tc对照，3个株系的耐性率显著高于dp0158对照(表5)。这些结果进一步表明，osftr1在提高转基因植物百草枯耐性或抗氧化能力中起作用。
表5.osftr1转基因水稻的百草枯耐性分析(第二次试验)
实施例6.转化获得水稻耐旱性基因osftr1转化玉米
转化玉米的过表达载体：
实施例2中的osftr1基因cdna克隆入目的载体获得php79718。载体php79718包含以下表达盒：
1.泛素启动子::mopat::pinii终止子；表达用于在转化过程中的选择的pat抗除草剂性基因的表达盒。
2.ltp2启动子::ds-red2::pinii终止子；表达用于种子分选的ds-red颜色标记基因的表达盒。
3.泛素启动子::osftr1::pinii终止子；过表达所关注基因水稻osftr1多肽的表达盒。
使用农杆菌介导的转化方法，可将载体php79718中存在的osftr1多肽表达盒导入玉米近交系或来源于优良玉米近交系的可转化玉米品系。
实施例7.水稻耐旱基因osftr1转化玉米株系的产量分析
方法：
实施例6获得的转基因植物，不论是自交或杂交的，可通过更严苛的大田试验来研究在正常灌水情况系和水限制条件下的产量提高和/或稳定性。
可对产量进行后续分析以测定含有osftr1基因的植物在与不含有osftr1基因的对照植物比较时，在水限制条件下是否具有产量的改善。具体地讲，可在包含osftr1基因的植物和对照植物的开花期和/或灌浆期施加干旱条件。可以测得这两种植物的产量都有所减少。包含osftr1基因的植物具有相对于对照植物更少的产量损失，例如至少25％、20％、15％、10％或5％更少的产量损失。
osftr1转基因玉米(dp0691)田间验证结果
5个转基因事件于2017年在9个地点进行田间测试，所述9个地点包括：临近a省的jh；b省的mr；c省的三个不同地点gcb、gcd和gck；d省的pp；和e省的三个不同地点wo9、woc和wom的田间。位于e省、mr、gck和d省地点的测试通过在特定生长时期限制灌溉产生干旱；位于jh和c省剩余两个地点的测试，正常灌溉。除灌溉处理外，作物根据当地的实践进行管理，有效控制杂草和害虫。
收集所有测试地点的产量数据，每个地点设置2-3个重复。为评估产量数据，采用混合模型框架进行单点或点分析，在单点分析中，构建体的主效应被认为是随机效应，然而，在其他情况下，构建体效应可以被认为是固定的，转化事件的主效应被认为是随机效应；诸如重复组和重复组中的不完全区组设计这样的区组因子被考虑成为随机的。在多点分析中，将转化事件或构建体的主效应和其与loc_id的相互作用视为随机效应。空间效应有三个部分，包括x_adj，y_adj和回归相关的ar1*ar1以移除田间空间变量产生的噪音。
通过asreml(vsninternationalltd)进行产量分析，数值为blup(最佳线性无偏预估)(cullis,b.retal(1998)biometrics54:1–18,gilmour,a.r.etal(2009).asremluserguide3.0,gilmour,a.r.,etal(1995)biometrics51:1440-50)。
5个转化事件的产量与bulknull(bn)进行比较，null对照，包括转化过程中与阳性事件同时出现的不同事件分离种子的混合。转化事件和null的种子在同一个地块中产生，我们计算每一个转化事件及所有转化事件在构建体水平的blup(最佳线性无偏预估)，使用0.1的p值在双尾检验中进行所述事件和bn之间的显著性检验。
如表6所示出的单点分析的单个转基因事件水平和聚合的构建体水平的产量数据(bu/英亩，bu/ac)，表明了阳性和null之间的差值，显著性不同的值以星号体高亮突出，表明在双尾检验中具有低于或等于0.1的p值。根据经验最佳(opt)，中度干旱胁迫(ms)，或严重干旱胁迫(ss)将不同的地点进行分类。表7显示了所有9个地点的数据分析，并基于地点类型分成环境组。转化的基因对产量的正向效应在多个地点得到展现，wo9和woc是例外，这两个地点是中度干旱胁迫(ms)；所有的转化事件和整个构建体在经验最佳(opt)地点具有显著的正向效应；在ms和ss地点，转化事件4.10和4.15具有正向效应，转化事件4.15在不同的环境组表现显著。
转基因对其他农艺性状如植株和穗的高度和热的时间流(thermaltimetoshed)的影响进行了评价，没有观察到转基因对这些性状的影响(数据未提供)。转基因确实影响收获时籽粒水分(表8、9)和测试重量(表10、11)，增加水分是正向的，在多点分析中达到显著性(表9)，转基因在测试重量时的影响是负向的，并在两个地点达到显著性，并在两个地点wo9和woc观察到对产量的负向效应(表10)。转基因对测试重量的效应在多点分析中没有达到显著(表11)。
表6.null(bn)和转化事件或构建体与null差值的单点产量(ba/ac)
表7.null(bn)和转化事件或构建体与null差值的多点产量(ba/ac)
表8.null(bn)和转化事件或构建体与null差值的单点湿度(％)
表9.null(bn)和转化事件或构建体与null差值的多点湿度(％)
表10.null(bn)和转化事件或构建体与null差值的单点测试重量
表11.null(bn)和转化事件或构建体与null差值的多点测试重量
实施例8.水稻耐旱基因转化的拟南芥的实验室干旱验证
为了验证水稻耐旱性基因是否提高双子叶植物的耐旱性或其它性状，采用农杆菌介导的花浸法将水稻耐旱性基因过表达载体转化拟南芥(cloumbia)，并鉴定转基因拟南芥(clough,s.t.和bent,a.f.(1998)theplantjournal16，735–743；zhang,x.等(2006)natureprotocols1：641-646)。
一个称为pbc-yellow的16.8-kbt-dna双元载体用于本试验。该载体包含一个rd29a启动子驱动zs-yellow基因表达，zs-yellow基因赋予转化种子黄色荧光。按照实施例1描述的方法克隆水稻耐旱性基因，并构建gateway载体；随后采用invitrogentm的
序列表
<110>未名生物农业集团有限公司
先锋海外公司
<120>非生物胁迫耐性提高的植物和提高植物非生物胁迫耐性的
ftr1多聚核苷酸及方法
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