本发明涉及中药制备领域，具体涉及一种从毛花猕猴桃根中提取化合物的方法。
背景技术：
癌症作为一种高致死率的疾病，严重危害人类健康，预测至2020年，全球新发肿瘤病例将达到1500万例，因疾病死亡的人数将达到1200万例。在癌症治疗领域中，天然药物以其作用机制独特、作用靶点多、耐受性好、毒副作用相对较小越来越受到人们的关注。据统计，当今适用于临床的化疗药物中有接近50％属于天然产物或者来自其衍生物。
猕猴桃(actinidiasinensis)，民间俗称“羊桃”、“阳桃”、“藤梨”等，全世界范围内猕猴桃属植物资源极为丰富，品种达到66种，大部分生长在马来西亚至西伯利亚东部的地区，其中有62种在中国被发现，主要分布在秦岭以南和横断山脉以东区域。毛花猕猴桃(actinidiaerianthabenth.)是猕猴桃属植物的一种，又名白花山毛桃、毛冬瓜、白藤梨，广泛分布于浙江、福建、江西、湖南、广西及广东省区。据记载，其具有清热利湿，活血消肿，解毒等功效。作为浙江少数民族用药畲药的一种，在畲族中被广泛用于肿瘤治疗。
毛花猕猴桃作为具有肿瘤临床治疗基础的传统民族医药，目前国内外关于其研究与开发利用的相关报道却相对较少。因此，有必要运用新技术、新方法对毛花猕猴桃的抗肿瘤活性物质、提取方法与药效机制进行系统研究，提供疗效确切且毒副作用小的癌症治疗潜在药物。
有文献报道从毛花猕猴桃根中提取分离得到一种五环三萜皂苷单体化合物：2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸，分子结构如下：
体外试验表明，其能显著抑制人肝癌细胞株hepg2、人前列腺癌细胞株pc3、人胃癌细胞株bgc-823、人结直肠癌sw620的增殖，是具有潜力的抗肿瘤天然药物。但是，从毛花猕猴桃根中简单、高效提取分离得到2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸的大规模工业生产工艺方法却尚未见文献报道。目前现有技术仅报道为鉴定目的的从毛花猕猴桃根中提取分离2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸的相关方法，这些方法步骤繁复、效率低，且纯度和得率均不符合工业大规模生产要求。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供一种从毛花猕猴桃根中高效提取抗肿瘤成分2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸的方法。
本发明通过以下方法实现本发明目的：
(6)取毛花猕猴桃根，粉碎至粒度为40-100目；
(7)毛花猕猴桃根粉末用乙醇回流提取；
(8)滤液经减压至无醇味，加水稀释，离心；
(9)离心的滤液通过大孔吸附树脂柱，依次用水、乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，得总皂苷；
(10)总皂苷通过反相色谱纯化，重结晶，得到2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸。
更优选的，本发明方法步骤(1)中的粒度为60目。
更优选的，本发明方法步骤(2)中的乙醇体积浓度为70％。
更优选的，本发明方法步骤(2)用体积浓度70％乙醇浸泡0.5小时后，分两次提取，第一次用10倍量体积浓度70％乙醇提取1小时，第二次用8倍量的体积浓度70％乙醇提取0.5小时。
更优选的，本发明方法步骤(3)中滤液减压浓缩至无醇味，加水稀释至相当于0.25g生药/ml。
更优选的，本发明方法步骤(4)中的大孔吸附树脂为hpd450型大孔吸附树脂柱。
更优选的，本发明方法步骤(4)中依次用水、体积浓度40％乙醇、体积浓度70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分。
更优选的，本发明方法步骤(4)中依次用5柱体积水、3柱体积的体积浓度40％乙醇、3柱体积的体积浓度70％乙醇洗脱，洗脱流速1.5-2柱体积·h-1，收集70％乙醇洗脱部分，减压浓缩至65℃下密度为1.05-1.10，60℃以下减压干燥，得总皂苷。
更优选的，本发明方法步骤(4)中洗脱流速2柱体积·h-1。
更优选的，本发明方法步骤(4)减压浓缩至65℃下密度为1.05-1.10，60℃以下减压干燥。
更优选的，本发明方法步骤(5)反相色谱纯化条件为：上样量为1g中间体/40ml柱体积，乙醇体积浓度为5％-30％，1-5bv/h洗脱。
更优选的，本发明方法步骤(5)反相色谱纯化条件为：上样量为1g中间体/40ml柱体积，乙醇体积浓度为15％，3bv/h洗脱。
更优选的，本发明方法步骤(5)采用乙醇-水系统进行重结晶。
更优选的，本发明方法步骤(5)重结晶的条件为乙醇溶解反相色谱制备得到的化合物粗品至刚好饱和，再加入乙醇体积1/3的水，室温放置24h，过滤，得到2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸晶体。
本发明具有积极有益的效果：
本发明采用回流提取依次经大孔吸附树脂分离、反相色谱纯化、重结晶，得到毛花猕猴桃根抗肿瘤活性单体成分2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸，纯度可达95％以上，得率高，方法步骤简便，效率高，对环境污染小，制备成本低，适于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，乙醇浓度均为体积浓度。
实施例1毛花猕猴桃根总皂苷a1的制备
一种从毛花猕猴桃根中提取含2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸的总皂苷的方法，具体步骤如下：
(1)取毛花猕猴桃根，粉碎至粒度为60目；
(2)毛花猕猴桃根粉末用70％乙醇浸泡0.5小时后，分两次提取，第一次用10倍量70％乙醇提取1小时，第二次用8倍量的70％乙醇提取0.5小时；
(3)滤液经减压至无醇味，加水稀释至相当于0.25g生药/ml，离心；
(4)离心的滤液通过hpd450型大孔吸附树脂柱，依次用5柱体积水、3柱体积40％乙醇、3柱体积70％乙醇洗脱，洗脱流速为2柱体积·h-1，收集70％乙醇洗脱部分，减压浓缩至65℃下密度为1.05-1.10，60℃以下减压干燥，得总皂苷a1。
采用hplc法测定总皂苷a1中的2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸，计算得率为94.7％。
实施例2毛花猕猴桃根总皂苷a2的制备
一种从毛花猕猴桃根中提取含2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸的总皂苷的方法，具体步骤如下：
(1)取毛花猕猴桃根，粉碎至粒度为60目；
(2)毛花猕猴桃根粉末用70％乙醇浸泡0.5小时后，分两次提取，第一次用10倍量70％乙醇提取1小时，第二次用8倍量的70％乙醇提取0.5小时；
(3)滤液经减压至无醇味，加水稀释至相当于0.25g生药/ml，离心；
(4)离心的滤液通过hpd450型大孔吸附树脂柱，依次用5柱体积水、3柱体积20％乙醇、3柱体积50％乙醇洗脱，洗脱流速为2柱体积·h-1，收集50％乙醇洗脱部分，减压浓缩至65℃下密度为1.05-1.10，60℃以下减压干燥，得总皂苷a2。
采用hplc法测定总皂苷a2中的2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸，计算得率为85.7％。
实施例3毛花猕猴桃根总皂苷a3的制备
一种从毛花猕猴桃根中提取含2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸的总皂苷的方法，具体步骤如下：
(1)取毛花猕猴桃根，粉碎至粒度为60目；
(2)毛花猕猴桃根粉末用70％乙醇浸泡0.5小时后，分两次提取，第一次用10倍量70％乙醇提取1小时，第二次用8倍量的70％乙醇提取0.5小时；
(3)滤液经减压至无醇味，加水稀释至相当于0.25g生药/ml，离心；
(4)离心的滤液通过hpd450型大孔吸附树脂柱，依次用5柱体积水、3柱体积20％乙醇、3柱体积90％乙醇洗脱，洗脱流速为2柱体积·h-1，收集90％乙醇洗脱部分，减压浓缩至65℃下密度为1.05-1.10，60℃以下减压干燥，得总皂苷a3。
采用hplc法测定总皂苷a3中的2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸，计算得率为82.9％。
实施例4毛花猕猴桃根总皂苷a4的制备
一种从毛花猕猴桃根中提取含2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸的总皂苷的方法，具体步骤如下：
(1)取毛花猕猴桃根，粉碎至粒度为60目；
(2)毛花猕猴桃根粉末用70％乙醇浸泡0.5小时后，分两次提取，第一次用10倍量70％乙醇提取1小时，第二次用8倍量的70％乙醇提取0.5小时；
(3)滤液经减压至无醇味，加水稀释至相当于0.25g生药/ml，离心；
(4)离心的滤液通过hpd450型大孔吸附树脂柱，依次用5柱体积水、3柱体积20％乙醇、3柱体积70％乙醇洗脱，洗脱流速为2柱体积·h-1，收集70％乙醇洗脱部分，减压浓缩至65℃下密度为1.05-1.10，60℃以下减压干燥，得总皂苷a4。
采用hplc法测定总皂苷a4中的2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸，计算得率为81.3％。
实施例5毛花猕猴桃根总皂苷a5的制备
一种从毛花猕猴桃根中提取含2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸的总皂苷的方法，具体步骤如下：
(1)取毛花猕猴桃根，粉碎至粒度为60目；
(2)毛花猕猴桃根粉末用70％乙醇浸泡0.5小时后，分两次提取，第一次用10倍量70％乙醇提取1小时，第二次用8倍量的70％乙醇提取0.5小时；
(3)滤液经减压至无醇味，加水稀释至相当于0.25g生药/ml，离心；
(4)离心的滤液通过hpd450型大孔吸附树脂柱，依次用5柱体积水、3柱体积40％乙醇、3柱体积90％乙醇洗脱，洗脱流速为2柱体积·h-1，收集90％乙醇洗脱部分，减压浓缩至65℃下密度为1.05-1.10，60℃以下减压干燥，得总皂苷a5。
采用hplc法测定总皂苷a5中的2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸，计算得率为80.9％。
实施例6毛花猕猴桃根总皂苷a6的制备
一种从毛花猕猴桃根中提取含2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸的总皂苷的方法，具体步骤如下：
(1)取毛花猕猴桃根，粉碎至粒度为60目；
(2)毛花猕猴桃根粉末用70％乙醇浸泡0.5小时后，分两次提取，第一次用10倍量70％乙醇提取1小时，第二次用8倍量的70％乙醇提取0.5小时；
(3)滤液经减压至无醇味，加水稀释至相当于0.25g生药/ml，离心；
(4)离心的滤液通过hpd450型大孔吸附树脂柱，依次用5柱体积水、3柱体积40％乙醇、3柱体积50％乙醇洗脱，洗脱流速为2柱体积·h-1，收集50％乙醇洗脱部分，减压浓缩至65℃下密度为1.05-1.10，60℃以下减压干燥，得总皂苷a6。
采用hplc法测定总皂苷a6中的2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸，计算得率为79.8％。
通过上述实施例1-6的对比可以发现，当滤液用大孔吸附树脂柱洗脱时，先后用3柱体积40％乙醇和3柱体积70％乙醇依次洗脱后，所得总皂苷a1中2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸的含量最高。
实施例7毛花猕猴桃根总皂苷a1纯化方法p1
取实施例1方法制备得到的毛花猕猴桃根总皂苷a1，采用反相色谱纯化，色谱条件为：上样量为1g中间体/40ml柱体积，乙醇体积浓度15％，3bv/h洗脱。乙醇溶解反相色谱制备得到的2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸粗品至刚好饱和，再加入乙醇体积1/3的水，室温放置24h，过滤，得到2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸晶体。该步骤收率为87.4％，化合物纯度为96.8％。
实施例8毛花猕猴桃根总皂苷a1纯化方法p2
取实施例1方法制备得到的毛花猕猴桃根总皂苷a1，采用反相色谱纯化，色谱条件为：上样量为1g中间体/40ml柱体积，乙醇体积浓度30％，3bv/h洗脱。乙醇溶解反相色谱制备得到的2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸粗品至刚好饱和，再加入乙醇体积1/3的水，室温放置24h，过滤，得到2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸晶体。该步骤收率为71.9％，化合物纯度为95.6％。
实施例9毛花猕猴桃根总皂苷a1纯化方法p3
取实施例1方法制备得到的毛花猕猴桃根总皂苷a1，采用反相色谱纯化，色谱条件为：上样量为1g中间体/40ml柱体积，乙醇体积浓度10％，3bv/h洗脱。乙醇溶解反相色谱制备得到的2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸粗品至刚好饱和，再加入乙醇体积1/3的水，室温放置24h，过滤，得到2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸晶体。该步骤收率为68.1％，化合物纯度为95.0％。
实施例10毛花猕猴桃根总皂苷a1纯化方法p4
取实施例1方法制备得到的毛花猕猴桃根总皂苷a1，采用反相色谱纯化，色谱条件为：上样量为1g中间体/40ml柱体积，乙醇体积浓度15％，1bv/h洗脱。乙醇溶解反相色谱制备得到的2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸粗品至刚好饱和，再加入乙醇体积1/3的水，室温放置24h，过滤，得到2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸晶体。该步骤收率为70.8％，化合物纯度为95.3％。
实施例11毛花猕猴桃根总皂苷a1纯化方法p5
取实施例1方法制备得到的毛花猕猴桃根总皂苷a1，采用反相色谱纯化，色谱条件为：上样量为1g中间体/40ml柱体积，乙醇体积浓度15％，5bv/h洗脱。乙醇溶解反相色谱制备得到的2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸粗品至刚好饱和，再加入乙醇体积1/3的水，室温放置24h，过滤，得到2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸晶体。该步骤收率为75.3％，化合物纯度为94.8％。
通过实施例7-11的对比可以发现，反相色谱纯化条件选择的乙醇体积浓度为15％，采用流速3bv/h洗脱时，总皂苷纯化后获得2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸晶体的产率最高。