本发明涉及菌种发酵制备酶技术领域，特别是涉及一种壳聚糖酶的制备方法。
背景技术：
壳聚糖是由氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的碱性多糖，具有诸多优良特性，如增粘性、保湿性、生物相容性等，但由于壳聚糖溶解性差，限制了其应用范围。其水解产物壳寡糖，具有良好的溶解性，更易被生物机体吸收，在农业、食品、医疗、保健品、化妆品等多个领域均有很好的应用。
壳聚糖的降解工艺主要有化学降解法和酶解法。酶法降解壳聚糖，相对于目前常用的化学降解法，具有条件温和易控、功能性寡糖得率高、不易造成环境污染等优势。壳聚糖酶是一种专一性降解壳聚糖分子间β-1,4糖苷键的酶，广泛分布在细菌、真菌、放线菌等微生物中，但由于产酶量及酶活性普遍较低，导致酶法制备壳寡糖生产成本居高不下，因此难以满足壳寡糖生产的需要。
技术实现要素：
本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种壳聚糖酶的制备方法。本发明以蜡状芽孢杆菌116为出发菌株，该菌株能够诱导性分泌一种胞外壳聚糖酶，其培养条件经优化后，发酵上清液中壳聚糖酶酶活可达40-80u/ml。以此发酵液为粗酶液，确立了壳聚糖酶的分离纯化方法，包括冷冻离心，硫酸铵分级沉淀，阴离子交换层析，经浓缩、冷冻干燥后得到固态壳聚糖酶。该方法相对于常用的二次层析制备方法，具有简单易行，成本较低的优势。
本发明的一种壳聚糖酶的制备方法技术方案为，采用蜡状芽孢杆菌116发酵后进行分离纯化得到壳聚糖酶。
所述的蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)116，分类命名：蜡样芽孢杆菌116(bacilluscereus116)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号是：cctccno：m2017803，保藏日期是2017年12月18日。
所述的蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)116斜面培养基(w/v)：硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.2％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.1％，粉末壳聚糖1.0％，琼脂2.0％，ph6-7；
种子培养基(w/v)：蛋白胨0.5％，粉末壳聚糖0.5％，葡萄糖0.1％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.05％，ph6-7；
产酶培养基(w/v)：粉末壳聚糖1.5％，葡萄糖0.1％，硫酸铵2.0％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.05％，ph6-7。
发酵温度为30-32℃，发酵初始ph为6-7，发酵时间55-72h。
所述的分离纯化步骤包括冷冻离心，硫酸铵分级沉淀，阴离子交换层析，浓缩，干燥。
所述的冷冻离心具体为：将发酵液在4-8℃，5000-10000rpm离心5-20min，弃去沉淀，获得发酵上清液。
所述的硫酸铵分级沉淀具体为：向发酵上清液中缓慢加入硫酸铵，边加边搅拌，使溶液中硫酸铵饱和度达到35％，4℃静置过夜后6000rpm冷冻离心10min，去除杂蛋白；在上清液中继续加入硫酸铵，使其饱和度达到90％，4℃静置过夜后6000rpm冷冻离心10min，边加边搅拌，弃去上清，将沉淀重悬于ph7.5，50mmol/l的pbs缓冲液，把所得蛋白质溶液转移至透析袋中，在相同缓冲液中4℃透析24h(定时更换缓冲液)。
所述的阴离子交换层析具体为：将透析后的样品加入到已用pbs缓冲液平衡的deae-sepharosefastflow阴离子交换层析柱，先用3-5倍柱床体积的pbs缓冲液洗脱，再用含0-1mol/l氯化钠的pbs缓冲液进行线性梯度洗脱，收集洗脱液，经酶活力检测后收集有酶活组分。
将有酶活组分经浓缩、冷冻干燥后制得固态壳聚糖酶。
本发明的有益效果为：本发明采用蜡状芽孢杆菌116发酵后进行分离纯化得到壳聚糖酶，采用该菌株发酵生产的壳聚糖酶酶活力较高，培养条件经优化后，发酵液壳聚糖酶酶活可达40-80u/ml；该菌株以粉末壳聚糖作为产酶诱导物，较之常用的胶体壳聚糖具有操作简便、成本较低等优势；发酵液经简单的离心或过滤处理后，即可直接用于壳聚糖的酶解，因此该菌株在壳聚糖酶的工业化生产中具有极大的应用潜力；壳聚糖酶的分离纯化步骤简单易行，成本较低，主要包括冷冻离心，硫酸铵分级沉淀，deae-sepharosefastflow阴离子交换层析。
附图说明：
图1所示为本发明菌株蜡状芽孢杆菌116的菌落形态；
图2所示为本发明菌株显微形态(×1000)；
图3所示为本发明菌株蜡状芽孢杆菌116的系统发育进化树；
图4所示为碳源对菌株蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；
图5所示为氮源对菌株蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；
图6所示为温度对菌株蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；
图7所示为初始ph对菌株蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；
图8所示为发酵时间对菌株蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；
图9所示为装液量对菌株蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；
图10所示为接种量对菌株蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；
图11所示为壳聚糖酶液的deae-sepharosefastflow柱洗脱曲线，其中，■-蛋白质浓度；○-520nm吸光值；
图12所示为壳聚糖酶的sds-page图，其中，1-经离子交换层析纯化的酶液；2-经硫酸铵沉淀纯化的酶液；3-粗酶液；m-标准蛋白样品；
图13所示为ph对壳聚糖酶活力的影响；
图14所示为ph对壳聚糖酶稳定性的影响；
图15所示为温度对壳聚糖酶活力影响；
图16所示为温度对壳聚糖酶稳定性的影响；
图17所示为酶促反应米氏常数和最大反应速率的测定；
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
以下实施例中，离子交换树脂deaesepharosefastflow购自gehealthcare公司。壳聚糖(脱乙酰度90～95％)购自上海生工生物工程股份有限公司。蛋白质分子量标准品购自北京天根生化科技有限公司。实验所用试剂均为分析纯。
实施例1
所述的蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)116，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号是：cctccno：m2017803，保藏日期是2017年12月18日。
菌株116在斜面培养基上培养72h后，菌落呈灰白色、无光泽、不透明、边缘不规则、圆形或近圆形，菌落直径2～4mm左右(说明书附图图1)；菌株革兰氏染色呈阳性(说明书附图图2)，菌体为杆状，两端钝圆，产芽孢，芽孢着生在菌体中间或侧端。
菌株116生理生化实验结果如表1所示，菌株10％nacl生长实验、甘露醇、山梨醇利用实验、吲哚实验及h2s实验结果为阴性，其余均为阳性结果。
综合上述理化实验结果，并结合形态学观察，鉴定菌株116为芽孢杆菌属(bacillussp.)。
表1菌株116生理生化特征
菌株的分子生物学鉴定
菌株116经pcr扩增获得16srdna的部分序列，长度为1512bp，通过blast程序与genbank数据库中的序列比对，构建系统发育进化树，结果如说明书附图图3所示，菌株116与蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)的同源关系最近，结合形态学及生理生化实验结果，确定菌株116为蜡状芽孢杆菌。
实施例2
菌株培养
(1)斜面培养：取保存的蜡状芽孢杆菌116菌株接种于试管斜面培养基上，30-32℃培养2-3d；所述的斜面培养基(w/v)：硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.2％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.1％，粉末壳聚糖1.0％，琼脂2.0％，ph6-7；
(2)种子活化：取斜面保存的蜡状芽孢杆菌116菌株接种于种子培养基中，30-32℃，150rpm转速下培养24h，制得活化种子液；所述的种子培养基(w/v)：蛋白胨0.5％，粉末壳聚糖0.5％，葡萄糖0.1％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.05％，ph6-7；
(3)发酵产酶：将活化的种子液接入发酵产酶培养基中，30-32℃，150rpm转速下培养60-72h；所述的发酵产酶培养基(w/v)：粉末壳聚糖1.5％，葡萄糖0.1％，硫酸铵2.0％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.05％，ph6-7。壳聚糖酶活力的测定
取0.1ml适当稀释的酶液，加入1ml0.2mol/lph5.6醋酸-醋酸钠缓冲液，0.9ml1％胶体壳聚糖(0.2mol/l，ph5.6醋酸缓冲液)，于50℃保温15min后加入3,5-二硝基水杨酸(dns)1.5ml终止反应，沸水浴5min显色，冷却后定容至25ml，过滤后测定520nm波长处的吸光度，以等量煮沸灭活的酶液作为空白对照。每毫升酶液每分钟催化生成1μmol还原糖(以氨基葡萄糖计算)所需的酶量为1个酶活单位(u)。
实施例3
发酵产酶条件优化
所用的相对酶活力计算方法：每组中所测样品酶活力：每组中的最大样品酶活力×100％。
(1)碳源对菌株产酶的影响
碳源是构建微生物细胞以及合成各种代谢产物的原料，也是微生物获取能量的主要来源。分别以胶体壳聚糖、可溶性淀粉、葡聚糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖替代发酵产酶培养基中的粉末壳聚糖，考察碳源对发酵产酶的影响，结果如说明书附图图4所示，粉末壳聚糖最利于该菌株发酵产酶
(2)氮源对菌株产酶的影响
氮源作为构成菌体蛋白质、核酸以及其它氮素化合物的材料，对微生物生长发育和代谢具有重要意义。分别以硝酸铵、尿素、蛋白胨、硝酸钾替代产酶培养基中的硫酸铵，考察氮源对发酵产酶的影响。结果入说明书附图图5可以看出，以蛋白胨为氮源时壳聚糖酶活力最高，其次是硫酸铵和硝酸铵，相对酶活力分别达到99％和83％。综合考虑成本和产率两方面，本发明选用无机氮源硫酸铵作为发酵氮源。
(3)温度对菌株产酶的影响
设定菌株发酵温度分别为28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，测定发酵液的酶活力，考察温度对发酵产酶的影响。由说明书附图图6可以看出，32℃时该菌株发酵产酶活力最高，随着温度的升高或降低，酶活力均呈下降的趋势。
(4)初始ph对菌株产酶的影响
将产酶培养基初始ph分别调至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，对菌株进行发酵培养，测定发酵液的酶活力，考察初始ph对发酵产酶的影响。由说明书附图图7可以看出，初始ph对菌株发酵产酶影响显著，当初始ph调节为6.0，更适于该菌株产壳聚糖酶。
(5)发酵时间对菌株产酶的影响
将菌株接入产酶培养基中，分别以24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h作为菌株培养时间，测定发酵液酶活力，考察发酵时间对菌株产酶的影响。在不同发酵时间测定该菌株的产酶活性，结果说明书附图图8所示，菌株发酵24h即能检测到壳聚糖酶活力，随着发酵时间延长至72h，发酵液中酶活力达到最高，随后酶活力呈下降趋势。
(6)装液量对菌株产酶的影响
将500ml三角瓶的培养基装液量分别设为50ml、80ml、100ml、120ml、150ml、180ml，对菌株进行培养，考察装液量对发酵产酶的影响。结果如说明书附图图9所示，500ml三角瓶中装液量为120ml时，菌株产酶活力最高，随着装液量的增加或减少，酶活力都会受到影响。
(7)接种量对菌株产酶的影响
将种子液以不同接种量2％、4％、6％、8％、10％接入产酶培养基中，测定发酵液酶活力，考察接种量对发酵产酶的影响。接种量对菌株发酵产酶影响不大，如说明书附图图10所示，在接种量为4％时，相对酶活力最高，随着接种量的增加，相对酶活力随之下降，但趋势较缓，当接种量为10％时，相对酶活力仍保持在90％以上。
(8)正交实验设计
以最适碳源添加量、最适氮源添加量、温度、初始ph、发酵时间、装液量、接种量为因素，设计七因素三水平正交实验，确定最适发酵条件。综合单因素实验结果，以粉末壳聚糖添加量、硫酸铵添加量、初始ph、温度、发酵时间、装液量、接种量为因素，进行l18(37)正交实验，结果如表2所示，在实验的7个因素中，初始ph、发酵时间、硫酸铵添加量极差r值较大，其余因素极差r值较小，由此可见对产壳聚糖酶活力影响较大的3个因素依次为初始ph、发酵时间、硫酸铵添加量。由k值结果显示，该菌株最适产酶发酵条件为粉末壳聚糖添加量1.5％，硫酸铵添加量3％，初始ph6.0，温度32℃，发酵72h，500ml三角瓶中装液量120ml，接种量4％，在此最适产酶发酵条件下，蜡状芽孢杆菌116发酵液中壳聚糖酶酶活力可达43.89u/ml。
表2l18(37)正交实验结果分析
实施例4发酵罐培养蜡状芽孢杆菌116发酵产酶
种子活化后，采用优化后的培养基和培养条件，用16l罐发酵，控制发酵过程中ph6.0，培养温度32℃，、通风搅拌发酵55h，搅拌速度为180rpm，通风比为1:0.8，发酵上清液中壳聚糖酶活力为71.25u/ml，发酵液经过滤处理后，收集上清液，可直接用于壳聚糖的酶解。
实施例5
壳聚糖酶的分离纯化
1.硫酸铵分级沉淀
向粗酶液中缓慢加入硫酸铵，使溶液中硫酸铵饱和度达到35％，4℃静置过夜后6000r/min冷冻离心10min，去除沉淀。在上清液中继续加入硫酸铵，使其饱和度达到90％，4℃静置过夜后6000r/min冷冻离心10min，弃去上清，将沉淀重悬于pbs缓冲液(ph7.5，50mmol/l磷酸盐缓冲液)，把所得蛋白质溶液转移至透析袋中，在相同缓冲液中4℃透析24h(定时更换缓冲液)。
2.deae-sepharosefastflow离子交换层析
将透析后的样品加入到用pbs缓冲液预平衡的deae-sepharosefastflow离子交换层析柱(3×20cm)，先用3倍柱床体积的pbs缓冲液洗脱至od280不变，再用含0-1mol/l氯化钠的pbs缓冲液进行线性梯度洗脱，体积流量为1ml/min，每管收集6ml，经酶活力检测后收集有酶活组分。
3.sds-page检测壳聚糖酶纯度及分子量
采用不连续垂直板电泳系统，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，缓冲体系为ph8.3的tris-甘氨酸缓冲液。
结果如说明书附图图11所示，经检测，洗脱下来的蛋白峰中只有一个峰具有壳聚糖酶活力，将不同纯化步骤后的酶液及标准分子量蛋白样品进行sds-page检测，结果如说明书附图图12所示，经离子交换层析后，壳聚糖酶在sds-page下只显示一条蛋白质谱带，表明该酶已达到电泳纯，对应于标准蛋白样品分子量的迁移率，得出该酶分子量约为43.7kda。根据实验数据计算壳聚糖酶分步分离纯化结果，如表3所示，经纯化后，壳聚糖酶的纯化倍数为9.55倍，酶活回收率为57.88％。
表3壳聚糖酶分离纯化结果
实施例6
壳聚糖酶的酶学性质分析
1.ph对壳聚糖酶活性及酶的稳定性的影响
分别以不同ph缓冲液配制底物和稀释酶液，然后测其酶活力，考察ph对壳聚糖酶活力的影响；将壳聚糖酶置于不同ph缓冲液中，4℃保持30min，然后测其残余酶活力，考察ph对壳聚糖酶稳定性的影响。如说明书附图13、14所示。该酶最适ph为5.6，当ph高于5.6时，其活性迅速下降，ph为6.0时，相对酶活力已降至60％以下，壳聚糖酶在ph3.6～5.6范围内有较好的催化活力，4℃下维持30min，该酶相对酶活力仍能保持85％以上。
2.温度对壳聚糖酶活性及酶的稳定性的影响
将壳聚糖酶液置于不同温度下测其活力，考察温度对壳聚糖酶活力的影响；在不同温度下，将壳聚糖酶液保温1h，然后测其残余酶活力，考察温度对壳聚糖酶稳定性的影响。如说明书附图15、16所示，该酶最适反应温度为50℃，在40～55℃范围内，该酶仍能保持较好的酶活力，相对酶活力在85％以上；该酶在低于40℃时酶活力较为稳定，但当温度升至50℃时，温浴1h后酶活即完全丧失。
分离纯化的壳聚糖酶分子量为43.7kda，这与现有技术的芽孢杆菌属菌株所产壳聚糖酶的分子量25～45kda范围较为一致，但该酶的ph稳定范围在ph3.6-5.6，较其它壳聚糖酶更加耐酸，此外，当ph升为7.0时，相对酶活力仍能保持在70％以上，可见该酶与其它芽孢杆菌属所产壳聚糖酶相比，不仅对较低的ph环境有耐受能力，而且对ph的适应范围也相对较宽。
3.金属离子对壳聚糖酶活性的影响
在酶反应体系中分别加入不同金属离子，使其终浓度达到5mmol/l，4℃保持4h，然后测其酶活力，考察金属离子对壳聚糖酶活力的影响。
添加不同金属离子(5mmol/l)对壳聚糖酶酶活力的影响如表4所示，反应体系中mn2+对该酶有强烈的激活作用，酶活提高了1.12倍。mn2+可能参与到壳聚糖酶活性中心的构建，即通过结合酶活性中心以外的部位，增大酶与底物之间的亲和力，使酶活力得到增强。而金属离子cu2+、ni2+、fe3+、ag+对壳聚糖酶有不同程度的抑制作用，酶活分别降低了33％、29％、28％、35％。由于重金属离子的螯合作用，干扰了酶对底物的降解，从而导致酶活下降。因此，在以后对该酶的使用过程中，要严格注意反应体系中金属离子的存在状况。
表4金属离子对壳聚糖酶活力的影响
4.壳聚糖酶的底物特异性
分别以胶体壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素、甲壳素为底物，考察不同底物对壳聚糖酶活力的影响。
在酶反应体系中分别以1％胶体壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素和甲壳素作为底物，以考察菌株116所产壳聚糖酶对不同底物的降解特性。结果如表5所示，该酶只对胶体壳聚糖具有降解活性，对葡聚糖、羧甲基纤维素和甲壳素均没有降解作用。
表5壳聚糖酶的底物特异性
5.壳聚糖酶动力学参数的测定
在壳聚糖酶活力测定体系中，改变底物胶体壳聚糖溶液浓度，以底物浓度的倒数为横坐标(1/[s])，反应速度的倒数为纵坐标(1/v)，按照lineweaver-burk法作图，求得米氏常数(km)和最大反应速率(vmax)。
采用双倒数作图法(lineweaver-burk)对该酶动力学参数进行测定，结果如说明书附图17所示，经线性拟合后，求得该酶的米氏常数(km)为11.10mg/ml，最大反应速率(vmax)为1.38μmol/min·ml。