本发明涉及基因检测
技术领域：
，具体来说，涉及用于检测与皮肤衰老相关易感基因snp的成套引物及其应用。
背景技术：
：中国医师协会皮肤科医师分会开展了“国人皮肤状况大型网络调查”，近4万名网名在参与调查，其中45.45％为男性，54.55％为女性。29～39岁年龄段人数最多，占39.45％，结果表明约70％的人存在皮肤亚健康，仅有14％的人皮肤状况良好。25岁以上人体皮肤开始走入自然衰老的进程，皮肤的老化主要集中在三个方面：质地、色泽、细腻程度，具体在面部，皮肤老化可表现为皮肤松弛、缺乏弹性、皱纹、色泽暗淡、毛孔粗大、毛细血管孔张、各种色素斑点等。皮肤老化可有多种复杂的原因造成，大体概括为两大类就是内因和外因。外原性因素所造成的皮肤生理和功能性的改变如：长期紫外线辐射、恶劣的气候和环境、不良生活习惯和过度工作压力等。内部因素就是遗传因素。通过基因检测能够了解个体对各种皮肤问题的先天易感性，从而为有针对性的预防和护肤品或护肤方案的选择提供科学的参考依据。导致皮肤衰老的几个重要的问题与遗传基因有密不可分的关系，如：光老化是皮肤外在老化的最主要形式，紫外线辐射则是导致皮肤光老化的主要原因，黑色素的形成与酪氨酸酶的活性有关；水合作用决定了人类皮肤分子能否吸水保湿，存在基因缺陷的个体，控制水合作用的基因活性降低，皮肤保湿功能开始下降，储水能力逐渐变差，导致皱纹和衰老的出现；丝状的胶原蛋白纤维能使皮肤保持结实而有弹性的状态，当肌肤开始衰老时，负责降解胶原蛋白的基因过度活跃，过度降解胶原蛋白，导致支撑皮肤的胶原网状结构被打破，出现松弛和皱纹；人类的衰老和疾病都与自由基的形成有关，人体本身存在抗氧化机制对抗自由基，抗氧化主要由一些酶来进行，当这些酶的功能发生变异时，氧化-抗氧化平衡被打破，人体倾向更容易衰老；糖基化作用于胶原蛋白和弹性蛋白，导致皮肤出现皱纹，弹性下降，缺水，糖基化产物age的堆积导致皮肤出现色斑，所以个体对抗糖化的能力是延缓衰老的关键，且糖基化作用不仅与皮肤衰老有关系，他和很多疾病如糖尿病并发症、阿兹海默综合征都有密切关系。皮肤的衰老与特定人类基因的单核苷酸多态性有关，这一点已经得到确认。过去已经发展出多种检测基因多态性的方法，用来预测皮肤抵抗衰老的能力。其中比较全面的就是美白及老化基因芯片(201320009798.7)，涵盖了7个与美白相关的基因单核苷酸多态性位点，7个与皮肤氧化作用相关的基因单核苷酸多态性位点，将14个位点集成在一张芯片上进行检测。该专利采用的基因芯片法比较繁琐，只试用在研发阶段，无法实现大规模的商业转化。英国专利(gb20110021917)检测了与美容产品成分生物学途径相关的靶基因snp位点，进而判断该产品是否适用于使用者，该专利设计的snp位点有4个，主要与胶原蛋白降解，抗氧化作用相关的基因。发明专利(201610367682.9)公开了一种检测皮肤锁水情况的引物和探针，使用的方法的是荧光定量pcr的方法，检测的基因单核苷酸多态性位点是两个，检测基因不全面，且荧光定量pcr法适于检测5个左右的已知snp位点，位点增加时，操作复杂，耗时长。技术实现要素：针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出用于检测与皮肤衰老相关易感基因snp的成套引物及其应用，使用maldi-tofms法，能够在同一个反应内同一时间完成29个snp分型，提高检测效率并降低成本；利用生物技术中基因检测手段对皮肤光老化、抗氧化、锁水能力、糖基化作用、皱纹和胶原蛋白降解相关易感基因单核苷酸多态性位点进行检测，使用飞行时间质谱方法进行snp分型，用以预测皮肤先天的抗衰老能力，从而为外部护肤方案提供科学依据。为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：用于检测与皮肤衰老相关易感基因snp的成套引物包括人基因组dna的22个皮肤衰老相关易感基因的29个snp位点的pcr扩增引物对和单碱基延伸引物。进一步的，所述的人基因组dna的22个皮肤衰老相关易感基因为bnc2、asip、stxbp5l、ifr4、mmp1、ager、glo1、slc45a2、kitlg、tyr、dct、mc1r、oca2、sod2、cat、gpx1、nqo1、nfe2l2、gstp1、aqp、has1、flg。进一步的，所述的snp位点为：rs10733310、rs62543565、rs1015362、rs4911414、rs322458、rs1540771、rs1799750、rs2070600、rs2071288、rs1130534、rs16891982、rs1834640、rs642742、rs1042602、rs2031526、rs885479、rs74653330、rs1800414、rs4880、rs1001179、rs1050450、rs1800566、rs35652124、rs1695、rs17553719、rs11084109、rs11084111、rs761789405、rs200519781。进一步的，所述的用于检测与皮肤衰老相关易感基因snp的成套引物包括：rs10733310位点的pcr扩增引物序列seqidno1和seqidno2，单碱基延伸引物序列seqidno59；rs62543565位点的pcr扩增引物序列seqidno3和seqidno4，单碱基延伸引物序列seqidno60；rs1015362位点的pcr扩增引物序列seqidno5和seqidno6，单碱基延伸引物序列seqidno61；rs4911414位点的pcr扩增引物序列seqidno7和seqidno8，单碱基延伸引物序列seqidno62；rs322458位点的pcr扩增引物序列seqidno9和seqidno10，单碱基延伸引物序列seqidno63；rs1540771位点的pcr扩增引物序列seqidno11和seqidno12，单碱基延伸引物序列seqidno64；rs1799750位点的pcr扩增引物序列seqidno13和seqidno14，单碱基延伸引物序列seqidno65；rs2070600位点的pcr扩增引物序列seqidno15和seqidno16，单碱基延伸引物序列seqidno66；rs2071288位点的pcr扩增引物序列seqidno17和seqidno18，单碱基延伸引物序列seqidno67；rs1130534位点的pcr扩增引物序列seqidno19和seqidno20，单碱基延伸引物序列seqidno68；rs16891982位点的pcr扩增引物序列seqidno21和seqidno22，单碱基延伸引物序列seqidno69；rs1834640位点的pcr扩增引物序列seqidno23和seqidno24，单碱基延伸引物序列seqidno70；rs642742位点的pcr扩增引物序列seqidno25和seqidno26，单碱基延伸引物序列seqidno71；rs1042602位点的pcr扩增引物序列seqidno27和seqidno28，单碱基延伸引物序列seqidno72；rs2031526位点的pcr扩增引物序列seqidno29和seqidno30，单碱基延伸引物序列seqidno73；rs885479位点的pcr扩增引物序列seqidno31和seqidno32，单碱基延伸引物序列seqidno74；rs74653330位点的pcr扩增引物序列seqidno33和seqidno34，单碱基延伸引物序列seqidno75；rs1800414位点的pcr扩增引物序列seqidno35和seqidno36，单碱基延伸引物序列seqidno76；rs4880位点的pcr扩增引物序列seqidno37和seqidno38，单碱基延伸引物序列seqidno77；rs1001179位点的pcr扩增引物序列seqidno39和seqidno40，单碱基延伸引物序列seqidno78；rs1050450位点的pcr扩增引物序列seqidno41和seqidno42，单碱基延伸引物序列seqidno79；rs1800566位点的pcr扩增引物序列seqidno43和seqidno44，单碱基延伸引物序列seqidno80；rs35652124位点的pcr扩增引物序列seqidno45和seqidno46，单碱基延伸引物序列seqidno81；rs1695位点的pcr扩增引物序列seqidno47和seqidno48，单碱基延伸引物序列seqidno82；rs17553719位点的pcr扩增引物序列seqidno49和seqidno50，单碱基延伸引物序列seqidno83；rs11084109位点的pcr扩增引物序列seqidno51和seqidno52，单碱基延伸引物序列seqidno84；rs11084111位点的pcr扩增引物序列seqidno53和seqidno54，单碱基延伸引物序列seqidno85；rs761789405位点的pcr扩增引物序列seqidno55和seqidno56，单碱基延伸引物序列为seqidno86；rs200519781位点的pcr扩增引物序列seqidno57和seqidno58，单碱基延伸引物序列seqidno87。一种基因检测试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-4任一项所述的用于检测与皮肤衰老相关易感基因snp的成套引物。进一步的，所述的皮肤衰老相关易感基因包括bnc2、asip、stxbp5l、ifr4、mmp1、ager、glo1、slc45a2、kitlg、tyr、dct、mc1r、oca2、sod2、cat、gpx1、nqo1、nfe2l2、gstp1、aqp、has1、flg。进一步的，所述的皮肤衰老相关易感基因snp位点包括rs10733310、rs62543565、rs1015362、rs4911414、rs322458、rs1540771、rs1799750、rs2070600、rs2071288、rs1130534、rs16891982、rs1834640、rs642742、rs1042602、rs2031526、rs885479、rs74653330、rs1800414、rs4880、rs1001179、rs1050450、rs1800566、rs35652124、rs1695、rs17553719、rs11084109、rs11084111、rs761789405、rs200519781。进一步的，所述的成套引物由权利要求7中每个snp位点的扩增引物对和单碱基延伸引物组成。进一步的，所述的试剂盒基因检测结果显示涵盖皮肤老化、皱纹和胶原蛋白降解、抗氧化、糖基化、锁水能力相关的基因。进一步的，所述的试剂盒基因检测以人基因组dna为样本，将成套引物经多重pcr扩增后采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法检测样本snp位点分型，所述的成套引物多重pcr扩增产物的基因检测结果显示样本皮肤抗衰老能力。更进一步的，通过对人皮肤衰老相关易感基因进行检测，预测皮肤先天的抗衰老能力，从而为外部护肤方案提供科学依据。本发明的有益效果：1.通过对光老化、皱纹和胶原蛋白降解、抗氧化、糖基化、锁水能力相关的基因进行检测，指导美容和护肤。2.将与皮肤衰老相关的基因联合检测，一次检测出所有的项目，是目前为止最全面的皮肤基因检测项目。3.通过特异引物的设计，所有的位点放在同一个反应中，通过多重pcr进行扩增，使用飞行时间质谱检测，一次同时检测29个位点，减少操作复杂程度，降低成本，节约时间。具体实施方式为了方便理解本发明的上述技术方案，以下通过具体实施方式对本发明的上述技术方案进行详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1技术方案的确立s1根据人体皮肤衰老与遗传基因的关系，确定皮肤衰老相关易感基因及snp位点(表1)。s2每个snp位点分别设计一套引物，包括扩增引物对(表2)和一条单碱基延伸引物(表3)。s3以人基因组dna为样本，将成套引物经多重pcr扩增。s4采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法检测样本snp位点分型，预测样本的皮肤抗衰老能力。表1皮肤衰老相关易感基因及snp位点表2多重pcr扩增引物序列表3单碱基延伸引物序列位点序列号延伸引物序列rs1073331059agccctcaggatgatrs6254356560ggaacgtgggaggcgrs101536261aggagatgaaaacatctcars491141462ggctgagaaattcattrs32245863ccacctttctgagcttrs154077164actgcacgagttggrs179975065tttgagataagtcatatcrs207060066gaaggaagagggagcrs207128867ccacagagcctgtars113053468aacaggcaaacttaccgaars1689198269ttgggatgttggggcttrs183464070acctcagaaaccacrs64274271taatggaaaaactgaars104260272caatgtctctccagatttcars203152673tttgagggtaggaars88547974atggccgcaacggctrs7465333075gcccgatggcagtggrs180041476cccgtcagatatcctars488077ggcccagataccccaaars100117978ctgggttcggctatrs105045079ccctgctgtctcaagggcrs180056680tgtggcttccaagtcttagaars3565212481aagtgggagttcagaggrs169582acctccgctgcaaatacrs1755371983ggcaggggtggcgggaggcggrs1108410984tcgtcatccatatcrs1108411185ttgttaaggatccgcacrs76178940586tcatgccttttccccccrs20051978187tccagaccttccccc实施例2样本提取及分析为验证本发明的用于检测与皮肤衰老相关易感基因snp的成套引物的检测准确度及有效性，选4个样本进行基因检测，过程如下：a.唾液dna提取：利用康为世纪口腔拭子基因组dna提取试剂盒进行唾液dna提取。在gw1和gw2试剂中加入一定量的无水乙醇。从采样管中取500μl唾液样本，加入300μlgr、20μlproteinasek和300μlgl，震荡混匀，56℃震荡孵育15min，加入300μl无水乙醇，震荡混匀；将750μl该溶液加入到收集管的吸附柱中，12000rpm离心1min，弃液；向吸附柱中加入400μlgw1，12000rpm离心1min，弃液；向吸附柱中加入400μlgw2，12000rpm离心1min，弃液；12000rpm离心2min，静置晾干；将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，悬空加入40μlge，静置5min，12000rpm离心1min，收集dna溶液，质检，4℃保存。b.pcr扩增：将步骤a提取的待测样本的dna分别加入到384孔板中，进行多重pcr扩增。按照多重pcr扩增的反应体系(5μl)加入到每个反应孔中，反应体系：模板dna1μl，引物mix5μl，10×buffer0.5μl，mgcl2(25mm)0.8μl，dntp(25mm)0.2μl，ddh2o2μl，hotstar(5u/μl)补足至5μl。反应体系配制好后使用pcr封口膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于abi9700pcr仪上反应，反应条件：95℃预变性2min(95℃30s，56℃30s，72℃1min)45个循环；72℃5min，4℃保持；得到pcr扩增产物，离心备用。c.sap消化：利用sequenom平台配套试剂和操作步骤，完成待测样本snp位点分型结果。将步骤b中得到的pcr扩增产物，按照sap消化的反应体系(2μl)加入到每个反应孔中，反应体系：sap×buffer0.17μl，sapenzyme(1u/μl)0.6μl，ddh2o1.53μl。反应体系配制好后使用pcr封口膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于abi9700pcr仪上反应，反应条件：37℃40min，85℃5min，4℃保持；得到碱性磷酸化酶处理后的pcr产物，离心备用。d.单碱基延伸反应：利用sequenom平台配套试剂和操作步骤，完成待测样本snp位点分型结果。将步骤c中得到的碱性磷酸化酶处理后的pcr产物，按照单碱基延伸反应体系(2μl)加入到对应的每个反应孔中，反应体系：延伸引物mix0.94μl，gold×buffer0.2μl，extensionmix0.2μl，iplexenzyme0.041μl，ddh2o0.619μl。反应体系配制好后使用pcr封口膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于abi9700pcr仪上反应，反应条件：94℃30s，{94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个内部循环}40个外部循环，72℃3min，4℃保持；得到单碱基延伸产物，离心备用。e.树脂纯化：利用sequenom平台配套试剂和操作步骤，完成待测样本snp位点分型结果。将步骤d的单碱基延伸产物的384孔板，轻轻撕下封口膜后，每孔加入16μlddh2o；取干净的a4纸将6mg384板置于其上，用小勺取适量纯化树脂；用塑料板反复左右推平纯化树脂，压实，使每孔树脂含量均匀；将384板倒置压在6mg384板上，两板对调，6mg板在上，敲打6mg板背面，使树脂落入装有单碱基延伸产物的384孔板中；封口膜封好后，15rpm上下颠倒混匀30min，充分纯化。f.芯片点样：将步骤e中的384孔板离心，启动massarraynanodispenserrs1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔spectrochip芯片上；点样后的芯片使用maldi-tof分析，检测结果使用typer4.0软件分型并输出结果。实施例3基因检测结果分析对实施例2中的4个样本的29个snp位点基因检测结果(表5)进行分析，结合皮肤衰老相关易感基因snp位点分型意义解读(表6)，对受检样本的皮肤抗衰老能力进行分析。表5snp位点基因检测结果位点样本1样本2样本3样本4rs10733310gtgtgtgrs62543565ccccrs1015362ctcctcrs4911414gtggtgrs322458ctcccrs1540771ccccrs1799750ccccrs2070600ccccrs2071288ccccrs1130534ttttrs16891982ccccrs1834640ggggrs642742tccctcrs1042602ccccrs2031526agaggagrs885479gagaggrs74653330ccccrs1800414cctctctrs4880aaaars1001179ccccrs1050450ggggrs1800566gagagaagrs35652124tttcctctrs1695aaagars17553719cctctctrs11084109ttttrs11084111agaagagrs761789405tdel.tttrs200519781tttt由表5可见，29个位点的基因型均能正确检出，检出率100％，基因型分布符合中国汉族人基因型分布频率。表6皮肤衰老相关易感基因snp位点分型意义解读本发明设计的扩增引物和延伸引物能在同一个反应内检测出29个snp位点，用于开发皮肤衰老易感基因检测试剂盒并指导合理护肤。在皮肤护理方面，本发明的基因检测可了解人类机体的皮肤抗衰老能力，为合理护肤提供科学的参考依据。本发明将与皮肤衰老相关的基因联合检测，一次检测出所有的项目，是目前为止皮肤基因检测产品中检测基因覆盖面最全面的。实施例4基因检测结果解读结合表5及表6可对受检样本的皮肤抗衰老能力进行分析，以样本1为例进行检测结果解读，见下表(表7)：表7样本1基因检测结果解读由表7可知，样本1的皮肤不易产生晒斑，但一定程度上易出现皱纹，且黑色素合成能力、抗氧化能力及皮肤锁水能力均较差，其皮肤抗衰老能力较差，需要补充营养及水分。本发明的基因检测方法适用于中国汉族人基因型检测及其皮肤抗衰老能力的预测。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>北京天平永达科技发展有限公司<120>用于检测与皮肤衰老相关易感基因snp的成套引物及其应用<130>2018.02<160>87<170>patentinversion3.3<210>1<211>30<212>dna<213>artificial<223>rs10733310上游引物<400>1acgttggatgccaatgctaacttagccctc30<210>2<211>30<212>dna<213>artificial<223>rs10733310下游引物<400>2acgttggatggaactttgggcaagagagtg30<210>3<211>30<212>dna<213>artificial<223>rs62543565上游引物<400>3acgttggatgaggagaatggcgtgaacgtg30<210>4<211>30<212>dna<213>artificial<223>rs62543565下游引物<400>4acgttggatgagacagatctcgctctgtcg30<210>5<211>30<212>dna<213>artificial<223>rs1015362上游引物<400>5acgttggatgctgaacaaatagtcccgacc30<210>6<211>30<212>dna<213>artificial<223>rs1015362下游引物<400>6acgttggatgccttaagtgtgtactgtgtg30<210>7<211>30<212>dna<213>artificial<223>rs4911414上游引物<400>7acgttggatgccccagtctctttttgtttg30<210>8<211>30<212>dna<213>artificial<223>rs4911414下游引物<400>8acgttggatgggcaactagagaaaagcatc30<210>9<211>30<212>dna<213>artificial<223>rs322458上游引物<400>9acgttggatggctgtgtgaccttagataaa30<210>10<211>31<212>dna<213>artificial<223>rs322458下游引物<400>10acgttggatgcctcacagtaaaaggtatgtc31<210>11<211>30<212>dna<213>artificial<223>rs1540771上游引物<400>11acgttggatgatggtagaagagagaggagg30<210>12<211>30<212>dna<213>artificial<223>rs1540771下游引物<400>12acgttggatgaccacacacgtgatagactg30<210>13<211>30<212>dna<213>artificial<223>rs1799750上游引物<400>13acgttggatgcttcagtatatcttggattg30<210>14<211>30<212>dna<213>artificial<223>rs1799750下游引物<400>14acgttggatggttatgccacttagatgagg30<210>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