本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种构建ffpe样本dna文库的方法。
背景技术:
福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixedandparaffin-embedded,ffpe)处理方法能够较长时间地保存组织或制备检验所需的组织标本,所以在临床病理检验、肿瘤基因检测和医学科学研究过程中常被用到,是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在世界范围内,大约有数十亿份组织样品保存在医院或者组织样品库中。其中绝大多数是使用福尔马林固定石蜡包埋的方法处理的样品。ffpe样本通常代表了珍贵且来源广泛的生物医学研究材料,数量巨大的归档ffpe样本为回顾性研究、阐明疾病机制、发现治疗靶标和指示预后等方面提供了宝贵的资源。
然而,ffpe样本特殊的制作方法和保存过程都对样本中的核酸造成多方面的影响。组织医学样本在离体后即开始发生降解,福尔马林的固定使组织中的核酸与核酸或核酸与蛋白之间交联,石蜡的渗入过程进一步加速核酸的降解,保存时间及环境对样品中的核酸也有极大的影响,上述这些原因最终导致通过样本获得的核酸质量大幅下降。
随着二代测序技术的发展,大大地提高了样本测序速度,降低了测序成本,使得应用二代测序方法对ffpe样本dna进行测序成为可能。近年来,利用二代测序方法对ffpe样本dna进行测序的应用前景广阔,越来越多地应用于二代测序的ffpe样本dna的建库方法应运而生。常用的ffpe样本建库方法如illumina公司的ffpe样本建库方法,其主要步骤为:(1)对打断后的样本进行末端修复,使用1.8×磁珠纯化,得到平末端dna片段;(2)对平末端dna片段进行加a,使用1.8×磁珠纯化,得到加a产物;(3)对加a产物进行加接头,使用1.8×磁珠纯化,得到加接头产物;(4)对加接头产物进行pcr,使用0.9×磁珠纯化,得到文库。
在降解严重的ffpe样品中dna通常完整性很差,存在很多的小片段,采用现有建库方法获得的文库通常均一性差(dna片段大小差异导致),文库产量低,不能达到后续研究的需求量。现有的建库方法可用于对普通ffpe样本进行建库,对于降解严重的低质量ffpe样本dna建库则无法获得足够后续研究的文库产量。石蜡包埋的医疗样本通常总量都很有限,每个样本都因其不可替代性而十分珍贵,所以如何通过低质量的ffpe样本获得的dna建立合格的文库已成为测序研究领域亟待解决的问题。
技术实现要素:
鉴于上述现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种构建ffpe样本dna文库的方法,对ffpe样本dna进行末端修复、纯化;加a,加接头、纯化以及pcr扩增,纯化。其中,加接头反应后结束后,使用0.9×磁珠纯化。通过上述优化的方法,能够使低质量ffpe样本dna获得的足够后续测序研究的文库产量,保证文库的产出。
即,本发明包括:
1.一种构建ffpe样本dna文库的方法,其包括:
步骤a:提取ffpe样本的dna,得到样本基因组dna片段;
步骤b:将样本基因组dna片段进行末端修复,纯化得到平末端dna片段;
步骤c:将平末端dna片段进行3'端加a,得到3'端加a的dna片段;
步骤d:将加3'端加a的dna片段进行加接头,纯化得到加接头dna片段;
步骤e:将加接头的dna片段进行pcr扩增,纯化得到dna片段文库,
其中,步骤d中的纯化采用0.9×磁珠纯化。
2.根据项1所述的方法,其中,步骤b中的纯化采用1.8×磁珠纯化,步骤e中的纯化采用0.9×磁珠纯化。
3.根据项1所述的方法,所述ffpe样本为低质量ffpe样本。
4.根据项1所述的方法,其中,所述步骤a中样本dna片段的量为1μg。
5.根据项4所述的方法,其中,所述步骤c反应中加a采用klenow片段(3'-5'exo-),所述klenow片段的使用量为1~2μl,优选地使用量为1.5~2μl。
6.根据项4所述的方法,其中,所述步骤d中加接头使用t4dna连接酶,所述t4dna连接酶的使用量为6~7.5μl、优选地使用量为6.5~7μl,所述接头使用量为40~100pmol,优选地接头使用量为40~80pmol。
7.一种建库用试剂盒,其中,所述试剂盒包括:用于末端修复的试剂、用于加a的试剂、用于加接头的试剂、用于pcr扩增的试剂和用于纯化的试剂。
8.一种测序用dna文库,其是通过项1~6中任一项所述的方法构建的。
9.一种dna文库的测序方法,其采用权利要求8所述的文库为对象进行测序。
本发明的有益效果:本发明通过优化ffpe样本dna文库构建方法,提供了一种适用于低质量ffpe样本dna建库的方法,保证了建库文库的产出,为后续研究提供保障,使低质量ffpe样本dna的研究成为可能。
具体实施方式
以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
一方面,本发明公开了一种构建ffpe样本dna文库的方法(本发明的方法),包括:
步骤a:提取ffpe样本的dna,得到样本基因组dna片段;
步骤b:将样本基因组dna片段进行末端修复,纯化得到平末端dna片段;
步骤c:将平末端dna片段进行3'端加a,得到3'端加a的dna片段;
步骤d:将加3'端加a的dna片段进行加接头,纯化得到加接头dna片段;
步骤e:将加接头的dna片段进行pcr扩增,纯化得到dna片段文库,
其中,步骤d中的纯化采用0.9×磁珠纯化。
所述ffpe样本包括常规的ffpe样本和低质量的ffpe样本。在本发明中,低质量是指ffpe样本中的dna发生严重降解,完整性遭到破坏以及严重片段化的情况。发明人发现在低质量的ffpe样本中,dna片段大小分布不均一,会存在很多的小片段(小于100bp),发明人发现这些小片段是影响文库产出的关键。通过本发明对建库步骤的优化,可以明显提高文库的产量。
对提取ffpe样本的dna片段的具体方法没有特殊限制,可以采用本领域技术人员通常采用的方法,例如,ambion公司的全回收总核酸分离试剂盒(recoveralltotalnucleicacidisolationkit)、qiagen公司的
步骤b中样本dna片段的量为500ng~1μg,优选地,希望进行建库的样本dna片段的量为1μg。
步骤c中3'端加a的反应试剂包括:datp(1mm)、klenow片段(3'-5'exo-)、缓冲液、及平末端dna片段。其中,klenow片段(3'-5'exo-)的使用量为1~2μl。优选的klenow片段(3'-5'exo-)的使用量为1.5~2μl。
步骤d中加接头的反应试剂包括:缓冲液、t4dna连接酶、接头、以及3'端加a的dna片段,其中,t4dna连接酶的使用量为6~7.5μl,接头的使用量40~100pmol,优选地,t4dna连接酶的使用量为6.5~7μl,接头的使用量为40~80pmol。在这里,对接头(adapter)没有特殊限制,只要是能用于二代测序建库过程中的pcr扩增步骤的接头都可以用于实现本发明。
步骤e可以采用任何使用本领域技术人员已知的pcr方法和纯化方法进行。
再一方面,本发明提供一种建库用试剂盒,包括:用于末端修复的试剂、用于加a的试剂、用于加接头的试剂、用于pcr扩增的试剂、以及用于纯化的试剂,其中,
用于末端修复的试剂主要包括:klenow片段、t4多聚核苷酸激酶、t4dna聚合酶。
用于加a的试剂主要包括:datp、klenow片段(3'-5'exo-)。
用于加接头的试剂包主要括:t4dna连接酶、接头。
用于pcr扩增的试剂主要包括:扩增引物、dna聚合酶。
用于纯化的试剂主要包括:1.8×磁珠、0.9×磁珠、eb溶液。
本发明的测序用dna文库可以采用例如本发明的构建ffpe样本dna文库的方法来构建。
最后,本发明提供一种测序方法(本发明的测序方法),其中,以本发明的测序用dna文库作为对象进行测序。
除了以本发明的测序用dna文库作为对象之外,本发明的测序方法可以采用本技术领域的常规方法来进行。优选地,本发明的测序方法可以采用双端测序,例如利用illumina平台(例如hiseq2500或nextseq500)进行的测序。
实施例1
1.ffpe样本dna提取
取三份不同的均保存三年的癌组织ffpe样本(命名为:样本1、样本2、样本3),使用genereaddnaffpekit试剂盒(qiagen公司)提供的方法及试剂提取dna,获得了ffpe样本基因组dna。
2.ffpe样本基因组dna打断
使用biorupter打断仪器进行打断,设定打断条件30个循环,30son/30soff,将ffpe样本dna打断成的片段,得到打断后的dna片段。
3.末端修复
配制末端修复混合物:预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂,将其置于冰上化冻并充分混匀,单个样本配制量参见表1。
表1末端修复反应体系
末端修复反应:将反应体系置于thermomixer中20℃温浴30分钟。反应结束后使用1.8×磁珠回收纯化反应体系中的dna,20μleb溶解。
4.3'端加“a”(a-tailing)
配制3'端加“a”混合液:预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂,将其置于冰上化冻并充分混匀,单个样本配制量参见表2。
表2末端加“a”反应体系
3'端加“a”反应:将样本置于thermomixer中37℃温浴30分钟。
5.adapter的连接
配制adapter(接头)的连接混合物:预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂,将其置于冰上化冻并充分混匀。单个样本配制量参见表3。
表3adapter的连接反应体系
adapter的连接反应:将样本置于thermomixer中20℃温浴15分钟。使用0.9×磁珠回收纯化反应体系中的dna,溶于30μleb溶液中。
6.pcr反应
使用hifidnapolymerasemix试剂盒进行pcr扩增,单个样本配制量参见表4。
表4pcr反应体系
annindex-41序列(seqidno:1):
5'-caagcagaagacggcatacgagatgttgcaacgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3';
annindex-42序列(seqidno:2):
5'-caagcagaagacggcatacgagatctcaattagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3';
annindex-43序列(seqidno:3):
5'-caagcagaagacggcatacgagatcaagtctagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3';
ann公共引物(seqidno:4):
5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3'
pcr反应条件如下:
0.9×磁珠回收纯化反应体系中的pcr产物,溶于30μleb溶液中。
7.文库定量
对文库进行2100bioanalyzer(agilent)/labchipgx(caliper)检测,检测文库产量,结果如表5所示,样本1、样本2和样本3通过本实施例的方法获得的文库产量分别为0.345μg、0.374μg和0.397μg。
对比例1
使用实施例1中的三个样本(分别命名为:对照1、对照2、对照3)使用现有的ffpe建库方法进行文库构建,得到的文库产量如表5所示。
表5的结果显示,实施例1的方法中样本1的文库产量为0.345μg,使用对比例1的方法获得的对照1(样本1)的文库产量为0.197μg;实施例1的样本2的文库产量为0.374μg,使用对比例1的方法获得对照2(样本2)的文库产量为0.234μg;实施例1的样本3文库产量为0.379μg,使用对比例1的方法获得的对照3(样本3)的文库产量为0.245μg。综上可知,通过本发明的方法获得的文库在文库产量上有明显增加。本发明提供的ffpe样本dna的文库构建方法,即使在ffpe样本是低质量的情况下,能得到足够后续测序研究的产量的文库(例如,捕获测序需要的最低文库量为250μg)。
表5文库产出情况
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例,如前所述,应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施例的排除,而可用于各种其他组合、修改和环境,并能够在本文所述发明构想范围内,通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围,则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110>安诺优达基因科技(北京)有限公司
<120>一种构建ffpe样本dna文库的方法
<130>1605-3tgcn
<160>4
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>66
<212>dna
<213>人工序列
<400>annindex-41序列
caagcagaagacggcatacgagatgttgcaacgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct66
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>annindex-42序列
caagcagaagacggcatacgagatctcaattagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct66
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<211>66
<212>dna
<213>人工序列
<400>annindex-43序列
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<212>dna
<213>人工序列
<400>ann公共引物
aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58