本发明涉及窖泥检测方法，具体是一种快速判断酿酒窖泥品质的方法。
背景技术：
浓香型白酒是中国白酒的代表酒种，也是中国产销量最大的白酒。窖泥是浓香型白酒酿造的基础，其品质的优劣直接影响所产基酒的质量。生产中常常需要对窖泥品质进行监测，以便及时维护、提高窖泥品质。因此，对窖泥品质进行及时、正确的判断，在生产中具有重要意义。
在窖泥品质的判断方面，目前常用的判断标准仍然是感官指标，通过对窖泥的颜色、气味、手感及质地等进行人为判断。劣质窖泥常含有白色颗粒或晶体，而且酯香味较弱；优质窖泥呈灰黑色并具有较浓的酯香味，有时会有臭鸡蛋气味。但感官判断对经验的要求较高，且人的主观因素影响较大。
部分专利给出了窖泥质量的量化评价标准，如专利cn201310051543.1，但该专利评价指标较多，且人的主观因素仍然影响较大；专利cn201410782176.7以所酿白酒的品质来判断窖泥的品质，但由于影响酿酒品质的因素是多样的，且需较长周期，在及时性上有所不足。
窖泥中微生物类群非常复杂，栖息着大量窖泥功能菌，对浓香型白酒的风格形成具有十分重要的作用，其种类和丰度也是衡量窖泥品质的一个重要指标。近年来随着微生物检测技术的发展，使利用微生物技术来研究窖泥微生物组成、判断窖泥品质成为新的研究方向，如专利cn201010537999.5利用变性梯度凝胶电泳技术分析窖泥微生物菌群组成，专利cn201410119217.4提供了窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的定量分析方法。但它们都侧重于提供一些检测方法，没有建立利用指针性微生物快速判断窖泥品质的方法，且它们所建立的检测方法对人员和设备的要求较高，在酒厂应用将面临较大的困难。
专利cn201710259131.5利用高通量测序方法，发现了乳酸杆菌在窖泥中的分布规律，并利用乳酸杆菌的丰度判断窖泥质量。然而，这种方法所需成本较高，周期较长，且只有乳酸杆菌这一个指标，导致实际应用中仍然面临诸多问题。
因此，需要开发新型、快速、可靠的判断窖泥品质的方法。鉴于微生物菌群结构与窖泥品质密切相关，通过对窖泥微生物菌群结构的分析，有可能发现与窖泥品质密切相关的指针性微生物，基于对这些指针性微生物的检测，有望建立快速判断窖泥品质的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，以解决现有技术在窖泥检测方面存在易受人主观因素影响、准确性差的问题。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：以窖泥中的克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的浓度对窖泥品质进行判断，克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的浓度与窖泥品质正相关。
所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、首先提取待测的窖泥样品中的微生物基因组总dna；
(2)、其次利用克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的特异性引物，对微生物基因组总dna中属于克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的dna进行pcr扩增，得到扩增产物；
(3)、接着采用凝胶电泳检测的方法检测pcr扩增后的扩增产物，并观察电泳检测结果；
(4)、然后对凝胶电泳检测结果进行定量分析，获取克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的dna浓度；
(5)、最后根据克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的dna浓度判断窖泥品质，优质窖泥中克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的dna浓度比劣质窖泥高。
所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：步骤(1)中，使用mobio强力土壤dna提取试剂盒对待测的窖泥样品的微生物基因组总dna进行提取。
所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：步骤(2)中，克氏梭状芽孢杆菌的特异性引物为：clo-f(5’-gaggagcaaatctcaaaaactgc-3’)、clo-r(5’-cctccttggttagactacggactt-3’)；
沃氏互营单胞菌的特异性引物为：syn-f(5’-ttccggtcgggttttacagg-3’)、syn-r(5’-gctgccatcgagcctatctt-3’)。
所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：步骤(2)中，进行pcr扩增时，pcr反应体系中各组分及各组分的体积如下：
所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：步骤(2)中，进行pcr扩增时，pcr扩增程序为：95℃10min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。
所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：步骤(3)中，利用凝胶成像仪观察到较亮的目标条带，即为凝胶电泳检测结果。
所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：步骤(4)中，通过软件gelanalysis对凝胶电泳检测结果进行定量分析，获取克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的dna浓度。
本发明的优点
1、相较于传统的窖泥感官判断方法，本发明无需特别依赖经验，并且可排除人主观因素的影响，具有较好的科学性。
2、本发明利用两种微生物指标进行窖泥品质判断，相比于利用单一微生物指标对窖泥品质的判断，该方法准确性更高。
3、本发明发掘的两种指针性微生物不仅可以用来鉴定窖泥品质，也为将来通过添加指针性微生物改善窖泥品质提供了理论依据。因此，本发明在窖泥的维护、优化方面具有重要意义。
附图说明
图1为利用克氏梭状芽孢杆菌特异性引物对优、劣窖泥样品进行pcr检测。
图1中：a，pcr扩增产物的凝胶成像结果。m，dnamarker5000；l1-l3，劣质窖泥；h1-h3，优质窖泥；ck，阴性对照。b，目标条带dna浓度。dna浓度计算时扣除背景(ck)值，且每个样品所对应的dna浓度为三组实验的平均值。
图2利用沃氏互营单胞菌特异性引物对优、劣窖泥样品进行pcr检测。
图2中：a，pcr扩增产物的凝胶成像结果。m，dnamarker5000；l1-l3，劣质窖泥；h1-h3，优质窖泥；ck，阴性对照。b，目标条带dna浓度。dna浓度计算时扣除背景(ck)值，且每个样品所对应的dna浓度为三组实验的平均值。
图3利用克氏梭状芽孢杆菌特异性引物对20组窖泥样品进行pcr检测。
图3中：a，pcr扩增产物的凝胶成像结果。m，dnamarker5000；1-10，劣质窖泥；11-20，优质窖泥；ck，阴性对照。b，目标条带dna浓度。dna浓度计算时扣除背景(ck)值，且每个样品所对应的dna浓度为三组实验的平均值。
图4利用沃氏互营单胞菌特异性引物对20组窖泥样品进行pcr检测。
图4中：a，pcr扩增产物的凝胶成像结果。m，dnamarker5000；1-10，劣质窖泥；11-20，优质窖泥；ck，阴性对照。b，目标条带dna浓度。dna浓度计算时扣除背景(ck)值，且每个样品所对应的dna浓度为三组实验的平均值。
具体实施方式
实施例1两种指针性微生物克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的发掘
1.样品采集
窖泥样品采集于某大型知名酿酒公司，且选取品质稳定的优、劣窖泥。窖泥质量根据其感官特征和长期酿酒结果进行判定：优质窖泥呈灰黑色、酯香浓郁、有硫化氢气味、湿润、柔软、质地均匀，长期酿酒效益较好(表1)；劣质窖泥呈银灰色、有白色团块或针状结晶、酯香味淡，长期酿酒效益较差(表1)。窖泥样品采用五点取样法，在池底四角和中心的下方约10cm处等体积取样，再将五个点所取的样品混匀。
表1优、劣窖池2015-2016年所酿特优酒的己酸乙酯含量(平均值，μg/ml)
注：l1-l3为劣质窖泥；h1-h3为优质窖泥。
2.样品总dna的提取
利用mobio土壤dna提取试剂盒(powersoildnaisolationkit，mobio)，提取2.5g窖泥样品的微生物总dna，经检测合格后即可用于16srdna高通量测序。
3.测序结果分析和指针性微生物的发掘
样品dna经扩增和文库构建后进行16srdnav4区高通量测序。测序数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，得到高质量的reads；根据reads之间的overlap关系将reads拼接成tags；在97％相似度下将tags聚成otu，然后通过otu与数据库比对，对otu进行物种注释；基于otu和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。
通过对优、劣窖泥属水平的微生物进行分析，发现clostridium和syntrophomonas这两个属的相对丰度与窖泥品质呈明显的正相关关系(表2)。进一步分析发现，沃氏互营单胞菌(s.wolfei)在优质窖泥中的相对丰度明显高于劣质窖泥(表3)。已有文献报道，s.wolfei在一些浓香型白酒窖泥中存在。因此，可选择沃氏互营单胞菌(s.wolfei)作为指示窖泥品质的一种候选微生物。
表2优、劣窖泥中clostridium和syntrophomonas两个属的相对丰度(％)
注：l1-l3为劣质窖泥；h1-h3为优质窖泥。
表3优、劣窖泥中s.wolfei的相对丰度(％)
注：l1-l3为劣质窖泥；h1-h3为优质窖泥。
clostridium属的相对丰度与窖泥品质呈明显的正相关关系(表2)，且克氏梭状芽孢杆菌(c.kluyveri)作为窖泥有益微生物已被广泛报道。16srdnav4区高通量测序结果未发现c.kluyveri在窖泥中的分布情况，这可能是因为这种测序技术获得的16srdna序列较短(所用测序引物为515f/806r)，无法将所有微生物精确鉴定到种，从而导致c.kluyveri的丰度没有显示出来。因此，亦可选择克氏梭状芽孢杆菌(c.kluyveri)作为指示窖泥品质的另一种候选微生物。
4.利用特异性引物检测克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌
4.1特异性引物的合成
根据文献报道的克氏梭状芽孢杆菌(c.kluyveri)和沃氏互营单胞菌(s.wolfei)的特异性引物信息，合成相应的引物。克氏梭状芽孢杆菌的特异性引物为：clo-f(5’-gaggagcaaatctcaaaaactgc-3’)、clo-r(5’-cctccttggttagactacggactt-3’)；沃氏互营单胞菌的特异性引物为：syn-f(5’-ttccggtcgggttttacagg-3’)、syn-r(5’-gctgccatcgagcctatctt-3’)。
4.2pcr扩增
将mobio强力土壤dna提取试剂盒所提取的基因组dna用无菌水稀释10倍，作为pcr扩增的模板dna。pcr反应体系见表4。pcr扩增程序为：95℃10min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。
表4pcr扩增体系(25μl)
4.3扩增产物凝胶电泳检测
取5μl扩增产物，加入1μlloadingbuffer，混匀后，在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，电压120v，电流110a，电泳时间35min。dnamarker为上海生工生物工程股份有限公司的dnamarkersplus，加样量为6μl。将电泳后的琼脂糖凝胶从电泳槽中取出，利用凝胶成像仪观察电泳结果。
克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌特异性引物的扩增结果均显示，优质窖泥所对应的泳道能观察到较亮的目标条带，而劣质窖泥所对应的目标条带则较暗(图1a、2a)。
4.4目标条带dna浓度分析
本实验中使用的dnamarker各条带浓度已知，选择250bp的marker条带作为参照(该条带6μl所含的dna量为50ng)。通过软件gelanalysis对样品目标条带的dna进行定量，获得各泳道相应条带的dna浓度。计算各样品dna浓度时，扣除阴性对照(ck)相对应的背景值。dna定量分析表明，优质窖泥所对应的目标条带dna浓度均要明显高于劣质窖泥(图1b、2b)。
上述结果表明，优质窖泥中克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的含量要明显高于劣质窖泥。因此，克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌具有作为与窖泥品质相关的指针性微生物的潜力，且可尝试利用特异性引物对它们进行检测来判断窖泥品质。
实施例2通过检测克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌来快速判断20组窖泥品质
1.窖泥样品的采集
窖泥样品采用五点取样法，在池底四角和中心的下方约10cm处等体积取样，并将每个窖池五个点所取的样品混匀。编号1-10、11-20分别为酿酒公司已鉴定的劣质、优质窖泥样品，窖泥质量根据其感官特征和长期酿酒结果(表5)进行判定。
表5优、劣窖池2015-2016年所酿特优酒的己酸乙酯含量(平均值，μg/ml)
注：1-10为劣质窖泥；11-20为优质窖泥。
2.窖泥样品微生物基因组dna的提取
使用mobio强力土壤dna提取试剂盒对2.5g窖泥样品的微生物基因组dna进行提取，用无菌双蒸水稀释10倍备用。
3.pcr扩增及电泳检测
见实施例1
4.目标条带dna浓度分析
见实施例1
5.结果与分析
克氏梭状芽孢杆菌特异性引物的扩增结果显示：1-10号窖泥样品对应的目标条带较暗；11-20号窖泥样品对应的目标条带较亮(图3a)。根据对照marker的dna含量，计算各样品扩增产物的dna浓度，结果显示：1-10号窖泥样品所对应的目标条带dna浓度为0.54-2.45ng/μl，而11-20号窖泥样品所对应的目标条带dna浓度为8.42-11.53ng/μl(图3b)。这些结果表明，11-20号窖泥样品的克氏梭状芽孢杆菌含量要高于1-10号窖泥样品。
沃氏互营单胞菌特异性引物的扩增结果显示：1-10号窖泥样品对应的目标条带较暗；11-20号窖泥样品对应的目标条带较亮(图4a)。根据对照marker的dna含量，计算各样品扩增产物的dna浓度，结果显示：1-10号窖泥样品所对应的目标条带dna浓度为0.70-1.73ng/μl，而11-20号窖泥样品所对应的目标条带dna浓度为4.55-22.33ng/μl(图4b)。这些表明，11-20号窖泥样品的沃氏互营单胞菌含量要高于1-10号窖泥样品。
根据上述特异性引物扩增的检测结果，可做出如下判断：1-10号窖泥样品的品质较差；11-20号窖泥样品的品质较好。这一判断结果与酿酒公司根据其感官特征和长期酿酒效益(表5)来判定窖泥质量的结果高度吻合。因此，本发明所建立的通过检测克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌这两种指针性微生物来快速判断窖泥品质的方法具有一定的科学性与准确性。
本发明所研究的优质窖泥(13个样品：编号h1-h3、11-20)中，克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌所对应的dna浓度范围分别为8.19-11.53ng/μl、4.50-22.33ng/μl；劣质窖泥(13个样品：编号l1-l3、1-10)中克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌所对应的dna浓度范围分别为0.54-2.48ng/μl、0.70-1.80ng/μl。这一浓度范围可作为该企业后续窖泥品质判断的一个参考值。其他企业可应用本发明中的方法比较、判断窖泥品质，并根据不同品质窖泥的检测结果建立其参考值。
本发明使用的检测方法是利用特异性引物进行pcr扩增来检测克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌这两种指针性微生物。相较于传统的窖泥感官判断方法，本发明无需特别依赖经验，并且可排除人主观因素的影响。此外，本发明利用两种微生物指标进行窖泥品质判断，相比于利用单一微生物指标进行判断，准确性更高。
虽然本发明所使用的检测方法在操作简便性上还有待进一步改进，但本发明所挖掘的克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌这两种指针性微生物，可作为后续研究、应用工作的基础，针对这两种指针性微生物可开发新型定量化且简单快速的检测手段，如利用生物传感器、试纸条等技术开发新型可商业化的检测试剂盒。此外，本发明所使用的特异性引物进行pcr扩增这一检测手段，在新型定量化且简单快速的检测手段面世之前，在实际应用过程中也具有一定的应用价值，如本发明中实施例2部分对20组窖泥品质的判断。
综上，本发明在窖泥品质监测领域具有一定的应用价值；同时，本项研究为通过添加指针性微生物改善窖泥品质提供了一定的理论依据，因此，本发明亦可用于窖泥的维护、优化工作。