本发明涉及叶酸代谢能力基因分型检测技术，具体涉及一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术：
叶酸是一种从菠菜中发现的水溶性维生素，又称之为维生素b9。随后，科学家发现各种动植物类食品中均含有叶酸，这类叶酸被称之为天然叶酸。通过饮用食物，尤其是绿叶蔬菜类，人体可以获得叶酸的补充。除此之外，还可以通过服用合成的叶酸片，增补叶酸，其生物利用度更高，约为天然叶酸的一倍。叶酸对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用，同时也是胎儿生长发育不可缺少的营养素。
我国是新生儿出生缺陷的高发国家之一，每年的出生缺陷儿数量约占全世界的20％。据中国疾病预防控制中心统计资料显示，我国每年约有80万-120万名出生缺陷儿，平均每30秒就有一名缺陷儿出生。科学研究已经表明，叶酸缺乏是导致新生儿出生缺陷的主要原因。
同时由中华医学会心血管分会高血压学组与精准心血管病学学组以及中国医师协会高血压专业委员会三大组织联合发布的《h型高血压诊断与治疗专家共识》指出，叶酸缺乏和(或)同型半胱氨酸(hcy)/叶酸代谢途径中关键酶的缺陷或基因突变是导致血hcy水平升高的主要原因，hcy≥10μmol/l是高血压重要的危险分层因素。共识还指出，叶酸代谢过程中的关键酶即亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)基因的677tt基因型在中国人群中频率高于其他国家人群，该基因型在血压增高的同时会大大增加脑卒中发生的危险。
尽管目前的循证医学证据支持补充叶酸这样一种疾病预防策略，但在临床实践中，针对补充叶酸的方法、剂量、持续的时间、患者的随访等方面还存在很多困惑。叶酸代谢能力受遗传因素影响，目前已经得到证实并且机理研究清楚的与叶酸代谢相关的基因主要是mthfr和mtrr(甲硫氨酸合成酶还原酶)，不同的基因分型对应的叶酸补充剂量不一致，这导致个体化的补充叶酸成为预防策略的重中之重。
因此，高效、准确的检测判断叶酸代谢能力基因分型就显得极为重要，同时也成为指导个体化增补叶酸的关键。目前检测叶酸代谢能力相关基因突变的方法主要有测序法、基因芯片法、荧光pcr法、高分辨率熔解曲线法以及pcr-rflp等，其中以荧光pcr法最为常用且具实用性。荧光pcr法又分为pcr-荧光染料法和pcr-荧光探针法，在实际应用中，pcr-荧光探针法的特异性高于pcr-荧光染料法，因此，pcr-荧光探针法更适合用于检测叶酸代谢能力基因分型。
但是，现有的技术中，荧光pcr法检测叶酸代谢能力基因分型，需要提取血液基因组dna作为模板，进行相应的检测，这一操作大大的增加了检验操作人员的工作量，且增加了检测成本和时间。另外，现有的荧光pcr法检测叶酸代谢能力基因分型，多是针对每个位点设置一个检测管，如检测一个样本mthfr基因677c>t突变、mthfr基因1298a>c突变以及mtrr基因66a>g突变共三个位点，则需分别设置三个检测管，进行相应检测，操作费时费力，不利于临床大规模推广使用。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种叶酸代谢能力基因分型检测的试剂盒、方法及其应用，所述试剂盒能够快速有效的检测叶酸代谢能力基因分型，为个体化增补叶酸的指导奠定了基础。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种叶酸代谢能力基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括针对mthfr、mtrr基因突变的特异性引物和特异性突变检测探针；rt-pcr反应buffer；rt-pcr反应taq酶；ddh2o；阴性质控品；野生型质控品；突变型质控品；分隔并包装试剂瓶或管的包装盒。
本发明中，首次公开通过pcr-荧光探针法技术直接利用全血样本检测叶酸代谢能力基因分型的试剂盒，通过独特设计的特异性引物序列和特异性突变检测探针，在rt-pcr反应buffer中加入bsa、tritonx-100以及明胶等辅料，实现在同一反应管中对同一全血样本的不同位点进行同时检测，排除全血中抑制pcr反应的因素，避免了dna的提取步骤，降低了检测成本。
辅料明胶和bsa可以增加dna聚合酶的稳定性，减少管壁吸附造成的试剂损失。bsa还能克服黑色素对pcr反应的抑制。triton-100能够裂解全血样本中的细胞，释放dna，同时，还能克服反应体系中残留的痕量离子型去垢剂对pcr反应的抑制作用。
优选地，所述特异性引物和特异性突变检测探针的核苷酸序列包含如seqidno.1-9所示的片段。
优选地，所述seqidno：1-3所示的序列是用于检测mthfr基因677c>t突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
优选地，所述seqidno：4-6所示的序列是用于检测mthfr基因1298a>c突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
优选地，所述seqidno：7-9所示的序列是用于检测mtrr基因66a>g突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
所述特异性引物和特异性突变检测探针的核苷酸序列如下：
所述特异性突变检测探针设计方式为探针5’端碱基与待检测位点碱基重合，并人为修改探针5’端第二个或第三个位置的碱基，使其错配，提高检测特异性。
所述特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团；
优选的，所述mthfr基因677c>t突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合fam基团和tamra基团；
优选的，所述mthfr基因1298a>c突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合hex基团和bhq1基团；
优选的，所述mthfr基因66a>g突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合cy5基团和bhq2基团；
本发明中，独特设计的三种特异性突变检测探针上分别带有不同的荧光发生基团和荧光淬灭基团，三种探针混合在一个检测管中。在pcr反应过程中，基因位点若是野生型，则探针会特异性结合在待检测位点处，随着pcr反应的进行会释放出不同波长的荧光信号；基因位点若是纯合突变型，探针则无法特异性的结合在待检测位点处，随着pcr反应的进行，没有荧光信号的释放；基因位点若是杂合突变型，随着pcr反应的进行，会释放出不同波长的荧光信号，但荧光信号值弱于野生型。通过荧光定量pcr仪分别收集三种荧光信号的改变，转换成ct值，即可判断出三种基因分型的突变结果，从而实现在单个反应管中完成叶酸代谢能力基因三个位点的基因分型检测。目前市面上的检测方法多是以同一种荧光发生基团和荧光淬灭基团标记所有的探针，通过不同的反应管区分不同的叶酸代谢能力基因分型，暂无在同一反应管中检测叶酸代谢能力不同位点的基因分型试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括：rt-pcr反应buffer、rt-pcr反应酶、ddh2o、阴性质控品、野生型质控品、突变型质控品。
优选的，所述rt-pcr反应bufferph值为7.5～8.5，由20～100mmol/l的tris-hcl、5～20mmol/l的mgcl2、0.1～1mg/ml的bsa、0.1％～2％的明胶、0.2％～2％的tritonx-100和0.1～0.5mmol/l的kcl组成。
所述rt-pcr反应酶由热启动taq酶和dntps组成；
优选的，热启动taq酶的用量为2～10u；dntps为2～5mmol/l。
所述阴性质控品为灭菌纯水。
所述野生型质控品，人工合成的mthfr基因677位点野生型dna、mthfr基因1298位点野生型dna，以及mtrr基因66位点野生型dna，使用终浓度为0.2mm。
所述突变型质控品，人工合成的mthfr基因677位点纯合突变型dna、mthfr基因1298位点纯合突变型dna，以及mtrr基因66位点纯合突变型dna，使用终浓度为0.2mm。
第二方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的试剂盒用于检测叶酸代谢能力基因分型的方法，包括以下步骤：
1)以2μl全血作为检测样本，不需要提取dna模板；
2)取各组分混合，加入2μl全血样本，进行pcr扩增反应；
3)pcr扩增：条件为95℃5分钟；95℃30秒，55℃35秒(采集荧光)，42个循环；72℃延伸30秒；荧光通道1选择fam通道，荧光通道2选择hex通道、荧光通道3选择cy5通道；
4)检测结果判定：pcr结果判定通过各检测通道ct值确定，阴性质控品通道的ct值>36，野生型和杂合突变型质控品的ct值≤36的检测结果视为有效；样本检测结果ct值≤24，基因分型结果为野生型；样本检测结果24＜ct值≤36，基因分型结果为杂合突变型；样本检测结果ct值>36，基因分型结果为纯合突变型。
优选地，步骤(1)所述的待测样品为外周静脉血、指尖血或足跟血的任意一种或至少两种的混合物。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的试剂盒、或第二方面所述的方法用于检测叶酸代谢能力基因分型的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
(1)本发明试剂盒采用pcr-荧光探针法技术检测叶酸代谢能力基因是否发生突变，不仅具有很好的准确性和特异性，而且还减少了检测的操作步骤，提高了检测效率；
(2)本发明试剂盒将独特设计的特异性引物和特异性突变检测探针，bsa、tritonx-100、明胶等辅料进行整合，制备的叶酸代谢能力基因分型检测试剂组合，相比于目前国内外市场上的其他基因突变检测试剂或试剂盒，能直接对全血样本进行检测，排除全血中抑制pcr反应的因素，无需提取dna模板作为检测样本，降低了检验成本；
(3)本发明试剂盒优化了特异性突变检测探针的设计方法，单管即可实现同一样本叶酸代谢能力三个位点的基因分型检测，缩短了检测的步骤和时间，操作简便，检测结果具有更好的特异性和准确性；
(4)本发明试剂盒对叶酸代谢能力相关基因突变的检测具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性能高等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合从全血等样本中检测叶酸代谢能力相关基因的突变，可以实时、无创的对患者进行诊断，复发监控和疗效评估，具有重要的临床价值。
附图说明
图1本发明叶酸代谢能力野生型、杂合突变型扩增曲线图；
图2本发明叶酸代谢能力基因分型不同buffer组扩增对比图；
图3本发明叶酸代谢能力基因分型全血检测与dna模板检测对比图；
图4本发明叶酸代谢能力基因分型野生型、杂合突变型以及纯合突变型ct值阈值。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1叶酸代谢能力基因分型检测试剂盒的制备
pcr试剂：终浓度0.1mtris-hcl缓冲液、10mmol/l的mgcl2、0.6mg/ml的bsa、1％的明胶、0.5％的tritonx-100和0.5mmol/l的kcl混合液，按1ml/支分装储存。5utaqdna聚合酶、2.5mmol/ldntps的混合液，按0.3ml/支分装储存。ddh2o，按1ml/支分装储存。
特异性引物和特异性突变检测探针：所述核苷酸序列为seqidno.1-9，用于pcr反应，按0.25ml/支分装。
阴性质控品，灭菌的纯化水。
野生型质控品，人工合成的mthfr基因677位点野生型dna、mthfr基因1298位点野生型dna，以及mtrr基因66位点野生型dna，使用终浓度为0.2mm，按0.1ml/支分装储存。
突变型质控品，人工合成的mthfr基因677位点纯合突变型dna、mthfr基因1298位点纯合突变型dna，以及mtrr基因66位点纯合突变型dna，使用终浓度为0.2mm，按0.1ml/支分装储存。
将上述试剂管分隔并合并包装于包装盒中。
实施例2叶酸代谢能力基因分型检测
所述方法包括如下步骤：
1)取2.5μl特异性引物和特异性突变检测探针，10μlrt-pcr反应buffer，2.5μlrt-pcr反应酶以及8μlddh2o，在冰上混合振荡均匀；并设立常规rt-pcr反应buffer对照组；
2)分别取2μl全血样本、阴性质控品、野生型质控品或杂合突变型质控品，加入步骤1)中的反应管，其中野生型质控品与纯合突变型质控品等量混合成杂合突变型质控品；并提取实验组样本血液基因组dna模板，用于对照实验；
3)设置pcr反应条件：95℃5分钟；95℃30秒，55℃35秒，42个循环；72℃延伸30秒；
4)将反应管放入荧光定量pcr仪内，点击“开始”，进行检测；
5)将pcr反应结果导出，用于分析。
实施例3检测结果判读
如图1所示，阴性质控品未出现扩增，无ct值，表明实验操作未出现污染；野生型和杂合型质控品有扩增，ct值＜36，表明实验结果可信。
如图2所示，常规rt-pcr反应buffer对照组中，全血样本没有明显扩增，表明对全血抑制剂没有去抑制效果。
由图3可以看出，全血样本组与基因组dna模板对照组检测结果ct值相关性良好，r2＝0.9775；显著性分析结果显示p＜0.05，差异性不显著，表明全血直接pcr检测叶酸代谢能力基因分型结果准确可靠。
由图4可以看出，样品的ct值≤24，表示叶酸代谢能力基因分型为野生型；24＜ct值≤36，表示叶酸代谢能力基因分型为杂合型；ct值>36，表示叶酸代谢能力基因分型为纯合突变型。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用
本发明涉及叶酸代谢能力基因分型检测技术，具体涉及一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
叶酸是一种从菠菜中发现的水溶性维生素，又称之为维生素b9。随后，科学家发现各种动植物类食品中均含有叶酸，这类叶酸被称之为天然叶酸。通过饮用食物，尤其是绿叶蔬菜类，人体可以获得叶酸的补充。除此之外，还可以通过服用合成的叶酸片，增补叶酸，其生物利用度更高，约为天然叶酸的一倍。叶酸对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用，同时也是胎儿生长发育不可缺少的营养素。
我国是新生儿出生缺陷的高发国家之一，每年的出生缺陷儿数量约占全世界的20％。据中国疾病预防控制中心统计资料显示，我国每年约有80万-120万名出生缺陷儿，平均每30秒就有一名缺陷儿出生。科学研究已经表明，叶酸缺乏是导致新生儿出生缺陷的主要原因。
同时由中华医学会心血管分会高血压学组与精准心血管病学学组以及中国医师协会高血压专业委员会三大组织联合发布的《h型高血压诊断与治疗专家共识》指出，叶酸缺乏和(或)同型半胱氨酸(hcy)/叶酸代谢途径中关键酶的缺陷或基因突变是导致血hcy水平升高的主要原因，hcy≥10μmol/l是高血压重要的危险分层因素。共识还指出，叶酸代谢过程中的关键酶即亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)基因的677tt基因型在中国人群中频率高于其他国家人群，该基因型在血压增高的同时会大大增加脑卒中发生的危险。
尽管目前的循证医学证据支持补充叶酸这样一种疾病预防策略，但在临床实践中，针对补充叶酸的方法、剂量、持续的时间、患者的随访等方面还存在很多困惑。叶酸代谢能力受遗传因素影响，目前已经得到证实并且机理研究清楚的与叶酸代谢相关的基因主要是mthfr和mtrr(甲硫氨酸合成酶还原酶)，不同的基因分型对应的叶酸补充剂量不一致，这导致个体化的补充叶酸成为预防策略的重中之重。
因此，高效、准确的检测判断叶酸代谢能力基因分型就显得极为重要，同时也成为指导个体化增补叶酸的关键。目前检测叶酸代谢能力相关基因突变的方法主要有测序法、基因芯片法、荧光pcr法、高分辨率熔解曲线法以及pcr-rflp等，其中以荧光pcr法最为常用且具实用性。荧光pcr法又分为pcr-荧光染料法和pcr-荧光探针法，在实际应用中，pcr-荧光探针法的特异性高于pcr-荧光染料法，因此，pcr-荧光探针法更适合用于检测叶酸代谢能力基因分型。
但是，现有的技术中，荧光pcr法检测叶酸代谢能力基因分型，需要提取血液基因组dna作为模板，进行相应的检测，这一操作大大的增加了检验操作人员的工作量，且增加了检测成本和时间。另外，现有的荧光pcr法检测叶酸代谢能力基因分型，多是针对每个位点设置一个检测管，如检测一个样本mthfr基因677c>t突变、mthfr基因1298a>c突变以及mtrr基因66a>g突变共三个位点，则需分别设置三个检测管，进行相应检测，操作费时费力，不利于临床大规模推广使用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种叶酸代谢能力基因分型检测的试剂盒、方法及其应用，所述试剂盒能够快速有效的检测叶酸代谢能力基因分型，为个体化增补叶酸的指导奠定了基础。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种叶酸代谢能力基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括针对mthfr、mtrr基因突变的特异性引物和特异性突变检测探针；rt-pcr反应buffer；rt-pcr反应taq酶；ddh2o；阴性质控品；野生型质控品；突变型质控品；分隔并包装试剂瓶或管的包装盒。
本发明中，首次公开通过pcr-荧光探针法技术直接利用全血样本检测叶酸代谢能力基因分型的试剂盒，通过独特设计的特异性引物序列和特异性突变检测探针，在rt-pcr反应buffer中加入bsa、tritonx-100以及明胶等辅料，实现在同一反应管中对同一全血样本的不同位点进行同时检测，排除全血中抑制pcr反应的因素，避免了dna的提取步骤，降低了检测成本。
辅料明胶和bsa可以增加dna聚合酶的稳定性，减少管壁吸附造成的试剂损失。bsa还能克服黑色素对pcr反应的抑制。triton-100能够裂解全血样本中的细胞，释放dna，同时，还能克服反应体系中残留的痕量离子型去垢剂对pcr反应的抑制作用。
优选地，所述特异性引物和特异性突变检测探针的核苷酸序列包含如seqidno.1-9所示的片段。
优选地，所述seqidno：1-3所示的序列是用于检测mthfr基因677c>t突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
优选地，所述seqidno：4-6所示的序列是用于检测mthfr基因1298a>c突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
优选地，所述seqidno：7-9所示的序列是用于检测mtrr基因66a>g突变的特异性引物和特异性突变检测探针。
所述特异性引物和特异性突变检测探针的核苷酸序列如下：
所述特异性突变检测探针设计方式为探针5’端碱基与待检测位点碱基重合，并人为修改探针5’端第二个或第三个位置的碱基，使其错配，提高检测特异性。
所述特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团；
优选的，所述mthfr基因677c>t突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合fam基团和tamra基团；
优选的，所述mthfr基因1298a>c突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合hex基团和bhq1基团；
优选的，所述mthfr基因66a>g突变的特异性突变检测探针5’端和3’端分别结合cy5基团和bhq2基团；
本发明中，独特设计的三种特异性突变检测探针上分别带有不同的荧光发生基团和荧光淬灭基团，三种探针混合在一个检测管中。在pcr反应过程中，基因位点若是野生型，则探针会特异性结合在待检测位点处，随着pcr反应的进行会释放出不同波长的荧光信号；基因位点若是纯合突变型，探针则无法特异性的结合在待检测位点处，随着pcr反应的进行，没有荧光信号的释放；基因位点若是杂合突变型，随着pcr反应的进行，会释放出不同波长的荧光信号，但荧光信号值弱于野生型。通过荧光定量pcr仪分别收集三种荧光信号的改变，转换成ct值，即可判断出三种基因分型的突变结果，从而实现在单个反应管中完成叶酸代谢能力基因三个位点的基因分型检测。目前市面上的检测方法多是以同一种荧光发生基团和荧光淬灭基团标记所有的探针，通过不同的反应管区分不同的叶酸代谢能力基因分型，暂无在同一反应管中检测叶酸代谢能力不同位点的基因分型试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括：rt-pcr反应buffer、rt-pcr反应酶、ddh2o、阴性质控品、野生型质控品、突变型质控品。
优选的，所述rt-pcr反应bufferph值为7.5～8.5，由20～100mmol/l的tris-hcl、5～20mmol/l的mgcl2、0.1～1mg/ml的bsa、0.1％～2％的明胶、0.2％～2％的tritonx-100和0.1～0.5mmol/l的kcl组成。
所述rt-pcr反应酶由热启动taq酶和dntps组成；
优选的，热启动taq酶的用量为2～10u；dntps为2～5mmol/l。
所述阴性质控品为灭菌纯水。
所述野生型质控品，人工合成的mthfr基因677位点野生型dna、mthfr基因1298位点野生型dna，以及mtrr基因66位点野生型dna，使用终浓度为0.2mm。
所述突变型质控品，人工合成的mthfr基因677位点纯合突变型dna、mthfr基因1298位点纯合突变型dna，以及mtrr基因66位点纯合突变型dna，使用终浓度为0.2mm。
第二方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的试剂盒用于检测叶酸代谢能力基因分型的方法，包括以下步骤：
1)以2μl全血作为检测样本，不需要提取dna模板；
2)取各组分混合，加入2μl全血样本，进行pcr扩增反应；
3)pcr扩增：条件为95℃5分钟；95℃30秒，55℃35秒(采集荧光)，42个循环；72℃延伸30秒；荧光通道1选择fam通道，荧光通道2选择hex通道、荧光通道3选择cy5通道；
4)检测结果判定：pcr结果判定通过各检测通道ct值确定，阴性质控品通道的ct值>36，野生型和杂合突变型质控品的ct值≤36的检测结果视为有效；样本检测结果ct值≤24，基因分型结果为野生型；样本检测结果24＜ct值≤36，基因分型结果为杂合突变型；样本检测结果ct值>36，基因分型结果为纯合突变型。
优选地，步骤(1)所述的待测样品为外周静脉血、指尖血或足跟血的任意一种或至少两种的混合物。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的试剂盒、或第二方面所述的方法用于检测叶酸代谢能力基因分型的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
(1)本发明试剂盒采用pcr-荧光探针法技术检测叶酸代谢能力基因是否发生突变，不仅具有很好的准确性和特异性，而且还减少了检测的操作步骤，提高了检测效率；
(2)本发明试剂盒将独特设计的特异性引物和特异性突变检测探针，bsa、tritonx-100、明胶等辅料进行整合，制备的叶酸代谢能力基因分型检测试剂组合，相比于目前国内外市场上的其他基因突变检测试剂或试剂盒，能直接对全血样本进行检测，排除全血中抑制pcr反应的因素，无需提取dna模板作为检测样本，降低了检验成本；
(3)本发明试剂盒优化了特异性突变检测探针的设计方法，单管即可实现同一样本叶酸代谢能力三个位点的基因分型检测，缩短了检测的步骤和时间，操作简便，检测结果具有更好的特异性和准确性；
(4)本发明试剂盒对叶酸代谢能力相关基因突变的检测具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性能高等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合从全血等样本中检测叶酸代谢能力相关基因的突变，可以实时、无创的对患者进行诊断，复发监控和疗效评估，具有重要的临床价值。
附图说明
图1本发明叶酸代谢能力野生型、杂合突变型扩增曲线图；
图2本发明叶酸代谢能力基因分型不同buffer组扩增对比图；
图3本发明叶酸代谢能力基因分型全血检测与dna模板检测对比图；
图4本发明叶酸代谢能力基因分型野生型、杂合突变型以及纯合突变型ct值阈值。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1叶酸代谢能力基因分型检测试剂盒的制备
pcr试剂：终浓度0.1mtris-hcl缓冲液、10mmol/l的mgcl2、0.6mg/ml的bsa、1％的明胶、0.5％的tritonx-100和0.5mmol/l的kcl混合液，按1ml/支分装储存。5utaqdna聚合酶、2.5mmol/ldntps的混合液，按0.3ml/支分装储存。ddh2o，按1ml/支分装储存。
特异性引物和特异性突变检测探针：所述核苷酸序列为seqidno.1-9，用于pcr反应，按0.25ml/支分装。
阴性质控品，灭菌的纯化水。
野生型质控品，人工合成的mthfr基因677位点野生型dna、mthfr基因1298位点野生型dna，以及mtrr基因66位点野生型dna，使用终浓度为0.2mm，按0.1ml/支分装储存。
突变型质控品，人工合成的mthfr基因677位点纯合突变型dna、mthfr基因1298位点纯合突变型dna，以及mtrr基因66位点纯合突变型dna，使用终浓度为0.2mm，按0.1ml/支分装储存。
将上述试剂管分隔并合并包装于包装盒中。
实施例2叶酸代谢能力基因分型检测
所述方法包括如下步骤：
1)取2.5μl特异性引物和特异性突变检测探针，10μlrt-pcr反应buffer，2.5μlrt-pcr反应酶以及8μlddh2o，在冰上混合振荡均匀；并设立常规rt-pcr反应buffer对照组；
2)分别取2μl全血样本、阴性质控品、野生型质控品或杂合突变型质控品，加入步骤1)中的反应管，其中野生型质控品与纯合突变型质控品等量混合成杂合突变型质控品；并提取实验组样本血液基因组dna模板，用于对照实验；
3)设置pcr反应条件：95℃5分钟；95℃30秒，55℃35秒，42个循环；72℃延伸30秒；
4)将反应管放入荧光定量pcr仪内，点击“开始”，进行检测；
5)将pcr反应结果导出，用于分析。
实施例3检测结果判读
如图1所示，阴性质控品未出现扩增，无ct值，表明实验操作未出现污染；野生型和杂合型质控品有扩增，ct值＜36，表明实验结果可信。
如图2所示，常规rt-pcr反应buffer对照组中，全血样本没有明显扩增，表明对全血抑制剂没有去抑制效果。
由图3可以看出，全血样本组与基因组dna模板对照组检测结果ct值相关性良好，r2＝0.9775；显著性分析结果显示p＜0.05，差异性不显著，表明全血直接pcr检测叶酸代谢能力基因分型结果准确可靠。
由图4可以看出，样品的ct值≤24，表示叶酸代谢能力基因分型为野生型；24＜ct值≤36，表示叶酸代谢能力基因分型为杂合型；ct值>36，表示叶酸代谢能力基因分型为纯合突变型。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110>普迈德（北京）科技有限公司
<120>一种精准检测aldh2基因多态性的试剂盒及其应用
<130>2017
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工合成序列(人工序列)
<400>1
ggagcccagtcacccttt18
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工合成序列(人工序列)
<400>2
ccaacagaccccaatccc18
<210>3
<211>23
<212>dna
<213>人工合成序列(人工序列)
<400>3
ctgcaggcatacactgaagtgaa23
<210>4
<211>23
<212>dna
<213>人工合成序列(人工序列)
<400>4
ctgcaggcatacactaaagtgaa23
<210>5
<211>23
<212>dna
<213>人工合成序列(人工序列)
<400>5
ctgcaggcatacacttaagtgaa23
<210>6
<211>23
<212>dna
<213>人工合成序列(人工序列)
<400>6
ctgcaggcatacactcaagtgaa23