本发明属于生物技术领域，具体涉及一种5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法。
背景技术：
呋喃-2,5-二羧酸(fdca)是一种可代替传统材料用于合成高分子多聚物的新型小分子化合物。呋喃-2,5-二羧酸可由生物来源的5-羟甲基糠醛(hmf)经过3步连续的氧化反应生成。目前研究报道了一种来自甲基菌属methylovorussp.strainmp688的5-羟甲基糠醛氧化酶(hmfo)，研究人员以大肠杆菌中重组表达的hmfo为催化剂，成功的将hmf转化成了fdca，但催化效率较低。由于该酶催化的反应具有重大的应用价值，因此对酶进行改造以提高其催化效率显得尤为重要。定向进化是改进生物酶的常用有效手段，但需要从大量的突变体中筛选出极少数性质提高的突变体，因此要求对突变库进行快速高效的筛选，而常规的hplc等筛选方法不仅需要昂贵的检测仪器，而且操作步骤多、费时，无法满足对活性酶进行快速定向进化的要求。另外，如若要从自然界中大批量筛选产hmfo野生菌株，常规的筛选方法也不适合。因此，建立一种快速、准确、低成本和易操作的5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量筛选方法是很有必要的。
技术实现要素：
本发明意在提供一种5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法，以解决使用现有技术不能对活性酶进行快速筛选的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法，包括以下步骤：
步骤一、过夜培养：在96孔培养板的孔中均放入100～120μllb培养基，挑取含5-羟甲基糠醛氧化酶基因的菌株单克隆依次放入孔中，再将96孔培养板放入摇床，在37～40℃的温度下以250～300rmp的转速培养16～20h；
步骤二、诱导培养：向96孔培养板的孔中均加入100～120μl且浓度为0.1～0.5mmiptg的诱导剂，在16～18℃培养20～24h；
步骤三、离心收集：在5000～6000rmp的转速下离心5～10min，然后收集细胞菌体，去除培养基和诱导剂，加入150～200μl的细胞裂解液，并在20～25℃的温度下以5000～6000rmp的转速震荡1h；
步骤四、二次离心：在5000～6000rmp的转速下离心15～20min；
步骤五、提取上清液与显色反应液：从96孔培养板的每个孔中取20～50μl含5-羟甲基糠醛氧化酶蛋白的上清液置于96孔酶标板中，然后在96孔酶标板中加入含有90～100mm磷酸缓冲液、1～20mm底物和10～20μm10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine与6～10u/ml辣根过氧化物酶的显色反应液；
步骤六、检测：将96孔酶标板放入酶标仪中，在560～580nm波长下测定不同时间的光吸收值。
优选的，步骤一中，所述lb培养基的成分为：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l和nacl5g/l。
优选的，步骤三中，所述细胞裂解液的成分为：100mm磷酸缓冲液(ph＝6.0～8.0)、1mg/l溶菌酶、10mm氯化镁，1u/mldna酶i。
本发明的工作原理及其有益效果为：相比于常规的应用hplc检测等方法检测5-羟甲基糠醛氧化酶活性，本发明建立高通量活性筛选方法具有快速、准确、低成本、易操作和高通量等优点。
附图说明
图1为5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法原理；
图2为ptrchisb-hmfo表达载体示意图；
图3为5-羟甲基糠醛氧化酶在96孔培养板中对底物hmf的活性展示；
图4为5-羟甲基糠醛氧化酶在96孔培养板中对底物ffca的活性展示。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细的说明：(以下所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内)。
实施例1：
根据已报到的hmfo蛋白序列(序列号：wp_013440946)在ncbi中比对获得相应的基因核酸序列，人工合成hmfo基因全长，并在其两端导入bamhi和sali酶切位点。用bamhi和sali进行双酶切后，与同样经过bamhi和sali双酶切的质粒ptrchis-b进行连接。用t4dna连接酶，16℃连接4h后，连接产物转化大肠杆菌dh5α。通过图1所示的5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法原理，过夜培养后，挑取长出的单克隆菌落摇菌并提取质粒，获得重组质粒ptrchis-hmfo，其示意图参见图2。最后将质粒ptrchis-hmfo转化到大肠杆菌bl21(de3)中，甘油(终浓度为20％)保存于-80℃冰箱。
实施例2：
将保存于甘油中含ptrchis-hmfo质粒的基因工程菌bl21(de3)划平板活化后，从平板上挑取46个单克隆至96孔培养板的各个孔中(含100μllb培养基)，挑取2个ptrchis-b空质粒的bl21(de3)菌作为对照。将平板放入摇床，在37℃下以250rpm的转速培养过夜(约16h)后，向96孔培养板孔中加入100μl含0.2mm浓度诱导剂(诱导剂终浓度为0.1mm)，转至16℃，250rpm的转速培养24h，诱导5-羟甲基糠醛氧化酶蛋白表达。然后置于5000rpm的转速下离心5min收集菌体细胞，在去除培养基后加入200μl细胞裂解液，常温下充分震荡1h。最后置于5000rpm的转速下离心15min，从每个孔中取50μl含5-羟甲基糠醛氧化酶蛋白的上清液于96孔酶标板中。向酶标板中加入含有10mmhmf底物的150μl反应液，置于酶标仪中，利用kinetic模式测定每个孔在560nm波长下的光吸收增加值，比较每个孔中酶的活性(图3)。结果表明，在每一个含有ptrchis-b质粒的孔中均检测到了明显的活性，表明本方法能成功检测5-羟甲基糠醛氧化酶对底物hmf的活性。更重要的是，每个孔中的酶活性值基本一致，不同孔间的标准误差仅为5％，表明本方法带来的实验误差非常小，可用于高通量的活性筛选。
实施例3：
参照实施例2的方法和步骤获得含5-羟甲基糠醛氧化酶蛋白的粗酶液，取50μl粗酶液于96孔酶标板中。向96孔酶标板中加入含有10mmffca底物的150μl反应液，半小时后置于酶标仪中，利用endpoint模式测定每个孔在560nm波长下的光吸收值，比较每个孔中酶的活性(图4)。结果表明，在每一个含有ptrchis-b质粒的孔中均检测到了明显的活性，表明本方法能成功检测5-羟甲基糠醛氧化酶对底物ffca的活性。同样，每个孔中的酶活性值基本一致，不同孔间的标准误差仅为8％，表明本方法带来的实验误差非常小，可用于高通量的活性筛选。
实施例4：
使用引物f：5’-gggaattccatatgactgatacgatttttgac-3’和r：5’-cgcggatccttaagcctgggtcagaatc-3’，以ptrchis-hmfo质粒dna为模板，利用易错pcr，构建hmfo随机突变体库。pcr反应体系如下：10×taqbuffer5μl，mgcl21.5mm，dntp0.4mm，dna模板10ng，dmso3％，上下游引物各0.5μl、mncl20.01mm，ddh2o补至50μl。将pcr片段导入表达载体ptrchis-b后转化大肠杆菌dh5α，过夜培养后收集平板上的菌株单克隆，再次提取质粒并导入大肠杆菌bl21(de3)，获得突变体库。过夜培养后挑取单克隆至96孔平板，按照实施例2中的方法培养获得hmfo酶蛋白。接着按照实施例2中检测方法，筛选突变体对hmf的活性。结果表明，利用此高通量筛选方法，成功筛选到了一些活性提高2-10倍的酶蛋白突变体，说明本发明的方法可以成功应用于5-羟甲基糠醛氧化酶突变体的筛选。