本发明属于双水相体系技术领域，具体涉及一种双水相体系及其应用。
背景技术：
高温下稳定乳状液滴是许多基于液滴技术的化学或生物测试技术的最基本的要求。本申请特指在乳状物液滴内部发生的化学或者生物反应，例如液滴pcr，典型的液滴pcr体系包括pcrmastermix作为液相分散体系。碳氢化合物，硅或者碳氟化合物为主的油作为连续相。可溶解在连续相里的表面活性剂起到防止液滴聚合和粘合的作用。在多数情况下，只依靠单一的油相表活剂无法在pcr温度下(4～98℃)稳定液滴。为了防止液滴在高温下聚合粘合，水相试剂中必须加入稳定剂用于和油相试剂中的表活剂相互作用，起到在pcr反应过程中在温度下(4～98℃)稳定乳状液滴的目的。
现有的能在pcr温度下稳定水相分散在碳氟化合物连续相的乳状液滴方法之一是利用可溶解在水相中的可交联蛋白，例如牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，简称bsa)，与油相分散相中的带负电的表面活性剂，例如krytox羧酸(krytoxfsh),相互作用来达到高温下稳定液滴的作用。以上体系取决于静电作用引起的牛血清白蛋白微乳液膜界面扩散过程，在pcr热循环加热过程中，bsa在油相液滴中带羧酸基的表活剂的负电荷在静电吸引作用下从水相扩散到乳状液滴油水界面处，在高温下发生变性从而发生交联，在液滴的油水界面处形成一层类似表皮的固体蛋白膜。该固体蛋白膜使液滴表面固化，从而达到了在高温下稳定液滴，和防止液滴聚合粘合的作用。
但以上方法仍然存在缺点，从而限制了这个方法的应用范围。例如，体系中带负电荷的表活剂的羧酸基使整个体系酸性很强，导致和水相中的用于与pcr反应的酶失活，使得整个体系对所使用的聚合酶的兼容性非常窄。其次，体系不能和大多数的dna嵌入式染料，比如sybrgreen或者evagreen相兼容。原因是大多数dna嵌入式染料带正电荷，会和bsa产生竞争性的静电吸引作用，从而导致bsa无法有效的在油水界面处形成固体膜。另外，带正电荷的dna嵌入式染料会被油相中的表活剂上的带负电的羧酸基给吸附，从而使得dna嵌入式染料被析出水相，导致染料泄露到水相外的油相里，使得pcr反应受到负面影响。
不仅如此，该体系在其他方面还存在缺陷与限制，比如，在体系中，液滴表面产生的固体蛋白膜会限制很多微流控应用中对液滴进行的融合和分裂等的操控。综上，能得到同时使整个微滴体系和多种生物反应兼容，不出现酶的失活问题，又能保证微液滴的油水界面为液态而非固态，利于微流控中对液滴的操作的可通用的高温稳定微乳液滴的体系显得尤为重要。
技术实现要素：
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种双水相体系及其制备方法与应用。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种双水相体系，包括一种或多种多糖聚合物衍生物、一种或多种含有聚乙二醇结构组分的高聚物。
优选地，含有一种或多种多糖聚合物衍生物、一种或多种含有聚乙二醇结构组分的高聚物，所述多糖聚合物衍生物的质量体积浓度在0.1％到10％之间，含聚乙二醇结构的高聚物组分的质量体积浓度在0.1％到10％之间。
优选地，所述多糖包括但不局限于：海藻酸、壳聚糖、肝素，玻尿酸，卡拉胶，右旋糖酐，结兰胶，瓜尔胶，糊精，木葡聚糖，普鲁兰，裂褶菌多糖，果胶以及它们的衍生物。
优选地，所述含聚乙二醇结构的高聚物包括但不局限于：聚乙二醇均聚物、聚乙二醇-聚乳酸共聚物、聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇-聚己内酯共聚物、聚乙二醇-聚乙烯共聚物、聚乙二醇-聚苯乙烯共聚物、聚乙二醇-聚二甲基矽氧烷共聚物、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物。
优选地，所述共聚物的结构可以为嵌段共聚物，接枝共聚物，无规共聚物，交替共聚物或星状共聚物。
一种双水相体系在核酸扩增反应下作为稳定剂的应用。
优选地，所述的双水相体系在核酸扩增反应下作为稳定剂的应用，所述双水相体系在高温、恒温或等温下作为稳定乳状微液滴的应用。
优选地，所述核酸为dna、rna或游离血浆dna。
优选地，所述核酸扩增反应包括但不局限于目标核酸分子的线性或指数性扩增。
优选地，所述乳状微液滴为油包水微液滴，所述双水相体系中一种或多种多糖聚合物衍生物集中微液滴水相内层，所述一种或多种含有聚乙二醇结构组分的高聚物与微液滴油相中表面活性剂作用形成高聚物网状结构，用于稳定油包水微液滴。
本发明的有益效果体现在：能够在pcr反应的温度下作为稳定剂更好的稳定油包水液滴，保证液滴在pcr热循环反应后仍然保持液滴的微流可操控性，且能兼容pcr杂交探针和dna嵌入式染料两种不同的反应。
附图说明
图1：本发明双水相体系的作用原理示意图。
图2：对实施例一产物进行pcr凝胶电泳实验检测图。
图3：对实施例一pcr反应后液滴在荧光显微镜下观察图。
图4：对实施例二中对pcr产物进行荧光定量pcr跟踪的ct值示意图。
图5：对实施例一产物进行pcr凝胶电泳实验检测图。
图6：对实施例二反应后液滴在荧光显微镜下观察图。
图7：本发明明亮视野下的微液滴照片。
具体实施方式
本发明揭示了一种作为稳定剂的应用的双水相体系，具体的，所述双水相体系在高温、恒温或等温下作为稳定乳状微液滴的应用。
所述双水相体系，包括一种或多种多糖聚合物衍生物、一种或多种含有聚乙二醇结构组分的高聚物。其中所述多糖聚合物衍生物的质量体积浓度在0.1％到10％之间，所述多糖包括但不局限于：海藻酸、壳聚糖、肝素，玻尿酸，卡拉胶，右旋糖酐，结兰胶，瓜尔胶，糊精，木葡聚糖，普鲁兰，裂褶菌多糖，果胶以及它们的衍生物。
含聚乙二醇结构的高聚物组分的质量体积浓度在0.1％到10％之间。所述含聚乙二醇结构的高聚物包括但不局限于：聚乙二醇均聚物、聚乙二醇-聚乳酸共聚物、聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇-聚己内酯共聚物、聚乙二醇-聚乙烯共聚物、聚乙二醇-聚苯乙烯共聚物、聚乙二醇-聚二甲基矽氧烷共聚物、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物。以上共聚物的结构可以为嵌段共聚物，接枝共聚物，无规共聚物，交替共聚物或星状共聚物。
具体的，以上双水相体系在核酸扩增反应下作为稳定剂的应用，所述核酸为dna、rna或游离血浆dna，扩增是指核酸分子拷贝数的增加。所述核酸扩增反应包括但不局限于目标核酸分子的线性或指数性扩增。扩增反应中的温度包括线性或者循环温度。扩增也可以在合适的条件下发生，例如热循环或者等温反应。除此，本发明也适用于rna逆转录反应(rt-pcr)，所述逆转录反应中利用rna为模板复制出一条互补dna单链。
本发明阐述的双水相体系所适用的反应之一是pcr反应。但该体系也适用但不局限于其他扩增反应，例如滚环扩增(rollingcircleamplification)、恒温扩增(isothermalamplification)、环介导等温扩增(loopmedicatedisothermalamplification)、联级pcr反应(cascaderca)，或者是几种使用了位点特异性引物，嵌套引物，或者随机引物的扩增反应的组合。
当然，本发明中阐述的微液滴双水相反应体系应用范围包括但不局限于微液滴式数字pcr反应，下一代高通量测序技术(ngs)的样品制备，单细胞dna或者rna测序等包含了核酸扩增步骤的反应。
本发明中双水相体系中的均为常规化学试剂，故在此不再赘述其制备过程。
以下阐述下本发明双水相体系的应用原理，如图1所示，所述乳状微液滴为油包水微液滴，所述双水相体系中一种或多种多糖聚合物衍生物集中微液滴水相内层，所述一种或多种含有聚乙二醇结构组分的高聚物与微液滴油相中非离子表面活性剂通过范德华力作用作用形成高聚物网状结构用于稳定油包水微液滴。油相包括氟油，硅油和碳氢化合物为组成成分的矿物油。其中油相的非离子表面活性剂通常为含有聚乙二醇结构的两亲性分子，其类型根据具体油相体系可包括但不局限于：吐温系列表面活性剂，普朗尼克系列表面活性剂，brij系列表面活性剂，igepal系列表面活性剂，triton系列表面活性剂，abilem系列硅化表面活性剂，zonyl系列氟化表面活性剂，krytox系列氟化表面活性剂，capstone系列氟化表面活性剂。
以下结合实施例具体阐述本发明的技术方案，
实施例一：
本实施例的微液滴pcr反应试剂有：
非微液滴的普通液相pcr参考反应
本实施例的pcr热循环步骤:
对实施例一得产物和参考反应(非微液滴的普通液相pcr反应)进行pcr凝胶电泳检测实验，结果如图2所示，左侧实线指示的为微液滴pcr反应后的凝胶图，右侧虚线指示的为参照反应单一水相pcr反应后的凝胶图凝胶。实验说明本发明所阐述的两相液相体系能和dna嵌入式荧光染料反应兼容。
对pcr反应后的液滴在荧光显微镜下进行观察，如图3所示，观察出液滴在经过热循环后仍保持均一稳定，且含有目标dna的阳性液滴可清晰地与不含目标的阴性液滴区分开来。阴性液滴的微弱荧光信号是由evagreen染料的背景荧光及被evagreen染料嵌入的引物二聚体所导致。
实施例二：
本实施例的微液滴pcr反应试剂有：
非微液滴的普通液相pcr反应
本实施例的pcr热循环步骤:
对实施例二得到的pcr产物进行荧光定量pcr实时跟踪，ct值结果如图4所示，其中，实线为参照反应非微液滴的普通液相pcr反应ct值。段状虚线为使用本发明中双水相体系的微液滴pcrct值。点状虚线为阴性对照反应，为水。在25个热循环之前，实线，段状虚线和点状虚线代表的反应dna扩增探针产生的荧光强度都未超过检测的临界值。在25个热循环反应后，实线，段状虚线所代表的反应产生的荧光强度都超过了检测的临界值，表现为上升的荧光曲线图。点状虚线代表的阴性对照反应无dna扩增，因此，和基线重合。荧光强度保持在0的基线。该实验结果说明本发明所阐述的微液滴pcr反应中两相液相体系能和杂交探针反应兼容
对实施例二得到的pcr产物进行pcr凝胶电泳检测实验，结果如图5所示，其中左侧为微液滴pcr反应后的凝胶图，右侧为参照反应bulkpcr后的凝胶图。凝胶实验表明本发明所阐述的双水相体系能和杂交探针反应兼容。
对实施例二反应后液滴在荧光显微镜下进行观察，如图6所示，其中显示荧光的液滴中含有dna模板，无荧光液滴为空液滴不含dna模板。表明了使用本发明所阐述的两相体系能实现微液滴pcr杂交探针反应。
实施例二反应后在明亮视野下进行荧光显微镜微液滴观察，结果如图7所示，每个微液滴大小为115-120μm。
以上表明了本发明所阐述的体系能在pcr热循环反应结束后保持稳定的微液滴。同时，不仅证明了本发明所阐述的两相液相体系能和杂交探针反应兼容，还证明了本发明所阐述的体系能应用于数字pcr体系。
当然本发明尚有多种具体的实施方式，在此就不一一列举。凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。