本发明涉及一种参与新穿心莲内酯生物合成的糖基转移酶及其编码基因与应用。
背景技术：
穿心莲为爵床科植物穿心莲(andrographispaniculata(burm.f.)nees)的干燥地上部分，具有清热解毒、凉血、消肿等功效，被广泛用于临床。目前穿心莲除作为中药饮片穿心莲用于临床，还被制成多种现代剂型用于临床，如穿心莲片、穿心莲胶囊、穿心莲注射液、喜炎平注射液及穿琥宁注射液等。其有效成分主要通过化学方法提取，产量较低。与化学合成方法相比，生物合成避免了使用重金属、有机溶剂等对环境造成的污染，酶的底物特异性可以减少副产物的生成，由于天然产物生物合成途径已知，弥补了复杂结构的化合物较难建立化学合成路径的缺陷。穿心莲内酯及其类似物属于二萜内酯类化合物，其生物合成途径主要分为三个阶段，即二萜类化合物直接前体香叶基香叶基焦磷酸(ggpp)的形成阶段、二萜母核的形成阶段、结构修饰酶对二萜结构母核的修饰阶段。ggpp的直接前体ipp和dmapp主要涉及mep途径和mva途径；随后在二萜合酶的作用下，经过最初的离子化、异构化后环化形成各种阳离子中间产物，最终通过去质子或捕获亲核物质进一步环化形成一系列的二萜骨架中间体；随后在通过细胞色素p450进行结构修饰，主要包括羟基化、甲基化、异构化、脱甲基化、加成和还原等。糖基化是一种广泛存在于植物中的重要后修饰及转化反应，是二萜类化合物合成的最后也是极其关键的一步。穿心莲内酯苷具有抗癌、抗病毒、抗微生物和抗炎活性等药理作用，新穿心莲内酯可抗病毒、抗炎、抗氧化、抗寄生虫、保肝。技术实现要素：本发明的目的是提供一种参与新穿心莲内酯生物合成的糖基转移酶及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，获自穿心莲，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)含有(a1)的融合蛋白；(a3)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a4)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；(a5)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖基转移酶功能的由其衍生的蛋白质。标签具体如表1所示。表1标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedlha9ypydvpdya蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。蛋白质的编码基因可通过将(b1)或(b2)中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)所述的dna分子：(b1)编码区如序列表中序列2所示的dna分子；(b2)编码区如序列表中序列4所示的dna分子；(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的dna序列杂交且编码糖基转移酶的dna分子；(b4)来源于穿心莲的与(b1)或(b2)限定的dna序列具有95％以上同源性且编码糖基转移酶的dna分子。上述严格条件可为用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜。含有所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组表达载体具体可为将所述基因克隆至出发表达载体得到的重组质粒。所述出发表达载体具体可为载体his-mbp-pet28a。所述重组菌具体可为将所述重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌。所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌transetta(de3)。本发明还保护所述蛋白质作为糖基转移酶的应用。本发明还保护所述蛋白质的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)：(c1)参与新穿心莲内酯生物合成；(c2)制备新穿心莲内酯；(c3)以新穿心莲内酯苷元为底物制备新穿心莲内酯。本发明还保护所述蛋白质的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)：(d1)参与穿心莲内酯苷生物合成；(d2)制备穿心莲内酯苷；(d3)以穿心莲内酯为底物制备穿心莲内酯苷。本发明还保护所述蛋白质的应用，为如下(e1)或(e2)或(e3)：(e1)参与脱水穿心莲内酯苷生物合成；(e2)制备脱水穿心莲内酯苷；(e3)以脱水穿心莲内酯为底物制备脱水穿心莲内酯苷。本发明还保护所述蛋白质的应用，为如下(f1)或(f2)或(f3)：(f1)参与去氧穿心莲内酯苷生物合成；(f2)制备去氧穿心莲内酯苷；(f3)以去氧穿心莲内酯为底物制备去氧穿心莲内酯苷。本发明还保护所述重组菌在制备所述蛋白质中的应用。糖基转移酶参与植物生长、发育及次生代谢过程。糖基转移酶及其编码基因的发现具有重要意义，本发明为进一步阐明穿心莲中糖苷类化合物的生物合成提供基础，有助于对于穿心莲中糖苷类活性成分的生物合成途径的解析，为新药研发提供了新的物质基础和基因资源。附图说明图1为底物为穿心莲内酯时的结果图。图2为底物为新穿心莲内酯苷元的结果图。图3为底物为去氧穿心莲内酯的结果图。图4为底物为脱水穿心莲内酯的结果图。图5为以新穿心莲内酯苷元为底物时蛋白作为糖基转移酶的动力学的结果图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。大肠杆菌transetta(de3)：北京全式金生物技术有限公司。peasy-uniseamlesscloningandassemblykit：北京全式金生物技术(transgenbiotech)有限公司。ni-nta琼脂糖亲和层析柱：qiagen,wisconsin,usa。穿心莲内酯(cas号：5508-58-7)、脱水穿心莲内酯(cas号：134418-28-3)、去氧穿心莲内酯(cas号：79233-15-1)：四川维克奇生物科技有限公司。新穿心莲内酯苷元(cas号：82209-74-3)：加拿大trc公司。穿心莲内酯苷(cas号：82209-76-5)：上海源叶生物科技有限公司。新穿心莲内酯(cas号：27215-14-1)：四川维克奇生物科技有限公司。载体his-mbp-pet28a记载于如下文献：probingthesinglekeyaminoacidresponsibleforthenovelcatalyticfunctionofent-kaureneoxidasesupportedbynadph-cytochromep450reductasesintripterygiumwilfordii；frontiersinplantscience，www.frontiersin.org；october2017，volume8，article1756。实施例1、参与新穿心莲内酯生物合成的糖基转移酶及其编码基因的发现首先，发明人发现茉莉酸甲酯可以诱导穿心莲叶中穿心莲内酯的积累。进一步，发明人又发现茉莉酸甲酯也可诱导穿心莲叶中新穿心莲内酯的积累。通过高通量全基因组测序，初步筛选到九个基因，其表达均受到茉莉酸甲酯的诱导。进一步的，对九个基因进行原核表达和功能验证，发现一个参与新穿心莲内酯生物合成的糖基转移酶。该参与新穿心莲内酯生物合成的糖基转移酶如序列表的序列1所示(预期分子量约100kda)，其cdna中的编码区如序列表的序列2所示。实施例2、功能验证一、构建重组质粒1、合成序列表的序列2所示的双链dna分子。2、以步骤1得到的dna分子为模板，采用f1和r1组成的引物对进行pcr扩增，回收pcr扩增产物。f1：5’-tccaggggcccgaattcggaatgaaggaactagccgcagc-3’；r1：5’-agtgcggccgcaagcttgtcaattgttcttaagttccg-3’。3、取载体his-mbp-pet28a，用限制性内切酶bamhⅰ和salⅰ进行双酶切，回收线性化的载体骨架。4、取步骤2得到的pcr扩增产物，采用peasy-uniseamlesscloningandassemblykit并按说明书操作，将其克隆至载体his-mbp-pet28a，得到重组质粒。经测序，重组质粒中具有序列表的序列4所示的开放阅读框，表达序列表的序列3所示的融合蛋白。二、制备粗酶液1、取步骤一构建的重组质粒，导入大肠杆菌transetta(de3)，得到重组菌。2、将步骤1得到的重组菌接种至含0.1mg/100ml氨苄青霉素的液体lb培养基，37℃、250rpm振荡培养至od600nm＝0.6-1.0。3、完成步骤2后，在体系中加入iptg并使其在体系中的浓度为1mm，16℃、180rpm振荡培养12h。4、完成步骤3后，4℃、10000g离心20min，收集菌体，用预冷的pb缓冲液(含1mmedta、10％甘油、1mmpmsf，溶剂为ph7.0、50mm的tris-hcl缓冲液)重悬，然后置冰浴中进行超声破菌(30％功率，超声5s，间隔5s，持续10min)，然后4℃、12000g离心15min，收集上清液，即为粗酶液，将该上清液命名为上清液甲。用载体his-mbp-pet28a代替重组质粒进行上述步骤，得到的上清液命名为上清液乙。三、制备蛋白1、取步骤三得到的上清液甲，采用ni-nta琼脂糖亲和层析柱进行纯化。洗脱过程：将上清液上样ni-nta琼脂糖亲和层析柱，4℃孵育2小时；然后用30个柱体积的20mm咪唑溶液洗涤；然后用1个柱体积的500mm咪唑溶液洗涤；收集用500mm咪唑溶液洗涤得到的过柱后溶液。咪唑溶液中，含0.5mnacl和咪唑，溶剂为ph7.4、0.02m的pb缓冲液。2、取步骤1得到的过柱后溶液，采用超滤管进行浓缩，并将体系更换为含0.5mnacl的ph7.4、0.02m的pb缓冲液，即为目标蛋白溶液。经检测，目标蛋白溶液的总蛋白浓度为7μg/μl。四、蛋白具有糖基转移酶功能的验证试验分别设置如下四种底物：穿心莲内酯、新穿心莲内酯苷元、脱水穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯。在具有糖基供体的体系中，在糖基转移酶的作用下：穿心莲内酯的理论产物为穿心莲内酯苷，新穿心莲内酯苷元的理论产物为新穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯的理论产物为脱水穿心莲内酯苷，去氧穿心莲内酯的理论产物为去氧穿心莲内酯苷。待测粗酶液为步骤二制备的上清液甲或上清液乙。反应体系组成：300μl待测粗酶液、1.5μl底物母液和3μludpg溶液。底物母液的制备方法：将底物溶于dmso，使底物的浓度为40mm。udpg(全称为二磷酸尿核苷葡萄糖)作为糖基供体。udpg溶液的制备方法：将udpg溶于水，使udpg的浓度为40mm。反应条件：30℃静置反应12h。完成反应后，加入2倍体积的甲醇以中止反应，然后采用0.2μm微孔滤膜过滤，收集滤液，进行液质联用检测。液质联用为watersacquityi-classuplctm串联waterszevog2-sq-tofms(美国waters公司)，色谱柱为watersacquityuplcbehc18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm)，柱温40℃。进样量1μl。流动相流速为0.4ml/min。流动相由a液和b液组成。a液为0.1％(体积百分含量)甲酸水溶液。b液为乙腈。洗脱过程：0-3min，b液占流动相的体积份数由95％线性下降至83％；3-12min，b液占流动相的体积份数由83％线性下降至65％；12-14.5min，b液占流动相的体积份数由65％线性下降至40％；14.5-15min，b液占流动相的体积份数由40％线性下降至2％；15-17min，b液占流动相的体积份数为2％；17-17.5min，b液占流动相的体积份数由2％线性上升至95％；17.5-20min，b液占流动相的体积份数为95％。离子化模式为电喷雾正离子，毛细管电压为500v，锥孔电压为30v，除溶剂气体为氮气(900l/h)，除溶剂温度为450℃，离子源温度为100℃，扫描范围为50至1500质荷比，碰撞气体为氩气，低能量扫描时trap电压为6ev，高能量扫描时trap电压为20-50ev。待测粗酶液为上清液甲、底物为穿心莲内酯时的结果图见图1。图1中，左图为色谱图(提取了分子量)，右图为质谱图。图1中，(1)对应反应产物，(2)对应产物标准品，(3)对应底物标准品。反应产物峰只有一个,其质荷比比底物质荷比多162(一个葡萄糖和底物轻基脱去一分子水后,产物增加的分子量),表明产物为相应糖苷化合物。产物标准品的峰对应3.3min，反应产物的峰对应3.3min，为同一物质。待测粗酶液为上清液甲、底物为新穿心莲内酯苷元的结果图见图2。图2中，左图为色谱图(提取了分子量)，右图为质谱图。图2中，(1)对应反应产物，(2)对应产物标准品，(3)对应底物标准品。反应产物峰只有一个,其质荷比比底物质荷比多162(一个葡萄糖和底物轻基脱去一分子水后,产物增加的分子量),表明产物为相应糖苷化合物。产物标准品的峰对应8.1min，反应产物的峰对应8.1min，为同一物质。待测粗酶液为上清液甲、底物为去氧穿心莲内酯的结果图见图3。图3中，左图为色谱图(提取了分子量)，右图为质谱图。图3中，(1)对应反应产物，(2)对应底物标准品。反应产物峰只有一个,其质荷比比底物质荷比多162(一个葡萄糖和底物轻基脱去一分子水后,产物增加的分子量),表明产物为相应糖苷化合物。反应产物的峰对应6.7min，综合质谱图，可以判断产物为去氧穿心莲内酯苷。待测粗酶液为上清液甲、底物为脱水穿心莲内酯的结果图见图4。图4中，左图为色谱图(提取了分子量)，右图为质谱图。图4中，(1)对应反应产物，(2)对应底物标准品。反应产物峰只有一个,其质荷比比底物质荷比多162(一个葡萄糖和底物轻基脱去一分子水后,产物增加的分子量),表明产物为相应糖苷化合物。反应产物的峰对应7.1min，综合质谱图，可以判断产物为脱水穿心莲内酯苷。待测粗酶液为上清液乙时，以上四种底物，均没有显示存在目标峰以及目标物。五、以新穿心莲内酯苷元为底物时蛋白作为糖基转移酶的动力学反应体系(100μl)：将步骤三制备的目标蛋白溶液、底物母液、udp-glucose和ph7.0、50mm的tris-hcl缓冲液混合得到。反应体系中，含有14μg蛋白(由步骤三制备的目标蛋白溶液提供)。底物母液的制备方法：将底物溶于dmso，使底物的浓度为40mm。底物为新穿心莲内酯苷元。反应体系中，底物的浓度为0、40、80、160、320、480、640或1280μm。反应体系中，udp-glucose的浓度为160μm。反应条件：20℃静置反应5min。结果见图5。km＝388.7μm。vmax＝1.03μmol/min/mg。sequencelisting<110>中国中医科学院中药研究所<120>参与新穿心莲内酯生物合成的糖基转移酶及其编码基因与应用<130>gncyx180591<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>471<212>prt<213>andrographispaniculata<400>1metlysgluleualaalaalaalaalaalaalaglyglulyslyspro151015hisvalleuvalpheprotyrproalaglnglyhisileasnproala202530leuserleualalyscysleualaserlysglyleuargilethrleu354045ilethrthrthrargvalargargseralathrvalsermetserala505560trpaspsermetileserilevalaspileglyaspglyseraspglu65707580alaglugluseraspthrmetasplysasnleulyshisleuglnala859095alaleuserlysasnleuthrglupheleuaspserserargcysser100105110alaalalysalailevaltyraspserthrmetprotrpileleuasp115120125ilealahisalaargglyleuargalaalaserleuphethrglnasn130135140cysalavalcysalavaltyrtyrhisileglnglnglyserleulys145150155160tyrprotyraspglngluaspglyglyglygluaspcysvalvalser165170175leuproserleuproproleuasnalalyslysaspleuprotyrphe180185190aspalapheseraspprolyshisserleumetargleuleualaglu195200205glnpheleuasnleuglulysvalasptrpileleupheasnthrphe210215220tyrlysleugluthrargilevalasptrpmetalaserglntrppro225230235240alailelysthrvalglyprometcysserleuleuglnserasplys245250255lystyrleuserasnaspsersermetileserleuphegluproarg260265270glnaspalacysalaglutrpleuasnserlysglualaserserval275280285valtyrvalserpheglyserleualaglnleuasnlysgluglnmet290295300glugluvalalaleuglyleuleuthrseraspcysphepheleutrp305310315320valvalargalasergluargasnlysleuprolysasnphevalasp325330335alaalavalglylysglyleuilevalglutrpcyshisglnprogln340345350valleualaasnaspalavalalacysphemetthrhiscysglytrp355360365asnserthrleuglualaleuvalhisglyvalproleuilealamet370375380alaglntrpvalaspglnthrthrasnalalysleuilegluaspleu385390395400trpglyvalglythrargvallysalaarggluaspglyilevalala405410415argglugluileargargcysvalglucysmetileargglyasparg420425430alalysglumetlysargasnalaalalystrpglngluleualalys435440445glualavalaspgluglyglythrseralathrasnileglualaphe450455460valsergluleulysasnasn465470<210>2<211>1416<212>dna<213>andrographispaniculata<400>2atgaaggaactagccgcagccgcagcagcagcaggggagaagaagcctcacgttctggtg60ttcccgtacccggcgcagggccacataaacccggcgctgtcgctcgccaagtgcctcgcg120tcgaaaggcctacggatcaccctcatcactaccacacgtgtacgaagatcggcgacagtg180tcgatgtccgcgtgggactccatgatatccatagtcgacatcggggatggctccgacgag240gccgaggaatccgataccatggacaagaaccttaagcacctacaagccgcgctttcaaag300aacctcacggagttcttggacagctcgcgctgctctgcagctaaagccatcgtgtacgac360tcgaccatgccgtggattctcgacatagctcatgcgcgaggtttgcgcgccgcgtcgctc420ttcactcagaactgcgccgtctgcgccgtgtactaccatatccaacaaggctcactcaaa480tatccttacgatcaagaagacggcggaggagaagattgtgtcgtttcgctgccttcactg540cctcccctgaatgcgaagaaggatttgccgtatttcgatgctttttccgaccccaagcat600tcgctaatgaggcttctcgccgagcagtttttgaacctggaaaaagtcgattggattcta660ttcaacacgttctacaagctcgagactcggattgtcgactggatggcgagccaatggccg720gcgatcaaaactgtaggaccgatgtgttcgttgctgcagtcggacaagaaatacttgagc780aatgacagcagcatgatcagtctgttcgagccgcgacaagacgcctgcgccgaatggcta840aactctaaggaagcgagctcggttgtatatgtatcgtttggcagtttggcgcaactcaat900aaagaacaaatggaagaagtcgcgctcgggctactaacgagcgactgcttcttcttgtgg960gtagtgagagcttccgagcgcaataaactccccaaaaactttgtcgatgcagccgtggga1020aaaggcctaatcgtcgagtggtgccaccagcctcaggtcttggcaaacgacgccgtggcg1080tgtttcatgacgcattgtggatggaattcgacgctcgaggcattggtgcatggcgtgcca1140cttatagccatggcgcagtgggtcgaccaaacgacgaacgcgaagcttatcgaggatttg1200tggggagtcgggacgagagttaaagcgcgggaagatgggattgttgcaagagaagagatc1260aggaggtgcgtcgaatgcatgattcgaggagatcgcgcgaaagagatgaaaagaaacgca1320gcgaagtggcaagaattggctaaggaggccgtcgacgaaggggggacttcggcgacgaat1380attgaggccttcgtatcggaacttaagaacaattga1416<210>3<211>892<212>prt<213>artificialsequence<400>3metglyserserhishishishishishisserserglyleuvalpro151015argglyserhismetlysthrglugluglylysleuvaliletrpile202530asnglyasplysglytyrasnglyleualagluvalglylyslysphe354045glulysaspthrglyilelysvalthrvalgluhisproasplysleu505560gluglulyspheproglnvalalaalathrglyaspglyproaspile65707580ilephetrpalahisaspargpheglyglytyralaglnserglyleu8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