本发明涉及燕窝加工技术领域，特别涉及一种提取燕窝中唾液酸的方法。
背景技术：
燕窝始载于《本草逢原》，其性味甘、平，归心、肺、肾经，具有养阴润燥，益气补中的功效，临床可用于治疗虚损，痨瘵，咳嗽痰喘，咯血，吐血，久痢，久疟，噎膈反胃等症，向以贵重药材及美味佳肴而在民间广为流传使用，是宜药宜膳的高级保健品。燕窝中含有大量粘蛋白、糖蛋白、唾液酸、微量元素、表皮生长因子等多种生物活性成分，具有抗病毒、促细胞分裂、提高免疫力作用。
燕窝主要成分有：水溶性蛋白质、碳水化合物、微量元素：钙、磷、铁、钠、钾及人体必需的重要成分“神经氨酸”也被称为“燕窝酸”。燕窝酸可促进大脑神经细胞的信息传递速度，母乳中的燕窝酸为婴儿早期生长提供免疫力，提高肠道对于维生素及矿物质的吸收能力。由于燕窝酸在通过消化系统时不会被消化道的酶降解，可通过消化道进入肠道阻止肠道致病菌及病毒与细胞的吸附，对抵抗多种病菌起重要作用。燕窝中含有三种不同的营养物质：唾液酸sialicacid(n-acetylneuramicacid)，表皮生长因子(egf)和集落刺激因子(csf)。
唾液酸在自然界的分布非常广泛，从天然原料中提取为生产唾液酸的方法之一。唾液酸在燕窝中含量最高，达100g/kg，其次，唾液酸在禽蛋、乳清等原料中含量相对丰富，分别为0.3g/kg，3g/kg。唾液酸在生物体中主要有3种状态：蛋白质结合状态、低聚糖结合状态和游离状态，其中蛋白质结合和低聚糖结合状态为主要存在状态。专利un1523031a和cn103060403a分别公布了从乳清和蛋黄粉中提取唾液酸的方法，但其过程繁琐，产品得率较低。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供一种提取燕窝中唾液酸的方法，包括如下步骤：
s100：采用酶解方法制备燕窝酶解液；
s200：一次结晶，在20-25℃，在s100所得酶解液中加入沉淀剂、高岭土、胰凝乳蛋白酶、柠檬酸钠；将酶解液以1-2℃/min的速度降低5-6℃，同时以100r/min速度旋转震荡整个反应容器16-24h，过滤；
s300：离子交换，将s200过滤后的酶解液通过离子树脂柱，先采用甲酸对离子树脂柱进行洗脱，再采用去离子水进行洗脱；所述离子树脂柱由阳离子树脂和阴离子树脂构成；
s400：中和，在s300获得的酶解液中加入碳酸钠，将酶解液中的酸进行中和；
s500：二次结晶，在s400经过洗脱的酶解液中加入冰乙酸，经过结晶，获得唾液酸晶体。
进一步地，所述燕窝酶解液采用如下制备方法获得：
s110：燕窝经常温风干抽湿或置于热风循环干燥箱45℃-65℃烘干，控制水分在8％以下，机械粉碎过80目-100目筛，加20倍-35倍水置于发酶罐不浸泡或浸泡4-8小时；
s120：开启蒸汽、机械搅拌加热到95-99℃，时间为45-90分钟；
s130：停止加热，冷却降温到50-60℃，加入酶活力20-40万iu中性蛋白酶，5-20万iu动物蛋白酶，1-4万iu风味酶；中性蛋白酶、动物蛋白酶、风味酶的添加量均为燕窝干重的0.1％-0.5％；酶使用前先加少量水溶解；酶解温度50-60℃，酶解时间4-8小时，ph为自然ph值；
s140：冷却降温到常温，100-120目过滤去除杂质，得酶解液。
进一步地，所述沉淀剂为聚乙二醇和2-甲基-2,4-戊二醇的混合物；聚乙二醇和2-甲基-2,4-戊二醇的重量分数比为1:1～1:3。
进一步地，沉淀剂、高岭土、胰凝乳蛋白酶、柠檬酸钠的加入量分别为燕窝干重的2％-3％，3％-5％，0.1％-0.5％，1％-2％。
进一步地，所述离子树脂柱上的离子由阳离子树脂和阴离子树脂按质量比1:1～1:3混合而成；
所述阳离子树脂为中医732、东大d113、南开732、争光td031中的一种或者多种；
所述阴离子树脂为南开d290、南开717、南开d301-r、南开d392、东大717、中医717中的一种或者多种。
本发明提供的提取燕窝中唾液酸的方法，通过将燕窝酶解液经过两次结晶及离子交换，从而获得高纯度的唾液酸晶体。本发明提供的提取燕窝中唾液酸的方法操作简单，制得的唾液酸晶体纯度高。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种提取燕窝中唾液酸的方法，包括如下步骤：
s100：采用酶解法制备燕窝酶解液；
s200：一次结晶，在20-25℃，在s100所得酶解液中加入沉淀剂、高岭土、胰凝乳蛋白酶、柠檬酸钠；将酶解液以1-2℃/min的速度降低5-6℃，同时以100r/min速度旋转震荡整个反应容器16-24h，过滤；
优选地，所述沉淀剂为聚乙二醇和2-甲基-2,4-戊二醇的混合物；聚乙二醇和2-甲基-2,4-戊二醇的重量分数比为1:1～1:3；优选地，沉淀剂、高岭土、胰凝乳蛋白酶、柠檬酸钠的加入量分别为燕窝干重的2％-3％，3％-5％，0.1％-0.5％，1％-2％。
在步骤s200，是为了实现将酶解液中的中性蛋白酶、动物蛋白酶、风味酶去除，提高唾液酸的纯度。其中，沉淀剂可以降低蛋白质的溶解度，提高蛋白质的析出效果；高岭土是为中性蛋白酶、动物蛋白酶、风味酶的晶体形核提供载体，促进中性蛋白酶、动物蛋白酶、风味酶的结晶；同时，蛋白质对温度敏感，溶解度随温度变化极大，当酶解液的温度以1-2℃/min的速度从20-25℃降低5-6℃，酶解液中的中性蛋白酶、动物蛋白酶、风味酶可以在24小时之内结晶析出，依附于高岭土的表面析出。
s300：离子交换，将s200过滤后的酶解液通过离子树脂柱，先采用甲酸对离子树脂柱进行洗脱10-15min，再采用去离子水进行洗脱5-10min；所述离子树脂柱由阳离子树脂和阴离子树脂构成；
优选地，所述离子树脂柱上的离子由阳离子树脂和阴离子树脂按质量比1:1～1:3混合而成；所述阳离子树脂为中医732、东大d113、南开732、争光td031中的一种或者多种；所述阴离子树脂为南开d290、南开717、南开d301-r、南开d392、东大717、中医717中的一种或者多种。
在步骤s300中，是为了初步提纯唾液酸。离子树脂常分为凝胶型和大孔型两类。凝胶型树脂的高分子骨架，在干燥的情况下内部没有毛细孔。它在吸水时润胀，在大分子链节间形成很微细的孔隙，通常称为显微孔(micro-pore)。湿润树脂的平均孔径为2～4nm(2×10－6～4×10－6mm)。
这类树脂较适合用于吸附无机离子，它们的直径较小，一般为0.3～0.6nm。这类树脂不能吸附大分子有机物质，因后者的尺寸较大，如蛋白质分子直径为5～20nm，不能进入这类树脂的显微孔隙中。
大孔型树脂是在聚合反应时加入致孔剂，形成多孔海绵状构造的骨架，内部有大量永久性的微孔，再导入交换基团制成。它并存有微细孔和大网孔(macro-pore)，润湿树脂的孔径达100～500nm，其大小和数量都可以在制造时控制。孔道的表面积可以增大到超过1000m2/g，这不仅为离子交换提供了良好的接触条件，缩短了离子扩散的路程，还增加了许多链节活性中心，通过分子间的范德华引力(vandewaalsforce)产生分子吸附作用，能够象活性炭那样吸附各种非离子性物质，扩大它的功能。一些不带交换功能团的大孔型树脂也能够吸附、分离多种物质，例如化工厂废水中的酚类物。
大孔树脂内部的孔隙又多又大，表面积很大，活性中心多，离子扩散速度快，离子交换速度也快很多，约比凝胶型树脂快约十倍。使用时的作用快、效率高，所需处理时间缩短。大孔树脂还有多种优点：耐溶胀，不易碎裂，耐氧化，耐磨损，耐热及耐温度变化，以及对有机大分子物质较易吸附和交换，因而抗污染力强，并较容易再生。因此，本发明实施例中步骤s300使用大孔树脂；
s400：中和，在s300获得的酶解液中加入碳酸钠，将酶解液中的酸进行中和；
s500：二次结晶，在s400经过洗脱的酶解液中加入冰乙酸，经过结晶，获得唾液酸晶体。
优选地，所述燕窝酶解液采用如下制备方法获得：
s110：燕窝经常温风干抽湿或置于热风循环干燥箱45℃-65℃烘干，控制水分在8％以下，机械粉碎过80目-100目筛，加20倍-35倍水置于发酶罐不浸泡或浸泡4-8小时；
s120：开启蒸汽、机械搅拌加热到95-99℃，时间为45-90分钟；
s130：停止加热，冷却降温到50-60℃，加入酶活力20-40万iu中性蛋白酶，5-20万iu动物蛋白酶，1-4万iu风味酶；中性蛋白酶、动物蛋白酶、风味酶的添加量均为燕窝干重的0.1％-0.5％；酶使用前先加少量水溶解；酶解温度50-60℃，酶解时间4-8小时，ph为自然ph值；
s140：冷却降温到常温，100-120目过滤去除杂质，得酶解液。
实施例1
称取燕窝1kg干燥后，机械粉碎过80目筛，加25kg水浸泡5小时，加热到96℃保温50分钟，冷却到55℃，加20万iu的中性蛋白酶、15万iu的动物蛋白酶、2万iu的风味酶，添加量分别为0.2％、0.3％、0.1％，酶解时间为6小时，酶解ph值为自然ph值7.2，获得酶解液；
一次结晶，在20℃，在所得酶解液中加入2％沉淀剂、3％高岭土、0.1％胰凝乳蛋白酶、1％柠檬酸钠；将酶解液以1℃/min的速度降低5℃，同时以10r/min速度旋转震荡整个反应容器16h，过滤；离子交换，将过滤后的酶解液通过由等量的中医732和南开d290组成的离子树脂柱，然后先采用甲酸对离子树脂柱进行洗脱10min，再采用去离子水进行洗脱5min；中和，在获得的酶解液中加入碳酸钠，将酶解液中的酸进行中和；二次结晶，在经过洗脱的酶解液中加入冰乙酸，经过结晶，获得唾液酸晶体。
经过检测，所获得的唾液酸的收率为89.5％，唾液酸晶体纯度为99.5％。
实施例2
称取燕窝1kg干燥后，机械粉碎过100目筛，加30kg水浸泡3小时，加热到96℃保温60分钟，冷却到50℃，加20万iu的中性蛋白酶、10万iu的动物蛋白酶、3万iu的风味酶，添加量分别为0.3％、0.5％、0.1％，酶解时间为6小时，酶解ph值为自然ph值7.5，获得酶解液；
一次结晶，在25℃，在所得酶解液中加入3％沉淀剂、5％高岭土、0.5％胰凝乳蛋白酶、2％柠檬酸钠；将酶解液以2℃/min的速度降低至20℃，同时以10r/min速度旋转震荡整个反应容器24h，过滤；离子交换，将过滤后的酶解液通过由1重量份东大d113和3重量份南开717组成的离子树脂柱，然后先采用甲酸对离子树脂柱进行洗脱15min，再采用去离子水进行洗脱10min；中和，在获得的酶解液中加入碳酸钠，将酶解液中的酸进行中和；二次结晶，在经过洗脱的酶解液中加入冰乙酸，经过结晶，获得唾液酸晶体。
经过检测，所获得的唾液酸的收率为90.3％，唾液酸晶体纯度为99.7％。
实施例3
称取燕窝10kg干燥后，机械粉碎过80目筛，加300kg水，加热到99℃保温70分钟，冷却到60℃，加40万iu的中性蛋白酶、10万iu的动物蛋白酶、2万iu的风味酶，添加量分别为0.3％、0.3％、0.1％，酶解时间为5小时，酶解ph值为自然ph值7.8，获得酶解液；
一次结晶，在23℃，在所得酶解液中加入2.5％沉淀剂、4％高岭土、0.3％胰凝乳蛋白酶、1.5％柠檬酸钠；将酶解液以1.5℃/min的速度降低至18℃，同时以10r/min速度旋转震荡整个反应容器20h，过滤；离子交换，将过滤后的酶解液通过由1重量份东大d113和3重量份南开717组成的离子树脂柱，然后先采用甲酸对离子树脂柱进行洗脱15min，再采用去离子水进行洗脱10min；中和，在获得的酶解液中加入碳酸钠，将酶解液中的酸进行中和；二次结晶，在经过洗脱的酶解液中加入冰乙酸，经过结晶，获得唾液酸晶体。
经过检测，所获得的唾液酸的收率为89.9％，唾液酸晶体纯度为99.8％。
对比例1
采用s100酶解法获得燕窝酶解液后，直接采用s300离子交换法进行燕窝酸提取，所获得的唾液酸的收率为84.2％，唾液酸纯度为93.2％。
对比例2
采用s100酶解法获得燕窝酶解液后，直接采用冰乙酸结晶进行燕窝酸提取，所获得的唾液酸的收率为85.3％，唾液酸纯度为94.1％。
本发明提供的提取燕窝中唾液酸的方法，通过将燕窝酶解液经过两次结晶及离子交换，从而获得高纯度的唾液酸晶体。本发明提供的提取燕窝中唾液酸的方法操作简单，制得的唾液酸收率高，唾液酸晶体纯度高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。