本发明属于黄豆黄苷的技术领域；具体涉及农作物大豆叶黄豆黄苷的提取纯化方法及其用途。
背景技术：
随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，来源于植物的活性因子因其对人类健康具有促进作用而需求逐年增大。此类活性因子无毒副作用，对人体生理代谢以调节为主，受到各国学者的瞩目，其开发利用具有广阔的市场前景。大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次级代谢产物，是一类具有生物活性的黄酮类化合物。大豆异黄酮具有与雌激素相似的结构，又被称为植物雌激素。大豆异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性等，是植物来源的天然抗癌及预防癌症因子。黄豆黄苷是大豆异黄酮的一种糖苷型化合物，在大豆胚芽中含量较高，约占异黄酮总量的40％。文献表明，黄豆黄苷的提取工艺及其健康功效研究报道较少，导致黄豆黄苷的开发利用受到限制。
我国大豆资源丰富，种植面积广泛，因此大豆及其副产物的研制开发具有很大的发展潜力。资料显示，大豆收获后的大豆茎叶在我国的利用率较低，一部分被用作饲料原料，尚不到总产量的30％，大部分被废弃在田间地头，既造成了资源浪费，又导致环境被污染。因此，对大豆叶进行合理利用进而创造价值，具有深远的社会意义。大豆籽实中大豆异黄酮的提取工艺研究已有大量报道，但是大豆叶中大豆异黄酮的提取尤其是单一化合物的提取纯化及其功效研究罕见报道。
技术实现要素：
本发明提供了从大豆叶提取纯化黄豆黄苷的方法，大豆叶黄豆黄苷具有良好的降血脂、降血糖功效。
为解决以上技术问题，本发明通过以下技术方案实现：大豆叶黄豆黄苷的提取纯化方法是按以下步骤进行的：
步骤(1)、将干燥的大豆叶粉碎，过筛，加入10倍重量的去离子水，浸泡至少24h；
步骤(2)、然后超声提取至少20min，再加热萃取，离心除去固形物，获得上清液；
步骤(3)、步骤(2)获取的上清液用石油醚和去离子水进行分液萃取，萃取后水层再次用乙酸乙酯分液萃取，得乙酸乙酯提取物；
步骤(4)、乙酸乙酯提取物经硅胶色谱分离纯化，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，经硅胶薄层色谱检测后合并，经高效液相色谱检测，即得。
进一步地限定，步骤(1)中过60目～80目筛。
进一步地限定，骤(2)中超声提取功率为100～200w。
进一步地限定，步骤(2)所述萃取温度为50℃～80℃，萃取时间为1～2h。
进一步地限定，步骤(2)所述离心转速为1000rpm。
进一步地限定，步骤(3)中石油醚和去离子水的体积比为1:1。
进一步地限定，步骤(3)中水层与乙酸乙酯的体积比为1:1。
进一步地限定，步骤(4)中石油醚/乙酸乙酯按体积比为(4:1→3:1→2:1→1:1)进行梯度洗脱。
大豆叶黄豆黄苷用于制备降血脂、降血糖药品的应用。
本发明的有益效果：
(1)提高大豆茎叶的利用率；
(2)产品纯度高，纯度高达99.9％；
(3)提取工艺简单；
(4)原材料来源丰富、价格低廉；
(5)有利于产品实现商业化。
附图说明
图1是黄豆黄苷的高效液相图；
图2(a)是黄豆黄苷干预对小鼠体重的影响；
图2(b)是黄豆黄苷干预对小鼠体脂肪及脏器重量的影响；
图3(a)是黄豆黄苷干预对血糖值的影响；
图3(b)是黄豆黄苷干预对糖耐量的影响；
图3(c)是黄豆黄苷干预对糖耐量曲线下面积的影响；
图3(d)是黄豆黄苷干预对糖化血红蛋白的影响；
图3(e)是黄豆黄苷干预对胰岛素的影响；
图3(f)是黄豆黄苷干预对胰岛素相对基因表达的影响；
图4(a)是黄豆黄苷干预对肿瘤坏死因子的影响；
图4(b)是黄豆黄苷干预对硫代巴比妥酸反应物的影响；
图5(a)是黄豆黄苷干预对脂肪酸合成酶的影响；
图5(b)是黄豆黄苷干预对固醇调节元件结合蛋白-1cmrna相对表达量的影响；
图6(a)是黄豆黄苷干预对小鼠肝脏病理的影响；
图6(b)是黄豆黄苷干预对小鼠谷胱甘肽水平的影响。
具体实施方式
具体实施方式一、本实施方式中大豆叶黄豆黄苷的提取纯化方法，包括以下步骤：
步骤(1)将干燥大豆叶粉碎，过60目筛，加入10倍重量的去离子水，浸泡24h；
步骤(2)置于功率100w的超声波条件下提取20min，再置于60℃条件下萃取1h，以1000rpm的速率离心除去固形物，获得上清液；
步骤(3)将步骤(2)获得的上清液以石油醚和去离子水(石油醚和去离子水的体积比为1:1)进行分液萃取，萃取后水层再次与乙酸乙酯以体积比1:1分液萃取，得乙酸乙酯提取物；
步骤(4)将步骤(3)获得的乙酸乙酯提取物经硅胶色谱分离纯化，以石油醚-乙酸乙酯(体积比4:1→3:1→2:1→1:1)进行梯度洗脱，洗脱物多次经硅胶薄层色谱检测后合并相同样点接受液，经高效液相色谱比对确认所获得化合物为黄豆黄苷；
其中，步骤(4)高效液相色谱检测条件如下：
色谱柱：develosilc-30-ug-5(4.6i.d.*250mm,野村化学株式会社,日本)，a溶媒15％乙腈。
所得黄豆黄苷高效液相色谱图如图1。
2.验证黄豆黄苷对于c57bl/6j小鼠的体内降血脂、降血糖功效，步骤如下：
(1)雄性c57bl/6j小鼠，平均体重16.5g(5周龄)购于昌盛生物制品公司(中国，长春)。于室温22℃，12h明暗条件下饲喂。试验动物分三组：空白对照组(con)，高脂肪饲喂组(hf)，高脂肪添加黄豆黄苷饲喂组(gly)。饲料组成见表1。
表1饲料成分组成
(2)饲喂期间测量摄食量、饮水量及体重变化，结果见表二。
表2黄豆黄苷干预对小鼠摄食量、饮水量、体重及脏器重的影响
1(体重增长(g)/摄食量(g))。
(3)对血清、肝脏、粪样中各项脂质指标及相关活性酶和脂肪因子进行了检测。
表3黄豆黄苷干预对小鼠血清、肝脏、粪样中各项脂质指标的影响
1((总胆固醇-高密度脂蛋白胆固醇)/高密度脂蛋白胆固醇)。
(4)饲喂15周后，腹腔麻醉，心脏采血制备血清，取肠系膜脂肪、精巢上体脂肪、肝脏、肾脏，－80℃冷冻待用。体重及脏器重见图2，由图2可知，高脂肪饲料饲喂组(hf)小鼠体重、内脏脂肪及脏器重量显著高于对照组(con)，黄豆黄苷干预组(gly)小鼠由于黄豆黄苷的摄入，体重、内脏脂肪及脏器重量得到显著的降低。
(5)饲喂期间测量小鼠空腹血糖值、口服糖耐量，解剖后测量糖化血红蛋白、血清胰岛素及胰岛素基因表达，见图3。由图3可知，hf小鼠的空腹血糖值第9周起显著高于con组，gly组小鼠的空腹血糖值得到了显著的改善，与con组无显著差异。口服糖耐量试验结果表明，gly组小鼠血糖值及口服糖耐量试验曲线下面积均显著低于hf组小鼠。解剖后测量糖化血红蛋白、血清胰岛素及胰岛素基因表达数据与空腹血糖值显示了一致性，gly组小鼠以上各项指标均显著低于hg组小鼠，与con组小鼠无显著差异。
(6)测定血清肿瘤坏死因子(tnf-α)及血清硫代巴比妥酸反应物(tbars)来分析细胞的脂质过氧化产物水平，见图4。由图4可知，hf组小鼠血清tnf-α及tbars水平显著升高，由于gly的干预，gly组小鼠tnf-α及tbars得到显著的改善，与hf组小鼠相比差异显著。
(7)测定血清脂肪酸合成酶(fas)及过氧化物酶体增殖剂激活受体(peroxisomeproliferators-activatedreceptors，ppars)，见图5。由图5可知，gly组小鼠fas及ppars显著低于hf组小鼠，与con组小鼠无显著差异，表明由于gly的摄入，fas及ppars的升高得到了抑制。
(8)肝脏病理切片和还原型谷胱甘肽(gsh)、氧化型谷胱甘肽(gssg)含量测定，见图6。由图6可知，hf组小鼠肝脏病理切片显示了明显的损伤，包括肝脏细胞水肿变性、细胞坏死及细胞浸润。gly干预使小鼠肝脏损伤得到了不同程度的修复，gly组小鼠肝脏gsh指标显著高于hf组小鼠这一试验结果充分支持该组小鼠的肝脏损伤状况得到改善。