本发明涉及农作物基因工程技术领域，具体地说是一种黄瓜cswrky50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用。
背景技术：
黄瓜(cucumissativusl.)葫芦科草本植物，是国际上普遍栽培的蔬菜作物，黄瓜具有多种保健作用，深受人们的喜爱。目前我国主要以温室和大棚栽培为主，由于温室、大棚内特殊的气候条件和连作种植，黄瓜易受到各种病害的侵袭，其中最为严重的有霜霉病、白粉病、灰霉病等。这些病害发病及蔓延速度快，造成产量大幅度的下降，品质变劣，植株早衰等一系列问题。为了解决这一问题，人们通常依靠喷洒大量化学农药来防治黄瓜作物的病害侵袭，但是众所周知，喷洒农药不仅会使病菌产生抗药性，而且会导致黄瓜果实残留大量农药，进而严重威胁食用人群的健康。因此，抗病的优质品种是黄瓜高效生产更经济、环保的途径。
黄瓜霜霉病主要发生在叶片上。苗期发病，子叶上起初出现褪绿斑，逐渐呈黄色不规则形斑，潮湿时子叶背面产生灰黑色霉层，随着病情发展，子叶很快变黄，枯干。成株期发病，叶片上初现浅绿色水浸斑，扩大后受叶脉限制，呈多角形，黄绿色转淡褐色，后期病斑汇合成片，全叶干枯，由叶缘向上卷缩，潮湿时叶背面病斑上生出灰黑色霉层，严重时全株叶片枯死。黄瓜霜霉病是黄瓜栽培中发生最普遍、为害最严重的病害之一。病情来势猛，发病重，传播快，如不及时防治，将给黄瓜造成毁灭性的损失。
目前，挖掘重要的抗逆基因，并应用现代分子生物学技术将抗逆基因与其它优良性状聚合，是获得耐逆性强、抗病性强以及高产、优质黄瓜品种的有效方法之一。对这些胁迫相关基因进行功能研究是开发利用这些基因的前提。而wrky转录因子在植物的生物胁迫、非生物胁迫应答以及生长发育过程中起着至关重要的调控作用。这类转录因子通过与靶基因启动子中特定的dna序列结合，调控位于下游的靶基因转录表达，有的参与信号通路转导。因此，wrky基因及其调控的靶基因都是潜在的重要的抗逆基因，开发其在黄瓜中新的功能并将其应用，是行业内研发人员积极探索的课题之一。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种黄瓜cswrky50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用，以解决目前黄瓜作物在栽种中容易受到霜霉病侵袭从而造成产量下降、施用农药污染严重的问题。
本发明是采用以下技术方案实现的：一种黄瓜cswrky50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用，利用转基因技术，将所述黄瓜cswrky50基因在黄瓜植株中进行过表达，所述黄瓜cswrky50基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。
所述黄瓜cswrky50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用，其具体应用方法为：
(a)利用35s强启动子构建黄瓜cswrky50基因过表达载体；
(b)将含黄瓜cswrky50基因的过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，获得含黄瓜cswrky50基因过表达载体的农杆菌工程菌；
(c)将所述农杆菌工程菌转入到黄瓜植物体内，得到含有过表达黄瓜cswrky50基因的、抗霜霉病的黄瓜植株。
步骤(a)所述黄瓜cswrky50基因过表达载体为pbi121-35s::cswrky50。
一种黄瓜cswrky50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用，在选育抗霜霉病黄瓜品种或品系时，利用基因技术手段检测其植株中黄瓜cswrky50基因的过表达情况，选择黄瓜cswrky50基因过表达量高的植株作为育种的亲本植株。
本发明通过构建黄瓜cswrky50过表达载体在黄瓜植株中过表达，增强了黄瓜对霜霉病的抗性，通过霜霉菌接种实验数据统计分析证明，野生型接种霜霉病后2天，其发病部位背面有水泽状，8天后叶片正面有病斑，严重的部位枯死。而本发明通过过表达黄瓜cswrky50基因后的叶片2天没有任何症状，8天后只有一小块病斑，其大部分仍然是正常的，由此证实了过表达黄瓜cswrky50基因可明显增强黄瓜霜霉病的抗性。本发明的创造性贡献在于首次发现cswrky50基因在黄瓜中过表达可以显著提高黄瓜对霜霉病的抗性，这对黄瓜安全生产具有重要意义。因此，本发明提供的黄瓜cswrky50基因可作为目的基因导入黄瓜植株中，通过改变黄瓜cswrky50基因在黄瓜植株中的表达量、增加了抗性基因的表达，提高了黄瓜霜霉病的抗性，还可在黄瓜育种中，通过基因检测手段，选择过表达黄瓜cswrky50基因的黄瓜植株，从而对抗霜霉病的黄瓜品种进行选育，其应用方法安全、可靠，利用转基因技术，将所述黄瓜cswrky50基因在黄瓜植株中进行过表达。
附图说明
图1为本发明黄瓜cswrky50基因的扩增目的片段图。
图2为本发明的遗传转化过程状态图。
图3为本发明筛选的株系与非转基因对照植株表达量的差异图。
图4为本发明与非转基因对照植株的叶片感霜霉病后不同时间下的表型对比图。
图5为本发明与非转基因对照植株的叶片感霜霉病后不同时间下的表型量化图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，若未特别指明，实施例中的培养基及实验条件均为常规培养基和实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件进行。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1黄瓜cswrky50基因的克隆和过表达载体的构建
(1)黄光品种选新泰密刺为试材。该品种为生长势强，第4～5节着生根瓜，瓜形棒状，匀称，青绿色，刺瘤密，有纵棱，但不明显。将黄瓜种子播于日光温室中，进行普通的栽培管理，待植株开始结瓜时，取嫩叶液氮速冻，采用trizol(购自lifetechnologies公司)提取液的方法提取黄瓜幼嫩叶片的rna，用thermofisher公司的反转录试剂盒进行反转录得到cdna，存于-20℃保存备用。
(2)设计黄瓜cswrky50基因带酶切位点的扩增引物，引物序列及所携带的酶切位点如下(带有下划线的为酶切位点序列)：
(3)以黄瓜叶片的cdna为模板，pcr扩增带酶切位点的cswrky50基因的编码区序列。反应体系如下：
pcr扩增条件如下：
得到了cswrky50基因462bp的片段，如图1所示，进行回收。
(4)回收目的片段：取25μl的pcr扩增产物在质量体积比浓度为1.2％的琼脂糖凝胶中电泳检测，切割目的片段，参照凝胶回收试剂盒(康为世纪)附带的说明书进行操作，得目的基因片段，连接克隆载体peasy上，体系如下：
加入反应液，混匀，于pcr仪中25℃连接30min，得连接产物。
(5)转化及筛选：从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，放置冰上解冻，无菌操作台中将25μl大肠杆菌感受态细胞和5μl的所述连接产物移入1.5ml离心管中，轻轻混匀，冰浴30min；打开水浴锅在42℃水浴中热激90s后立即冰浴2-5min，该操作过程中保持离心管绝对静止；在无菌操作台中加入800μl液体lb，放置于37℃，200rpm摇床上培养45min；12000rpm离心1min，弃上清，用80μl的液体lb悬浮沉淀，将菌液均匀的涂布于含kan(50mg·l-1)的lb平板培养基上，37℃倒置过夜培养至长出单克隆菌落；挑取阳性单克隆送至苏州金唯智公司测序，测序得到含有核苷酸序列如seqidno:1所示的黄瓜cswrky50基因序列。
(6)提取质粒：应用小型质粒提取试剂盒提取阳性质粒(peasy-cswrky50)。分别使用限制性内切酶xholi和saci将阳性质粒(peasy-cswrky50)和植物表达载体pbi121载体进行双酶切验证；37℃恒温酶切30min后回收目的片段。酶切体系如下：
于pcr仪中22℃连接2h。
(7)转化及筛选阳性克隆：采用与步骤(5)相同的方法对连接产物转化及筛选，摇菌，提取，质粒酶切验证，结果得到462bp的如图1大小基本相同的条带，说明pbi121-35s::cswrky50过表达载体构建成功。
(8)制备农杆菌感受态细胞：将农杆菌感受态细胞用接种环于固体lb(含rif50mg·l-1)平板培养基中，培养12h；挑取农杆菌lba4404的单菌落，接种于5ml液体lb(含rif50mg·l-1)中，28℃，220rpm培养过夜；向大的离心管中加入2ml菌液和50ml液体lb(含rif50mg·l-1)中继续培养，至od600约为0.5；将菌液冰浴30min，5000rpm4℃，离心5min，弃上清液；加入10ml冷的灭菌超纯水使菌液悬浮；5000rpm4℃，离心5min，弃上清液；加入1ml冷的灭菌超纯水使菌液悬浮，分装(50μl/管)，得农杆菌感受态细胞，液氮速冻，-70℃保存。
(9)电击转化农杆菌：电转杯首先用质量比浓度为75％的酒精浸泡20-30min，然后在60℃烘箱中30min，紫外灭菌，置于冰上；取出农杆菌感受态细胞，在冰上解冻，向50μl农杆菌感受态细胞菌液中加入10μl的pbi121-35s::cswrky50过表达载体，轻轻混匀；将混合物转移到冰上预冷的电转杯的两电极之间，擦干电转杯外壁，置于管槽中，盖上盖子；打开电转仪电源，设置电击参数(1800v，2s)，电击两次；电击完成后，取出电转杯，并加入800μl液体lb混匀，转移到1.5ml离心管中，28℃，220rpm培养1.5h；将菌液于12000rpm离心1min，倒掉上清液；加入100μl液体lb充分悬浮，并均匀涂布于lb平板培养基上(含50mg·l-1rif；50mg·l-1kan)，28℃倒置培养2d。
(10)阳性克隆的鉴定：挑取单克隆菌落用pcr检测阳性克隆；把阳性克隆单菌落加入含rif50mg·l-1和kan50mg·l-1相应抗生素的5ml液体lb中，28℃，220rmp振荡培养24h，做菌液pcr；得含有pbi121-35s::cswrky50过表达载体的农杆菌工程菌lba4404，再将其置于400μl甘油中，-70℃保存。
实施例2黄瓜cswrky50基因的遗传转化及转基因植株的获得
1、农杆菌介导的黄瓜基因遗传转化
利用含有pbi121-35s::cswrky50过表达载体的农杆菌工程菌lba4404侵染黄瓜子叶并经过分化培养基和生根培养基的筛选后，对得到的再生植株用35s上游引物和基因下游引物进行pcr检测。具体的步骤如下：
(1)选取饱满的黄瓜种子，在水中浸泡1小时左右，如图2中a所示，在无菌台上先用质量比浓度为75％的乙醇消毒30s，再用质量比浓度为4.0％的naclo灭菌13min，最后用灭菌超纯水冲洗3～4次。用高温灭菌镊子将种子播在ms培养基板上，暗培养2天。待发芽长出根，进行子叶的侵染。
(2)切取黄瓜子叶，用镊子分开两片子叶(不带生长点)，放置ms液体中，震荡培养(28℃，220rpm)含有pbi121-35s::cswrky50过表达载体的农杆菌工程菌lba4404；大约12h，离心分离农杆菌，悬浮于ms液体培养基中，进行侵染，时间为13min，放置共培养板，暗培养2d，如图2中的b所示。
(3)共培养2d后，将黄瓜子叶转入分化培养板中(含kan50mg·l-1，cef400mg·l-1)筛选抗性愈伤，7～10d更换一次培养基。
(4)大约15天左右在子叶的两头有绿色愈伤长出，如图2中的c所示，当在愈伤上生出小苗后，进行生根培养，直至大约20～30天根系发育完全，如图2中的d所示。
(5)待根系发育良好后，且长势较好时，打开培养瓶盖往瓶内稍稍倒入一点灭菌水保湿，套上一透明的塑料袋进行炼苗，得到转基因苗。并按照实施例1所述的步骤提取植株叶片dna进行转基因验证。
(6)将转入cswrky50基因的转基因植株移出炼苗，非转基因植株可留取适量作为对照，移入灭菌基质中炼苗，在基质中炼苗时，注意为防止失水，可套上一透明的塑料袋，两天后在塑料袋顶上撕一小口，撕口要逐渐扩大，直至7～10d后炼苗完毕，移至光照培养箱或大田中，常规管理，如图2中的e所示。
2、转基因植株的验证
(1)把配好的ctab放在75℃水浴锅中进行预热。
(2)取1cm叶片放在加有小钢珠的1.5ml的离心管中，用液氮冷冻，用研磨仪粉碎样品30s，向离心管中加入1ml预热的ctab、2μl的巯基乙醇，颠倒混匀放入65℃水浴锅中20-30min，期间轻轻上下颠倒几次。
(3)常温下12000rpm离心10min，取上清700-750μl，加入等体积抽提液(氯仿/异戊醇等于24:1)，剧烈震荡混合。
(4)12000rpm离心10min，取上清移至一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃放置20min。
(5)12000rpm离心5min，弃上清，加入75％乙醇，12000rpm离心5min。
(6)晾干残余乙醇，加60-100μl灭菌水，-20℃保存。
(7)转基因植株pcr验证(包含阳性和阴性对照)反应体系如下：
反应程序为：
通过筛选得到转入cswrky50基因的转基因植株，选取转入cswrky50基因的转基因植株的t2代作为下一步实验植株、非转基因植株同等条件下作为对照植株。
实施例3黄瓜霜霉病抗性试验
(1)黄瓜霜霉病病菌的获得：
从温室采集的含有霜霉病霉层的病叶，用清水冲洗病斑上的霉层后置于培养箱中，20℃、相对湿度90％、黑暗保湿24h，待长出灰色霉层时，将病叶浸泡水中，用毛笔将孢子囊刷入盛有水的试管中，获得分离物。将分离物接种在之前种植的黄瓜感病品种叶片上，叶片置于底部垫有浸水滤纸的大培养皿内，用移液枪吸取接种液，滴于叶片的背面，置于白天22℃、夜间18℃的光照培养箱中，4d～6d可得到布满孢子囊的叶片。接种前用毛笔将孢子囊刷于无菌水的组培瓶中，然后稀释，显微镜下观察孢子囊的数目，使其浓度为1×104孢子每毫升左右。霜霉病处理后2、4、8d取真叶，冲洗干净，吸干水分然后接到处理组和对照组中，
(2)按照上述转基因植株的筛选方法对转基因植株进行筛选并得到转基因t2代植株。提取株系的总rna，用thermofisher公司的反转录试剂盒进行反转录得到cdna，并以之为模板，以特异性半定量引物进行检测，用β-actin基因作为内参基因，利用实时荧光定量pcr方法检测cswrky50基因在不同株系中的表达量。选取表达量高的两个株系分别为oe1和oe2，进行接种试验。
20μl反应体系如下：
反应程序为：
对转基因的各株系的幼嫩叶片取样，检测cswrky50的表达量，发现转基因株系oe-1、oe-2的表达量均显著高于野生型，如图3所示。
(3)分别选取株系oe1和oe2t2植株各8株和野生对照植株8株，采摘生长点下健康的第一片功能叶，采摘叶片大小基本一致，未受任何伤害的叶片各24片，将各处理的叶片放入垫有3层润湿滤纸的大培养皿中，叶茎部用棉花缠绕，进行培养2小时，用点滴法接种含有1×104孢子每毫升左右的霜霉病菌液进行接种，在每片叶片背面滴20ul的溶液，滴三处，在室温下放置2-3小时，放回培养箱(20-26℃，光强1600-1800lx)进行培养，前24h进行暗培养，以有利于病原菌的发育，之后进行保湿处理。
发病后第2天、4天、8天观察，并拍照。其结果见图4。图4是本发明与对照植株的黄瓜叶片接种霜霉病后发病的表型对比图；图5为本发明与非转基因对照植株的发病菌斑面积量化图，图4和图5中横坐标的dpi为dayspostinoculation，表示接种病菌后的天数；纵坐标为菌斑的平均面积，用imagej进行测量叶片菌落直径并进行统计分析。其具体方法为：首先，将黄瓜感病叶片及标尺置于黑布上拍照，使用imagej软件，使用的参数默认，其步骤为：(1)首先双击打开软件，进入file菜单，点击setsale，设定实际大小和照片中的大小，distanceinpixels为照片中的直线长度，knowndistance为实际的直线长度；(2)选择圆形，通过ctrl+m来统计所选择的病斑图形面积；(3)统计后另存为.xlsx文件，进行数据处理，算出平均数和标准误差来作图。由图4和图5统计数据可知，接种2天以及8天后，转基因株系发病速度慢，病斑少，整片叶平翠绿，而非转基因植株发病速度快，病斑面积扩大，第8天的时候整片叶发黄，发病的部位枯黄，有的甚至已经枯死，叶片边缘也发黄，整片叶子均感病。从量化数据的统计图5看到，转入黄瓜cswrky50基因产生过表达的转基因植株的菌斑面积显著小于非转基因对照黄瓜(p＝0.001)，其中株系oe1的抗病性要低于其表达量较大的株系oe2组试验，表明表达量更高的株系oe2对霜霉病的抗性更强。图中wt为非转基因对照黄瓜植株。以上试验结果说明黄瓜cswrky50基因在植株中过表达后对黄瓜霜霉病具有显著的抗性作用，其发病速度慢，发病面积少。此实验设有三次重复，实验结果基本一致。
sequencelisting
<110>山东农业大学
<120>一种黄瓜cswrky50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用
<130>
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>462
<212>dna
<213>黄瓜cswrky50基因
<400>1
atgtcttacaatagtaaccagcacctcactacgtcggagagtgatctttccgagcagccc60
gggttcgagtttacggattggatgtttgatgggtggctgaatgaaaactcttcgtctctg120
actgactcggtgatgtacccagtttatcaagagggggaggttgatgagtttgttgggaac180
accattcagcaaggagagcctagcagcagagactatgggagagagagggaaattagagaa240
agatttgcattcaagacaaaatcagaagttgagattttggatgatggtttcaagtggagg300
aaatatgggaagaagatggtgaagaacagcccaaatccaaggaactactacaaatgctca360
gtcgaaggctgcccagtgaagaagagagtcgaaagagatcgagaggatccaaaatacgtg420
ataacgacgtatgagggtgttcatactcatgaaagctcttga462