本发明涉及一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法，基于该方法制备的基因定点突变试剂盒及其应用的具体实施方案，属于基因工程技术领域。
背景技术：
基于pcr技术的基因定点突变是分子生物学和蛋白质工程中研究基因调控、蛋白质结构与功能必不可少的工具。基因定点突变方式主要包括碱基替换、删除、插入，多位点突变，一个或多个位点的随机突变。许多基于pcr技术的基因定点突变方法已被商业化，其中最普遍使用的方法包括以下几种：
(1)重叠延伸pcr法(overlapextensionmethod)。该方法中使用的正反引物含有互补的重叠区。采用重叠延伸pcr技术扩增获得的产物是一种含有靶突变位点、有开口的、松弛的环状质粒(sunsh,huangh,billyqiyc,qiumsanddaizm.complementaryannealingmediatedbyexonuclease:amethodforseamlesscloningandconditioningsite-directedmutagenesis.biotechnology&biotechnologicalequipment.2015,29(1):105-110)；
(2)大引物pcr法(megaprimermethod)。该方法一般需要三条引物，首先由突变引物和相应的外侧引物进行第一轮pcr反应得到大引物，经纯化后与另一外侧引物进行第二轮pcr获得目的片段(keshandmadison.rapidandefficientsite-directedmutagenesisbysingle-tube‘megaprimer’pcrmethod.nucleicacidsresearch.1997,25(16):3371-3372)；
(3)快速更换法(quickchangemethod(agilenttechnologies,lajolla,ca,usa))。快速更换法是使用一对含有部分或完全互补重叠区的引物，结合pfuturbodna聚合酶扩增环状质粒。pcr指数扩增产生的单链dna分子会在退火时，通过交叉切断单链dna产生环状质粒(xiayz,chuwq,qiqsandxunly.newinsightsintothequikchangeprocessguidetheuseofphusiondnapolymeraseforsite-directedmutagenesis.nucleicacidsresearch.2015,43(2):2-9)。
但这些方法也存在如下不足之处：
(1)当pcr扩增产物浓度低时，突变质粒的构建效率很低；
(2)高保真dna聚合酶具有微弱的链置换反应活性，它可能会引发链置换反应，并将该产物指数扩增放大化；
(3)细胞生物学实验中常用的工具质粒都比较大，比如四环素诱导的基因过表达载体plvx-tight-puro大小为7791bp，荧光素酶报告系统载体pmirglo大小为7350bp。使用一对引物有时难以扩增出上述包含目的基因的重组载体，需要购买价格昂贵、具有长片段扩增能力的高保真酶；
(4)由于使用互补的引物对，上述方法都会受插入或删除片段大小的限制；
(5)大引物pcr进行定点突变，大引物和外侧引物退火温度(tm)必需相差显著，且突变效率不能达到100％。
最重要的是，上述三类方法主要适用于单位点基因突变，而对多位点突变并不有效。为解决这一问题，田静等报道了一种基因定点多位点突变的方法，它是利用引物互补区对有开口的环状质粒模板完成聚合酶链式反应，从而引入多于一个位点的定点突变。但该方法操作繁琐，因为每引入一个突变位点，就要重新加入一对突变引物进行一轮pcr反应(中国专利cn101580829b)。此外，近几年国内外多篇文献报道了一种基于pcr与类型iis限制性内切酶的基因定点突变技术，可以满足多位点基因突变需求。但该方法操作繁琐，需要依次进行pcr、酶切、连接等多步步骤(zhangzq,xuk,xinyandzhangzy.anefficientmethodformultiplesite-directedmutagenesisusingtypeiisrestrictionenzymes.analyticalbiochemistry.2015,476:26-28)。
同源重组(homologousrecombination,hr)是一对同源dna片段交换核苷酸的过程，它是修复dna断裂最主要的方式。同源重组最先用于酵母菌中遗传物质的改造。随后，发现一类噬菌体酶能够独立于细菌体系完成同源重组反应，并被用于质粒、细菌人工染色体和细菌基因组的改造。近年来基于体外同源重组的无缝克隆技术被愈来愈受重视，该方法不受载体和目的片段的酶切位点限制，是一种通过重组酶，在体外直接将目的片段与载体无缝拼接的基因克隆技术。该技术相对传统的基于限制性内切酶与连接酶进行基因克隆的技术，具有快速简便、pcr产物一步定向克隆、灵活的克隆位点和效率高的特点。
综上所述，综合运用无缝克隆技术与重叠延伸pcr技术，建立一种不依赖于限制性内切酶与连接酶，可以快速、高效的在载体的任意位点实现一个或多个位点突变的技术，将是未来最普遍使用的一种基因定点突变技术。
技术实现要素：
本发明的目的：针对现有技术存在的上述不足，基于最新的无缝克隆技术，提供一种快速简便、高效率，可以在载体任意位置实现单位点或多位点、连续或不连续突变的基因定点突变方法
发明内容之一：一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法
本发明所述方法通过在引物5′端同源臂中引入突变位点的方式，同时联合高保真dna聚合酶扩增，制备包含突变位点的质粒片段。然后，通过无缝克隆技术，将2-5个两端含有同源臂的质粒片段进行体外同源重组反应，从而实现单个或多个位点、连续或不连续位点突变。
1.引物设计
(1)引物包含5′端同源臂和3′端延伸区，其中同源臂大小为15-20bp，延伸区大小为0-20bp，突变位点包含在一个同源臂中；
(2)正向和反向扩增引物的tm值最好在55-65℃范围之内，且两者tm差值最好不要超过1℃范围。
2.引物设计示范举例
突变正向引物1和突变反向引物2为一对引物，突变正向引物3和突变反向引物4为一对引物，pcr扩增的两个片段通过无缝克隆技术进行体外拼接，从而构建包含单个位点突变的重组质粒。
发明内容之二：一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法的应用
本发明利用上述基于无缝克隆技术的基因定点突变方法在人源mek1蛋白和一种嵌合型半胱氨酸脱硫酶eh-iscs中，分别引入1个和2个突变位点，测序结果确认突变效率达到100％，说明本发明所述方法稳定可靠、效率高，为实验室提供了一种强有力的基因分析与蛋白质功能研究的常规方法。
发明内容之三：一种基于无缝克隆技术的基因定点突变试剂盒
本发明专利提供一种基于无缝克隆技术的基因定点突变试剂盒，除试剂盒包装、衬垫、试剂管和使用说明书以外，该试剂盒组成成分包括：(1)高保真dna聚合酶预混液；(2)dpni和10×dpnibuffer；(3)无缝克隆酶和5×无缝克隆缓冲液；(4)dmt感受态细胞；(5)对照质粒和对照质粒的通用鉴定引物；(6)无菌ddh2o。
其中所述高保真酶预混液购自以下公司：南京诺唯赞生物科技有限公司，2×phantamastermix，货号p511-01/02/03，2×phantamaxmastermix，货号p515-01/02/03。所述dpni和10×dpnibuffer可分别购自以下公司：宝生物工程(大连)有限公司，quickcuttmdpni，货号1609；碧云天生物技术研究所，dpni，货号d6257。所述dmt感受态细胞、对照质粒和对照质粒的通用鉴定引物由温州医科大学酶工程与医学诊断研究所提供。所述无缝克隆酶和无缝克隆缓冲液可分别购自以下公司：和元生物技术(上海)股份有限公司，clonfast无缝克隆试剂盒；南京诺唯赞生物科技有限公司，同源重组一步克隆试剂盒，货号c112-01/02；南京金斯瑞生物科技有限公司，cloneezpcr克隆试剂盒，货号l00339；clontech，seamlesscloningwithin-fusioncloningkits，货号638911/638918；invitrogen，
本发明所述一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法及其应用，具备以下创新点和技术优势：
1.对于单位点突变载体的构建，采用两对引物扩增目的载体，其中一条正向引物和反向引物的互补同源臂中含突变位点碱基，适用于对5kb以上载体进行定点突变，克服了一对引物扩增5kb以上载体存在成功率和保真性不确定的缺陷；
2.对于多位点突变载体的构建，在实现单位点突变需要两对引物的基础上，每增加一个突变位点，就增加一对突变引物。扩增出的多个片段，通过体外同源重组反应，可实现一步无缝拼接完成多位点突变，无需进行多轮pcr扩增。
技术效果：
1.基于无缝克隆技术的基因定点突变方法，可以在载体任意位置实现单位点或多位点、连续或不连续突变；
2.dpni消化体外降解甲基化非突变型质粒模板，dmt感受态细胞体内降解甲基化非突变型质粒模板，从而确保突变效率达到100％。
附图说明
图1.基于无缝克隆技术的基因定点突变(一个或多个位点)示意图；
图2.pcr扩增目的质粒mek1-pcoldi产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；拟突变位点碱基位于引物的同源臂中；m:dl5000marker；lane-1:片段1(2898bp)；lane-2:片段2(2700bp)；
图3.采用pcoldi质粒通用鉴定引物扩增mek1(q56p)-pcoldi/dh5α阳性克隆菌株pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；m:dl5000markrer；lane-1-12:pcr扩增mek1(q56p)-pcoldi/dh5α阳性克隆菌株目的基因产物(1601bp)；
图4.pcr扩增目的质粒eh-iscs-pcold-sumoa产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；拟突变位点碱基位于引物的同源臂中；m:dl5000marker；lane-1:构建eh-iscs(k206a)-pcold-sumoa质粒的片段1(3235bp)；lane-2:构建eh-iscs(k206a)-pcold-sumoa质粒的片段2(2416bp)；lane-3:构建eh-iscs(c329s)-pcold-sumoa质粒的片段1(2791bp)；lane-4:构建eh-iscs(c329s)-pcold-sumoa质粒的片段2(2858bp)；
图5.采用pcold-sumoa质粒通用鉴定引物扩增eh-iscs(k206a)-pcold-sumoa/dh5α和eh-iscs(c328s)-pcold-sumoa/dh5α阳性克隆菌株pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。m:dl5000marker；lane-1-4:pcr扩增eh-iscs(k206a)-pcold-sumoa/dh5α阳性克隆菌株目的基因产物(1892bp)；lane-5-9:pcr扩增eh-iscs(c329s)-pcold-sumoa/dh5α阳性克隆菌株目的基因产物(1892bp)。
图6.mek1(q56p)-pcoldi质粒定点突变测序结果；
图7.eh-iscs(k206a)-pcold-sumoa质粒定点突变测序结果；
图8.eh-iscs(c329s)-pcold-sumoa质粒定点突变测序结果；
图9.基于无缝克隆技术构建基因定点突变重组质粒的原理示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1.一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法的应用例一
1.构建mek1蛋白的第56位谷氨酰胺残基突变为脯氨酸的mek1(q56p)-pcoldi重组质粒
mek1是ste7激酶家族中一个双特异性蛋白激酶。经raf,mos和cot激酶磷酸化修饰后活化，具有激酶活性的mek1会使erk1和erk2蛋白结构域的活化环中苏氨酸-谷氨酸-酪氨酸基序的苏氨酸和酪氨酸残基发生磷酸化。mek1是map激酶信号转导途径中一个必需的成分，该信号转导途径与多种细胞的生物过程有关，比如，细胞增殖、细胞分化、转录调控和发育。据文献报道，将mek1蛋白的第56位谷氨酰胺残基突变为脯氨酸，可组成性活化mek1蛋白，使其不需要上游激酶的磷酸化修饰激活就具有激酶活性。
mek1-pcoldi质粒由温州医科大学酶工程与医学诊断研究所提供。
1.1扩增目的质粒片段
1.1.1pcr反应体系及条件如下所示：
(1)扩增构建mek1(q56p)-pcoldi定点突变质粒的f1r1片段
备注：引物1和引物2浓度为10μm。pcr反应条件：
(2)扩增构建mek1(q56p)-pcoldi定点突变质粒的f2r2片段
备注：引物3和引物4浓度为10μm。
pcr反应条件：
1.2dpni酶切消化甲基化质粒模板
酶切体系及条件如下：
37℃孵育1小时或更长时间。
1.3胶回收
经dpni酶切消化的pcr产物以1％低熔点琼脂糖凝胶电泳进行胶回收，并用du-800核酸/蛋白分析仪测定回收产物浓度。
1.4无缝克隆构建突变型载体
1.4.1无缝克隆反应体系及条件如下：
37℃孵育30min，冰上放置5min。
1.4.2pcr片段使用量的计算方法
进行无缝克隆时，长片段和短片段的摩尔数比一般为1：2。pcr片段使用量的计算方法如下：
pcr片段的使用量(ng)＝nmol数×660×pcr片段的bp数
1.5转化
(1)将10μl无缝克隆反应液加入到100μldh5α感受态细胞中，手指轻弹混匀，冰上孵育30min；
(2)42℃水浴热激90秒，冰上放置2-3min；
(3)加入900μl于37℃预热的lb液体培养基，37℃、200rpm孵育45min；
(4)4000rpm离心5min，弃掉900μl上清，用剩余培养基重悬菌体，并均匀涂布于相应抗性的lb平板上，37℃倒置培养过夜。
1.6阳性克隆的鉴定
取一个新鲜的含相应抗生素的lb平板，用记号笔划分为16个小格。用接种针挑取上述转化平板上单菌落少许分别划线接种于每个小格中，37℃恒温培养箱中倒置培养10h。用枪头分别挑取平板上各小格中生长的菌体少许，混于含50μl无菌水的ep管中，100℃煮10min，12000rpm、离心5min后，取上清9.2μl加入200μlpcr反应管中作为pcr鉴定模板。并取以下体系加入该管中，混匀。
pcr反应条件：
取5μlpcr产物以1.0％的低熔点琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.7测序
挑选两个菌落pcr鉴定正确的阳性克隆菌株进行测序鉴定。实
1.8验结果：
如图2所示，pcr扩增构建mek1(q56p)-pcoldi质粒的片段1大小为2898bp，片段2大小为2700bp，与预期结果一致；采用pcoldi质粒通用鉴定引物扩增mek1(q56p)-pcoldi/dh5α阳性克隆菌株pcr产物大小为1601bp，其中mek1基因大小为1182bp，采用通用鉴定引物扩增pcoldi空载体的pcr产物大小为419bp。从图3可以看出，菌落pcr鉴定产物大小与预期结果一致，初步判断mek1(q56p)-pcoldi质粒构建成功；进一步测序验证表明，挑选的阳性克隆菌株中包含的质粒为成功发生位点突变的mek1(q56p)-pcoldi质粒，突变位点测序结果如图6所示。
实施例2.一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法的应用例二
eh-iscs是一种嵌合型半胱氨酸脱硫酶，它是通过融合大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶iscs蛋白的n端结构域(1-263位氨基酸)与人源半胱氨酸脱硫酶nfs1蛋白的c端结构域(316-457位氨基酸)构建而成。eh-iscs相对nfs1，蛋白稳定性增强，且不需要辅助蛋白就具有半胱氨酸脱硫酶活性。
eh-iscs-pcold-sumoa质粒由温州医科大学酶工程与医学诊断研究所提供。
1.构建eh-iscs蛋白的第206位赖氨酸突变为丙氨酸的eh-iscs(k206a)-pcold-sumoa重组质粒
1.1扩增目的质粒片段
1.1.1pcr反应体系及条件如下所示：
(1)扩增构建eh-iscs(k206a)-pcold-sumoa定点突变质粒的f1r1片段
备注：引物1和引物2浓度为10μm。
pcr反应条件：
(2)扩增构建eh-iscs(k206a)-pcold-sumoa定点突变质粒的f2r2片段
备注：引物3和引物4浓度为10μm。
pcr反应条件：
1.2构建eh-iscs(k206a)-pcold-sumoa质粒的后续实验方法与步骤同本发明实施例3中1.2至1.7实验步骤所述。
2.构建eh-iscs蛋白的第329位半胱氨酸突变为丝氨酸的eh-iscs(c329s)-pcold-sumoa重组质粒
2.1扩增目的质粒片段
2.1.1pcr反应体系及条件如下所示：
(1)扩增构建eh-iscs(c329s)-pcold-sumoa定点突变质粒的f1r1片段
备注：引物1和引物2浓度为10μm。
pcr反应条件：
(2)扩增构建eh-iscs(c329s)-pcold-sumoa定点突变质粒的f2r2片段
备注：引物3和引物4浓度为10μm。
pcr反应条件：
2.2构建eh-iscs(c329s)-pcold-sumoa质粒的后续实验方法与步骤同本发明实施例3中1.2至1.7实验步骤所述。
3.实验结果：
如图4所示，pcr扩增构建eh-iscs(k206a)-pcold-sumoa质粒的片段1大小为3235bp，片段2大小为2416bp。pcr扩增构建eh-iscs(c329s)-pcold-sumoa质粒的片段1大小为2858bp，片段2大小为2791bp，与预期结果一致；采用pcoldi质粒通用鉴定引物扩增eh-iscs(k206a)-pcold-sumoa/dh5α和eh-iscs(c329s)-pcold-sumoa/dh5α阳性克隆菌株pcr产物大小都为1892bp，其中eh-iscs基因大小为1197bp，采用通用鉴定引物扩增pcold-sumoa空载体的pcr产物大小为695bp。从图5可以看出，菌落pcr鉴定产物大小与预期结果一致，初步判断eh-iscs(k206a)-pcold-sumoa和eh-iscs(c329s)-pcold-sumoa质粒构建成功；进一步测序验证表明，挑选的阳性克隆菌株中包含的质粒为成功发生位点突变的eh-iscs(k206a)-pcold-sumoa和eh-iscs(c329s)-pcold-sumoa质粒，突变位点测序结果分别如图7和图8所示。
实施例3.一种基于无缝克隆技术的基因定点突变试剂盒
1.一种基于无缝克隆技术的基因定点突变试剂盒说明书
1.1试剂盒简介
本基因定点突变试剂盒采用两对引物扩增目的基因，其中两条引物含突变位点碱基，适用于对5kb以上质粒进行定点突变。克服了使用普通高保真酶时，一对引物扩增5kb以上质粒存在成功率和保真性不确定的缺陷；扩增产物采用无缝克隆技术构建环状含突变位点质粒，阳性克隆率大于90％；dpni消化，体外降解甲基化非突变型质粒模板，dmt感受态细胞体内降解甲基化非突变型质粒模板，从而确保突变型质粒阳性克隆率达100％。
1.2应用范围
dna定点突变(原始质粒模板需使用无甲基化酶缺陷的宿主菌扩增，如dh5α、top10和xl10菌株)
1.3定点突变原理
如图9所示。
1.4试剂盒成分
*使用对照质粒构建定点突变质粒，突变型质粒阳性克隆率＞90％
1.5使用步骤说明
1.5.1扩增目的质粒片段
1.5.1.1推荐pcr反应体系及条件如下所示：
1.5.1.2pcr反应条件：
1.5.2电泳检测
取2μlpcr产物，1％低熔点琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5.3dpni酶切消化甲基化质粒模板
酶切体系及条件如下：
37℃孵育1小时或更长时间。
1.5.4胶回收
经dpni酶切消化的pcr产物以1％低熔点琼脂糖凝胶电泳进行胶回收，并用du-800核酸/蛋白分析仪测定回收产物浓度。
1.5.5无缝克隆构建突变型载体
1.5.5.1无缝克隆反应体系及条件如下：
37℃孵育30min，冰上放置5min。
注意事项：无缝克隆反应液如不立即用于转化，可置于-20℃长期保存；如需同时构建多个载体，可以使用八连管或96孔板进行高通量操作。
1.5.5.2pcr片段使用量的计算方法
进行无缝克隆时，长片段和短片段的摩尔数比一般为1：2。pcr片段使用量的计算方法如下：
pcr片段的使用量(ng)＝nmol数×660×pcr片段的bp数
1.5.6转化
(1)将10μl无缝克隆反应液加入到100μldmt感受态细胞中，手指轻弹混匀，冰上孵育30min；
(2)42℃水浴热激90秒，冰上放置2-3min；
(3)加入900μl于37℃预热的lb液体培养基，37℃、200rpm孵育45min；
(4)4000rpm离心5min，弃掉900μl上清，用剩余培养基重悬菌体，并均匀涂布于相应抗性的lb平板上，37℃倒置培养过夜。
1.5.7阳性克隆的鉴定
取一个新鲜的含相应抗生素的lb平板，用记号笔划分为16个小格。用接种针挑取上述转化平板上单菌落少许分别划线接种于每个小格中，37℃恒温培养箱中倒置培养10h。用枪头分别挑取平板上各小格中生长的菌体少许，混于含50μl无菌水的ep管中，100℃煮10min，12000rpm、离心5min后，取上清9.2μl加入200μlpcr反应管中作为pcr鉴定模板。并取以下体系加入该管中，混匀。
1.5.7.1pcr反应条件：
取5μlpcr产物以1.0％的低熔点琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.5.8测序
挑选两个菌落pcr鉴定正确的阳性克隆菌株进行测序鉴定。
1.5.9试剂盒保存条件
dmt感受态细胞置于-70℃保存半年，其它成分置于-20℃保存一年。
对于本领域技术人员而言，可以根据上述实施方案加以改进或变换本发明，而所有这些改进或变换都应属于本发明权利要求的保护范围。