本发明属于功能性蛋白筛选技术领域，具体涉及一种用于病害防治的高活力蛋白的构建方法与应用。
背景技术：
高丝氨酸内酯(n-acylhomoserinelactones,ahls)作为一种群体感应(quorumsensing,qs)信号分子，常出现于革兰氏阴性菌中，调控其诸多行为，特别是致病因子的表达、毒素的产生、生物被膜的形成等。群体感应淬灭酶(quorumquenchingenzyme,qq酶)可以阻断qs信号通路，因其不会对致病菌造成生存压力，不易使其产生耐药性，已经受到研究者越来越多的重视。qq酶有望将其作为一种新型环境友好型生物防治手段，被广泛应用于水产养殖，农作物种植等领域。
蛋白分子的定向进化是一种有效改造蛋白质的分子生物学手段，特别是优化新型酶方面。这一过程不需事先了解酶的空间结构和催化机制，而是在实验室里模拟自然界的突变、进化过程，通过易错pcr、辐射诱变等方法，对蛋白进行随机诱变。然后根据不同蛋白的筛选方法，设定合适的高通量筛选方法，筛选出目的菌株，进而得到想要的突变蛋白。定向进化是改进蛋白功能与活性的有效手段，可以在不清楚蛋白质结构的情况下，得到具有预期特性的新蛋白质。
因此这一技术在蛋白质工程中具有重要意义，其应用的领域逐渐扩大，遍及工、农、医、食品等各方面。自上世纪70年代开始，在实验室内完成蛋白质的定向进化已经形成了一个较完整的系统(halletal.,1973)。较早的经典例子是在大肠杆菌中进行的，将没有β-半乳糖苷酶活性的ebga蛋白“进化”出类似的活性来代替lacz基因的功能(campbelletal.,1973)。经过几十年的发展，该技术不仅日渐成熟，并且能够创造出令人惊叹的成果：在2016年，研究者利用定向进化技术成功的在海洋红嗜热盐菌(rhodothermusmarinus)的细胞色素c中引入了碳-硅键，这是在生物体内从未出现过的化学键(jenniferetal.,science,2016)。
随机蛋白突变库的构建和突变蛋白的高效筛选是定向进化过程中的两个关键步骤。虽然经过几十年的发展，但是这两个关键步骤仍然是影响蛋白定向进化技术广泛应用的瓶颈因素。
目前建库的方法有很多，较常见的是易错pcr(error-pronepcr)、dna改组(dnashuffling)、交错延伸(staggerextensionprocess,step)、体外随机引发重组(random-priminginvitrorecombination,rpr)等，但是这些方法都有各自的缺陷，如突变效率低，突变库蛋白不够充足等问题。
而在蛋白筛选阶段，如何快速高效地从数量繁多的蛋白突变库中找到目标突变体是制约完成定向进化全部流程的瓶颈。概括来说，常见的筛选方法有：
(1)平板法：平板法是基于菌落周围的底物被酶水解而产生的透明圈或颜色圈来进行筛选的，酶的活性与透明圈或颜色圈的大小呈一定的正相关。
(2)比色法：基于某些基团或化合物能够吸收一定波长的光或在特定波长光的激发下产生突光，然后通过分光光度计或酶标仪等仪器进行检测。针对不同的酶必须制定不同的筛选方法，好的筛选方法对于节省时间具有重要意义。尤其是新领域的酶，可以借鉴的方法较少，高通量策略更是鲜有报道。该方法虽然快捷，但是需要借助流式细胞仪等设备，容易受条件限制。且高通量筛选最主要的困难在于如何将目标基因、基因编码的酶及反应的产物有机联系起来。
技术实现要素：
本发明提供一种新型的高通量快速的蛋白定向进化方法，使建库效率得到极大提高。应用该方法，以海洋来源的群体感应淬灭酶moml为研究对象，快速地成功获得两个高活力突变蛋白，寻找到7个未被报道的活性位点，并探究了moml以及高活突变蛋白对pcc导致的植物软腐病的防治效果，表明其在病害防治方面具有良好的应用前景。
本发明所提供的用于病害防治的高活力蛋白的构建方法，包括如下的步骤：
1)首先设计易错pcr引物，并且在易错pcr过程中选择合适的mg2+和mn2+浓度，获得易错pcr的产物；
最终确定用于易错pcr的mg2+终浓度为2mm，mn2+终浓度为0.15mm；
所述的高活力蛋白为moml蛋白，其中易错pcr引物的序列信息如下：
上游引物moml-f：5’-agaaggagatatacatatgaaaaaggaagctgcag-3’(seqidno:7)
下游引物moml-r：5’-tggtggtggtggtgctcgagttgtaaatagttggg-3’(seqidno:8)；
2)通过连接液将易错pcr的产物与相应的载体相连接，构建重组表达质粒；
所述的载体，优选为线性化载体pet-24a(+)载体；
3)以cv026为报告菌株，将转化后的菌落转印到iptg-cv026筛选平板上，培养后筛选产生透明圈的重组菌株，其中透明圈的大小可间接反应各个突变蛋白的ahl内酯酶活性高低；
所述的iptg-cv026筛选平板，其制备方法如下：将cv026接种于lb液体培养基中，于28℃震荡培养10～12h后放于室温下待用，然后配置1％琼脂的lb半固体培养基，121℃，20min湿热灭菌后，待其冷却至40℃左右，每15mllb半固体培养基中加入1mlcv026菌液、7.5μl1mm的c6-hsl以及终浓度为0.5mm的iptg，混匀后倒平板，冷却完成制备。
4)对筛选出的突变蛋白进行测序，获得突变蛋白的序列。
应用上述方法筛选获得的moml突变蛋白.moml-1，其氨基酸序列为seqidno:3；编码基因的核苷酸序列为seqidno:4；
另外一种moml突变蛋白.moml-2，其一种的氨基酸序列为seqidno:5；编码基因的核苷酸序列为seqidno:6.
将上述筛选所获得的moml突变蛋白用于治疗pcc侵染的植物，观察其对植物软腐病的防治效果；
本发明提供了一种新型的高通量快速的蛋白定向进化方法，使建库效率得到极大提高。应用该方法，以海洋来源的群体感应淬灭酶moml为研究对象，快速地成功获得两个高活力突变蛋白，并寻找到7个未被报道的活性位点，并探究了moml以及高活突变蛋白对pcc导致的植物软腐病的防治效果，表明其在病害防治方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1：本发明无缝克隆原理示意图
图2：本发明所提供高通量“iptg原位影印法”流程图
图3：本发明所述“iptg原位影印法”筛选效果展示
图4：moml及其高活突变体相对酶活
图5：定点突变构建的单突变蛋白相对酶活
图6：已发表ahl内酯酶与moml序列比对
图7：moml及其高活突变蛋白对pcc存活率的影响
图8：dns法测定多聚半乳糖醛酸酶含量
图9：moml及其高活突变蛋白对pcc侵染大白菜实验结果a.阳性对照：仅pcc侵染；b.moml处理后侵染；c.moml-1处理后侵染；d.moml-2处理后侵染
具体实施方式
本发明通过在pcr过程中调整mg2+和mn2+浓度等因素，提高taq酶在扩增过程中引入错配碱基的频次，从而提高目标基因的扩增产物发生适量的几率。
传统的克隆表达通常是先将pcr产物与t载体相连。在连接酶的作用下，t载体和pcr产物进行t-a配对，形成含有目的片段的环状重组质粒。用同样的限制性内切酶，双酶切含有目的片段的环状t载体以及表达载体(如pet-24a(+))。回收t载体上的小片段(目的片段)和表达载体上的大片段(线性化的表达载体)，在连接酶的作用下，形成重组表达质粒。该方法虽然能提高连接效率，但是通常需要1～2周左右才能完成，而本发明提供的方法仅需2～3天。
本发明用“无缝克隆”也称“吉布森(gibson)组装”，该方法可以用于拼接多个线性片段，也可以将目的片段插入载体任意位置，且不受酶切位点限制。“无缝克隆”的实质是两次同源重组，其原理图见图1。在对目的片段(模版)进行扩增，设计易错pcr引物时，除了要设计模版的特异性序列外(常规引物)，还要在5’-端设计一段10～20bp与线性化表达载体两端同源的序列(同源臂)。这样，易错pcr产物的两端和线性化载体的两端便是同源的，在无缝克隆连接液的作用下，经过两次同源重组，目标基因便可直接连到载体上，形成完整的环状质粒，即重组表达载体。
另一方面，本发明在筛选平板中直接添加适量的iptg，直接诱导突变蛋白表达并发生显色反应，可以高通量筛选目的蛋白。
本发明提供的iptg原位影印法主要应用于ahl内酯酶moml突变文库高活突变体的筛选，但不限于此。该方法所用报告菌cv026是紫色色杆菌(chromobacteriumviolaceum)atcc31532的ahl合成酶基因(cvil)的突变株，用于检测短链(c4-c8)的ahl分子。其操作流程图见图2。该方法是用“印章”将转化后的菌落转印到iptg-cv026筛选平板相应位置，培养一段时间后观察透明圈的产生情况。由于工程菌产生的ahl内酯酶能够降解平板中的ahl分子，实验样品周围的cv026因缺失ahl的诱导而不能产生紫色色素，从而使实验样品周围产生透明圈。因此筛选平板上透明圈的大小可间接反应各个突变蛋白的ahl内酯酶活性高低。
申请人所在的实验室从海洋耐油具柄菌(muricaudaolearia)th120中分离鉴定出一个新型群体感应淬灭酶moml(其氨基酸序列为seqidno:1，编码基因的序列为seqidno:2)，具ahl强降解活性。因其特有的信号肽序列，推测其可能代表一种新型海洋ahl内酯酶。本发明将以moml为研究对象，对其进行定向进化研究，并探究野生型和突变型moml蛋白在胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种(pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum，简称pcc)导致的植物软腐病中的防治效果，推测其在病害防治方面具有良好的作用效果，为其在病害防治方面的应用提供理论基础。
本发明以海洋来源群体感应淬灭酶moml为研究对象，通过本发明所述方法对其进行定向进化研究，快速地成功获得两个高活力突变蛋白，并寻找到7个未被报道的活性位点。对moml以及高活突变蛋白moml-1，moml-2进行实验，以防治致病菌pcc导致的植物软腐病为例，探究野生moml及其高活突变蛋白moml-1，moml-2在病害防治中的防治效果。首先，对与moml及moml-1，moml-2培养后的pcc的存活率进行测定，结果显示：pcc与moml及moml-1，moml-2共培养后，pcc的存活率均有所下降，且后两者的下降趋势更明显，表明其显著影响pcc的存活率。随后对moml及moml-1，moml-2对pcc主要致病因子的影响进行测定，即测定共培养后培养基中多聚半乳糖醛酸酶的含量，结果显示：moml及moml-1，moml-2都可以显著降低pcc多聚半乳糖醛酸酶的表达量，对pcc主要致病因子有明显的抑制作用。通过moml及moml-1，moml-2对pcc植物(白菜)侵染力的影响的实验发现，pcc与moml及moml-1，moml-2共培养后，pcc的侵染能力明显下降，而pcc与moml-1，moml-2共培养后侵染能力下降比moml更加明显，说明moml及其高活突变蛋白moml-1，moml-2具有明显的抑制pcc致病的效果，可以将其进一步应用于多种植物病害防治。
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：高通量快速的蛋白定向进化方法
1)易错pcr条件确定
利用软件primerpremier5设计易错pcr引物moml-f，moml-r，引物包括两部分，5’-端19～20bp与表达载体pet-24a(+)的同源序列(分别含有限制性内切酶ndei和xhoi酶切位点)，以及3’-端moml基因特异性序列，设计原则同一般pcr：
moml-f：5’-agaaggagatataca↓tatgaaaaaggaagctgcag-3’
moml-r：5’-tggtggtggtggtgc↓tcgagttgtaaatagttggg-3’
pcr反应体系如表1所示，本例中的dntp*是按照datp、dgtp2.5mm，dctp、dttp10mm的比例配置的。pcr反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
表1pcr反应体系
为确定合适的错配率，首先单因素实验，分别设置mg2+1～8mm，mn2+0～0.6mm浓度梯度；根据核酸电泳结果进行双因素实验，在同一个反应体系同时添加以上两种离子。将每个易错pcr反应条件得到的单克隆测序后与moml对比，结果见表2。定向进化研究最终的突变频率应控制在1～2个氨基酸，考虑到无效突变，对应突变频率为3～5个碱基。因此最终确定用于易错pcr的mg2+终浓度为2mm，mn2+终浓度为0.15mm。
2)用易错pcr对目的片段进行扩增
按实施例1所述，确定好易错pcr的反应条件后，对moml基因进行扩增。为提高无缝克隆同源重组效率，利用高保真酶
3)线性化表达载体的制备
将载体线性化通常有两种方法：一、pcr法：以环状表达载体质粒为模版，利用长片段扩增酶扩增。该方法可任选插入位点，不受限制性内切酶限制。二、双酶切：用两种限制性内切酶处理环状质粒，回收线性化的载体。相比pcr直接扩增，该方法在转化后造成假阳性的概率低。本例用双酶切法：制备pet-24a(+)质粒，用限制性内切酶ndei和xhoi双酶切处理，37℃孵育10min。酶切后立即通过琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收5000bp左右的条带，即可得到线性化的表达载体pet-24a(+)，其两端与目的片段两端同源。
4)用无缝克隆构建moml突变质粒
测定纯化后的moml突变片段以及线性化载体pet-24a(+)的浓度，按照等摩尔比共5～10μl混合后，加入15μl无缝克隆连接液混匀。25℃静置15min后，50℃金属浴孵育1h。无缝克隆连接液的配置如表3所示，
表3无缝克隆连接液配方
其中的5×buffer配置如表4所示：
表4无缝克隆连接液中5×buffer配方
5)moml突变文库的构建
将实施例4得到的moml重组突变质粒立即转化入大肠杆菌e.colibl21(de3)感受态细胞中，涂于含有50μg/ml的卡那霉素的lb平板上，37℃培养12～15h即得到moml突变菌株。
6)“iptg原位影印法”对moml突变文库进行筛选
本例检测所用ahl内酯酶底物为c6-hsl。
制备iptg-cv026筛选平板：将cv026菌株接种于lb液体培养基中，于28℃震荡培养10～12h后放于室温下待用，不可放置于4℃。配置1％琼脂的lb半固体培养基，121℃，20min湿热灭菌后，待其冷却至40℃左右，每15mllb半固体培养基中加入1mlcv026菌液、7.5μl1mm的c6-hsl以及终浓度为0.5mm的iptg，混匀后倒平板。
待平板凝固后，用“印章”将实施例5中转化后的moml重组突变工程菌母平板上的菌落尽可能多的转印到iptg-cv026筛选平板上，一个母平板可多印几个子平板。28℃静置培养8～12h。子平板上透明圈的大小可间接反应母平板上各菌株降解ahl信号分子的能力。部分筛选结果见附图3。
用该方法快速高效地筛选到多株具有高活力的突变体，将其中两个活力最高的突变株命名为moml-1，moml-2；除此以外，我们还得到了几株ahl内酯酶活性显著降低的突变株。测序后发现其中两株提前终止，两株发生了移码突变，均无活性；剩余三株有2～3个氨基酸发生了变化。用“定点突变”构造单突变体，对多点突变体的突变位点逐一进行研究。
实施例2：以moml为参考，对各个突变体的酶活进行测定
通过检测ph指示剂颜色变化反应底物c6-hsl的减少量，所用ph指示剂为溴百里酚蓝(bromothymolblue,btb,pka＝7.1)，反应缓冲液为mops(pka＝7.2)两者的pka相差不大且近中性。按表5配置反应体系，混匀后立即用酶标仪在630nm下测量初始od值，在25℃下反应，用秒表计时，反应相同时间后测od630，每个实验组设置三个平行。以momlod630的降低量为100％。
表5测moml酶活反应体系
最终筛选获得了moml-1，moml-2两个蛋白突变体，其中moml-1的氨基酸序列为seqidno:3；编码基因的核苷酸序列为seqidno:4；
moml-2的氨基酸序列为seqidno:5；编码基因的核苷酸序列为seqidno:6。
相比moml，moml-2，moml-1其酶活提高了10％～30％(图4)。
对于多个氨基酸发生变化的菌株，用定点突变构建单点突变菌株，对这些位点逐一研究，用测定相对酶活的方法探究这些点对moml催化反应的影响，结果见附图5。定点突变的结果显示，glu238突变后，moml几乎完全失活；lys205，leu254突变后，其酶活为野生型的20％以下；lys82，asn179突变后，其酶活为野生型的50％左右；asn51，met228突变后，其酶活影响不那么显著，考虑到该检测体系带来的误差，推测可能不是关键位点。
从ncbi下载其他已发表金属-β-内酰胺酶家族的ahl内酯酶氨基酸序列，做多序列比对，结果见附图6。其保守的结构域“hxhxdh～60aa～h”用红框标示。将moml-1，moml-2中，以及酶活变化较大的位点用“△”也标注在图中。由图可以看出，moml-1中149val变成ala，moml-2中144ile变成val，149val位于蛋白质表面，144ile位于蛋白质内部，改变前后氨基酸性质相似，都是疏水性氨基酸，但r基的改变可能会对蛋白质内部空间结构有所改变，导致突变moml酶活升高。238glu变成gly，突变的moml完全失活。238glu位于蛋白质表面，从酸性氨基酸变中性，亲水变疏水，可能会使蛋白质结构发生变化，进而影响其酶活；205lys变成glu，moml酶活仅剩10％左右，205lys位于蛋白质内部距离催化位点较近的β折叠区域，碱性氨基酸变酸性。254leu变成arg，突变体的酶活不到野生型15％，254leu位于蛋白质表面α螺旋末端，疏水氨基酸变亲水，可能会影响蛋白稳定性。82lys变成arg或者179asn变成ser，突变蛋白的酶活为原来的50％左右，这两个位点分别位于蛋白质表面，猜测其与维持蛋白质结构相关。
ile144、val149、asn179、lys205是其保守的结构域内的可变氨基酸，可能与催化反应直接相关，而lys82、glu238、leu254是保守结构域外的氨基酸，可能与维持蛋白稳定性有关。综上，val149、ile144、glu238、lys205、leu254、lys82、asn179在moml催化反应起重要作用。
实施例3：moml及其高活突变蛋白对pcc存活率的影响
植物细菌性软腐病严重影响经济作物和花卉等植物的生长，造成严重的经济损失。在雨季种植的萝卜一旦染上软腐病，损失会达到8％～30％，而且感染的范围从热带至温带都有分布。其主要致病菌为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(pcc)，曾用名为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(erwiniacarotovorasubsp.carotovora)。pcc是一种革兰氏阴性菌，信号分子为ahl类(eberhardetal.,1981)。当菌体种群数较少时，环境中的信号分子浓度低，细菌的群体感应系统不能启动，致病因子不会被表达；随着菌体种群数量的增长，环境中的信号分子达到一定浓度阀值，ahl分子分别与菌体内的expr，carr等受体蛋白结合，促进致病胞外酶的表达，碳青霉稀抗生素的产生。这些胞外酶与碳青霉稀抗生素的产生是胡萝卜软腐杆菌侵入寄主并繁衍种群的关键步骤(perombelonetal.,1980；tothetal.,2005；williamsonetal.,2002)。
将活化好的pcc按1％的接种量接种于lb液体培养基中，充分混匀，平行分装于四支灭菌试管中，在各个试管中加入等量的moml，moml-1，moml-2酶液，对照组加等量的酶储藏液。将每组的pcc菌液，28℃，170rpm震荡培养24h后，梯度稀释后取10-4～10-6倍稀释的菌液涂于lb平板上，28℃培养箱培养15h。对平板上的单菌落计数，以pcc平板上的菌落数为100％，结果如图7。实验结果表明，pcc与moml及moml-1，moml-2共培养后，pcc的存活率分别下降了约50％，75％和70％，并且后两者的下降趋势更明显。
实施例4：moml及其高活突变蛋白对pcc主要致病因子的影响
pcc主要是利用各种植物细胞壁降解酶来侵染寄主植物，如：果胶酶，纤维素酶，蛋白酶，木聚糖酶等。其中，果胶酶被认为是最主要的致病因子。本例我们主要研究的是多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,peh)，该酶通过引入水分子水解断裂多聚半乳糖醛酸酶的氧桥，其水解产物为半乳糖醛酸(张飞等，2004)。由于多聚半乳糖醛酸酶是胞外水解酶，因此取实施例3中培养后的菌液4℃离心收集上清，即为多聚半乳糖醛酸酶粗酶液。我们用dns法测量反应后半乳糖醛酸的量来间接测定培养基中多聚半乳糖醛酸酶的含量。取0.2g多聚半乳糖醛酸和0.41g无水乙酸钠溶于100ml去离子水中，配成0.2％的多聚半乳糖醛酸溶液，调ph至5.2。将200μl待测果胶酶粗酶液与400μl0.2％的多聚半乳糖醛酸溶液混匀，在48℃水浴中反应30min后，立即置于冰上以终止反应。往上述600μl反应体系中，加入400μldns试剂混匀，沸水浴5min后冷却至室温。12,000rpm，离心1min弃去沉淀。将上清稀释三倍在540nm波长下用酶标仪测吸光度，每组做三个平行。以不加moml等蛋白的pcc为阳性对照作图。结果如图8，由图可知moml及其高活突变蛋白都可以显著降低pcc多聚半乳糖醛酸酶的表达量。
实施例5：moml及其高活突变蛋白对pcc植物侵染力的影响
pcc的寄主广泛，可侵染十字花科、茄科、豆科、葫芦科等多种作物以及花卉，造成严重的经济损失。本例以pcc侵染白菜为例，研究moml及其高活突变蛋白对pcc侵染力的影响，进一步探究其在病害防治中的防治效果。
挑选同一白菜形态、大小、生长发育状况相近的叶片进行清洗，置于超净工作台中自然晾干，并喷洒70％乙醇进行杀菌，待乙醇完全挥发。用灭菌吸头在白菜柄部中间划1～2cm左右的伤口，尽量保证伤口深浅一致。吸取5～10μl实施例9中培养18h后的pcc菌液注入伤口，在超净台内静置10min。与此同时，在灭菌保鲜袋中放入用无菌水打湿的灭菌滤纸，以防止放入培养箱后白菜萎蔫。待侵染液完全渗入白菜叶柄组织，用之前准备好的灭菌保鲜袋密封装好每组叶片。28℃培养箱静置培养20h后，结果如图9所示。由图可以看出，pcc与moml及moml-1，moml-2共培养后，pcc的侵染能力均有所下降，与后两者共培养时侵染能力下降比moml略明显。说明moml及其高活突变蛋白具有明显的抑制pcc致病的效果，可以将其进一步应用于多种植物病害防治。
序列表
<110>中国海洋大学
<120>一种用于病害防治的高活力蛋白的构建方法与应用
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>272
<212>prt
<213>耐油具柄菌(muricaudaolearia)
<400>1
lyslysglualaalaglusergluthralavalthrglualaalalys
151015
progluilelysleutyralapheserglyglythrvalasnalaasn
202530
metleugluleupheserglnaspthrthrtyrthrglyglnserlys
354045
gluphealaaspalaphetyrvalilevalhisprolysglythrleu
505560
mettrpaspalaglyleuprogluserleuvalglyleuproglupro
65707580
phethrserproaspglyalaphethrvalserarglysaspserval
859095
alaasnglnleualaserileaspmetthrvalaspaspileaspphe
100105110
ilealaleuserhisthrhispheasphisileglyhisalaasnval
115120125
phealaglyserthrtrpleuvalglnglulysglutyrasppheval
130135140
thrsergluaspasnglnlysserasnproaspiletyrasnserile
145150155160
lysgluleuthrlysvallyslysileasnglyasptyraspvalphe
165170175
glyaspglyservalvalmetlysphemetproglyhisthrprogly
180185190
hisglnvalleutyrleuaspmetvalgluhisglyproleumetleu
195200205
serglyaspmettyrhisphetyrgluasnargglupheargargval
210215220
proilepheasntyraspvalalaleuthrlyslyssermetglyglu
225230235240
pheglualaphealagluglulysglyalalysvaltyrleuglnhis
245250255
serlysgluasppheglulysleuproglnalaproasntyrleugln
260265270
<210>2
<211>816
<212>dna
<213>耐油具柄菌(muricaudaolearia)
<400>2
aaaaaggaagctgcagaatcggaaacagcggtgaccgaggcagcaaaacccgagataaag60
ctctatgcttttagcggaggtaccgtaaatgccaatatgttggagctcttttcacaggat120
accacgtacacgggtcagtccaaggaatttgccgatgctttttacgtcatcgttcacccc180
aagggcactttgatgtgggatgcaggtcttcccgaaagcttggtgggtcttccagagccc240
tttacatcacccgatggggcatttaccgtttcccgaaaagattccgtggccaaccaattg300
gcaagtatcgacatgactgttgatgatattgattttatcgcattgtcccatacccatttt360
gatcatattggccatgcgaacgtgtttgcagggtccacgtggttggtacaggaaaaggaa420
tacgactttgtgacaagcgaggacaaccaaaagagcaatccggacatctacaattccatt480
aaagagcttaccaaagtgaagaaaatcaatggggattacgatgtgttcggggatggaagt540
gtggtaatgaaatttatgccaggccatacccctggccatcaagtgttgtacttggatatg600
gttgagcacggaccgttgatgctttctggggacatgtaccatttttacgagaaccgggag660
ttccgaagagtgcccatttttaattacgatgtggccctcaccaagaaaagtatgggagag720
tttgaagcttttgccgaagaaaaaggggcaaaagtgtatttgcaacactccaaggaagat780
tttgaaaaactgccccaggcacccaactatttacaa816
<210>3
<211>272
<212>prt
<213>耐油具柄菌(muricaudaolearia)
<400>3
lyslysglualaalaglusergluthralavalthrglualaalalys
151015
progluilelysleutyralapheserglyglythrvalasnalaasn
202530
metleugluleupheserglnaspthrthrtyrthrglyglnserlys
354045
gluphealaaspalaphetyrvalilevalhisprolysglythrleu
505560
mettrpaspalaglyleuprogluserleuvalglyleuproglupro
65707580
phethrserproaspglyalaphethrvalserarglysaspserval
859095
alaasnglnleualaserileaspmetthrvalaspaspileaspphe
100105110
ilealaleuserhisthrhispheasphisileglyhisalaasnala
115120125
phealaglyserthrtrpleuvalglnglulysglutyrasppheval
130135140
thrsergluaspasnglnlysserasnproaspiletyrasnserile
145150155160
lysgluleuthrlysvallyslysileasnglyasptyraspvalphe
165170175
glyaspglyservalvalmetlysphemetproglyhisthrprogly
180185190
hisglnvalleutyrleuaspmetvalgluhisglyproleumetleu
195200205
serglyaspmettyrhisphetyrgluasnargglupheargargval
210215220
proilepheasntyraspvalalaleuthrlyslyssermetglyglu
225230235240
pheglualaphealagluglulysglyalalysvaltyrleuglnhis
245250255
serlysgluasppheglulysleuproglnalaproasntyrleugln
260265270
<210>4
<211>816
<212>dna
<213>耐油具柄菌(muricaudaolearia)
<400>4
aaaaaggaagctgcagaatcggaaacagcggtgaccgaggcagcaaaacccgagataaag60
ctctatgcttttagcggaggtaccgtaaatgccaatatgttggagctcttttcacaggat120
accacgtacacgggtcagtccaaggaatttgccgatgctttttacgtcatcgttcacccc180
aagggcactttgatgtgggatgcaggtcttcccgaaagcttggtgggtcttccagagccc240
tttacatcacccgatggggcatttaccgtttcccgaaaagattccgtggccaaccaattg300
gcaagtatcgacatgactgttgatgatattgattttatcgcattgtcccatacccatttt360
gatcatattggccatgcgaacgcgtttgcagggtccacgtggttggtacaggaaaaggaa420
tacgactttgtgacaagcgaggacaaccaaaagagcaatccggacatctacaattccatt480
aaagagcttaccaaagtgaagaaaatcaatggggattacgatgtgttcggggatggaagt540
gtggtaatgaaatttatgccaggccatacccctggccatcaagtgttgtacttggatatg600
gttgagcacggaccgttgatgctttctggggacatgtaccatttttacgagaaccgggag660
ttccgaagagtgcccatttttaattacgatgtggccctcaccaagaaaagtatgggagag720
tttgaagcttttgccgaagaaaaaggggcaaaagtgtatttgcaacactccaaggaagat780
tttgaaaaactgccccaggcacccaactatttacaa816
<210>5
<211>272
<212>prt
<213>耐油具柄菌(muricaudaolearia)
<400>5
lyslysglualaalaglusergluthralavalthrglualaalalys
151015
progluilelysleutyralapheserglyglythrvalasnalaasn
202530
metleugluleupheserglnaspthrthrtyrthrglyglnserlys
354045
gluphealaaspalaphetyrvalilevalhisprolysglythrleu
505560
mettrpaspalaglyleuprogluserleuvalglyleuproglupro
65707580
phethrserproaspglyalaphethrvalserarglysaspserval
859095
alaasnglnleualaserileaspmetthrvalaspaspileaspphe
100105110
ilealaleuserhisthrhispheasphisvalglyhisalaasnval
115120125
phealaglyserthrtrpleuvalglnglulysglutyrasppheval
130135140
thrsergluaspasnglnlysserasnproaspiletyrasnserile
145150155160
lysgluleuthrlysvallyslysileasnglyasptyraspvalphe
165170175
glyaspglyservalvalmetlysphemetproglyhisthrprogly
180185190
hisglnvalleutyrleuaspmetvalgluhisglyproleumetleu
195200205
serglyaspmettyrhisphetyrgluasnargglupheargargval
210215220
proilepheasntyraspvalalaleuthrlyslyssermetglyglu
225230235240
pheglualaphealagluglulysglyalalysvaltyrleuglnhis
245250255
serlysgluasppheglulysleuproglnalaproasntyrleugln
260265270
<210>6
<211>816
<212>dna
<213>耐油具柄菌(muricaudaolearia)
<400>6
aaaaaggaagctgcagaatcggaaacagcggtgaccgaggcagcaaaacccgagataaag60
ctctatgcttttagcggaggtaccgtaaatgccaatatgttggagctcttttcacaggat120
accacgtacacgggtcagtccaaggaatttgccgatgctttttacgtcatcgttcacccc180
aagggcactttgatgtgggatgcaggtcttcccgaaagcttggtgggtcttccagagccc240
tttacatcacccgatggggcatttaccgtttcccgaaaagattccgtggccaaccaattg300
gcaagtatcgacatgactgttgatgatattgattttatcgcattgtcccatacccatttt360
gatcatgttggccatgcgaacgtgtttgcagggtccacgtggttggtacaggaaaaggaa420
tacgactttgtgacaagcgaggacaaccaaaagagcaatccggacatctacaattccatt480
aaagagcttaccaaagtgaagaaaatcaatggggattacgatgtgttcggggatggaagt540
gtggtaatgaaatttatgccaggccatacccctggccatcaagtgttgtacttggatatg600
gttgagcacggaccgttgatgctttctggggacatgtaccatttttacgagaaccgggag660
ttccgaagagtgcccatttttaattacgatgtggccctcaccaagaaaagtatgggagag720
tttgaagcttttgccgaagaaaaaggggcaaaagtgtatttgcaacactccaaggaagat780
tttgaaaaactgccccaggcacccaactatttacaa816
<210>7
<211>35
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
agaaggagatatacatatgaaaaaggaagctgcag35
<210>8
<211>35
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
tggtggtggtggtgctcgagttgtaaatagttggg35