本发明涉及植物基因工程技术领域，具体为一种银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因及其编码蛋白与应用。
技术背景
银杏(ginkgobilobal.)又被称为公孙树、白果树，其历史可以追溯到2亿年前的石炭纪，是目前仅存的银杏科银杏属裸子植物。从上世纪80年代以来，银杏的药用价值受到越来越多的关注，随着研究的逐步深入，银杏萜内酯被发现是治疗心脑血管疾病的重要药物成分。然而，自然条件生长的银杏叶片中萜内酯含量极低，目前为止，传统方式获得的银杏萜内酯远不能满足市场的需求，因此需要通过新的途径提高银杏萜内酯含量。近年来研究发现对银杏萜内酯合成途径中关键基因进行遗传改良，利用基因工程技术有望提高银杏萜内酯含量。
植物萜类物质的合成路径分为两种，分别为甲羟戊酸途径和2c-甲基4-磷酸-4d-赤藓糖醇途径。甲羟戊酸途径主要在细胞质中进行，主要合成产物为倍半萜、三萜等；2c-甲基4-磷酸-4d-赤藓糖醇途径主要在一些质体中进行，主要合成半萜、单萜、二萜及四萜等。有报道称在一些物种中两种路径途径存在交换机制。甲羟戊酸途径以乙酰辅酶a为原料，经过乙酰辅酶a转移酶以及后续多个酶相继催化合成甲羟戊酸，最终缩合成异戊烯基焦磷酸和二甲烯丙基焦磷酸。这两种物质作为前体在细胞质和线粒体中被合成为一些类异戊二烯类物质。
乙酰辅酶a酰基转移酶属于酰基代谢酶超级家族中的硫解酶家族，乙酰辅酶a酰基转移酶催化2个乙酰辅酶a缩合形成乙酰乙酰辅酶a；反应机制为一个乙酰辅酶a释放脂酰coa合成酶与第二个乙酰辅酶a分子结合，形成酰基酶复合物；乙酰硫酯键断裂形成乙酰乙酰辅酶a。
目前已从拟南芥、萝卜、向日葵、橡胶、假马齿苋、苜蓿、油茶、鼠尾草等物种中寻找到乙酰辅酶a酰基转移酶基因的同源基因。在酵母异源性系统中，橡胶乙酰辅酶a酰基转移酶基因的表达能够促进酵母生长；假马齿苋乙酰辅酶a酰基转移酶基因的过表达能够提高假马齿苋的抗逆性。乙酰辅酶a酰基转移酶基因在不同物种之间显示出功能多样性。作为萜内酯合成路径重要基因，银杏中尚无乙酰辅酶a酰基转移酶基因的报道。
技术实现要素：
本发明的目是提供一种银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因。
本发明的另一目的是提供乙酰辅酶a酰基转移酶基因的编码蛋白。
本发明的又一目的是提供该基因的应用。
本发明的技术方案为：
本发明提供了银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因，来源于银杏(ginkgobilobal.)品种‘家佛手’，其cdna序列中含有1215bp的最大开放阅读框，序列如seqidno.1所示，编码seqidno.2所示的404个氨基酸序列。
本发明提供了银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因seqidno.2的表达载体。
本发明所述的表达载体由选取的银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因插入到pyes2载体的bamhi和ecori酶切位点间所得。
本发明的宿主菌是指将银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因表达载体转入到乙酰辅酶a酰基转移酶基因缺失型酵母ypl028w。
本发明提出的茉莉酸甲酯和水杨酸提高银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因表达水平和银杏萜内酯含量的方法，提供了一种证据表明银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因表达水平与银杏萜内酯之间存在正相关性。
扩增银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因cdna编码区的引物为：
扩增-f：5’-atgggttctacatcaggctcagatttgtt-3’(seqidno.3)
扩增-r：5’-ttacatgagctccaagacaactgcag-3’(seqidno.4)
实时荧光定量分析中设计的银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的qrt-pcr引物为：
定量-f：5’-cattgggggtctgagtggttc-3’(seqidno.5)
定量-r：5’-cattgttgctttcattcccga-3’(seqidno.6)
内参引物-f：5’-ctggcgtagagtatgtggttgaat-3’(seqidno.7)
内参引物-r：5’-cacgccaacaacgaacatg-3’(seqidno.8)
原核表达分析中设计的银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的引物为：
原核表达-up：5’-cgggatccatgggttctacatcaggctcag-3’(seqidno.9)
原核表达-dn：5’-cggaattcttacatgagctccaagacaactg-3’(seqidno.10)
本发明的技术效果为：
本发明所述银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因，是具有序列表seqidno.1中所述的基因序列，其开放阅读框是1215bp，编码404个蛋白质。生物信息学分析发现银杏乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白与其它植物的乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白有78％-81％的相似度。系统进化分析发现，乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白分为细菌、真菌、裸子植物和被子植物四大类，其中乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白单独聚类并与海枣等被子植物植物构成植物分支。组织表达分析显示银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因在银杏的不同组织均有表达且组织差异显著，在果中的表达量最高，其次是叶片和雄花，根中的表达量显著低于其它组织。试验结果中乙酰辅酶a酰基转移酶基因在果实中表达量最高可能与其果肉成分的合成密切相关。在叶片中表达量高说明叶片有可能涉及到了萜类物质的合成。银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的酵母功能互补验证了银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因编码的蛋白质具备乙酰辅酶a酰基转移酶基因酶活性，在萜内酯合成途径中行使催化功能。通过外源激素茉莉酸甲酯和水杨酸处理银杏植株，银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的表达量与萜内酯的含量均有提高。证明银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因在银杏萜内酯合成路径中与萜内酯含量呈正相关性，可以通过银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的过表达提高银杏中萜内酯含量。
附图说明
图1银杏乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白跨膜结构域分析；
如图1中所示，a为outsaide；b为inside；c为transmerbrane。
图2银杏乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白与同源乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白质的氨基酸序列比对的结果。
图3银杏乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白质序列比对构建的系统发育进化树。
图4银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因原核表达载体的sds-page电泳检测图。
图5银杏不同组织中银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的表达模式。
图6银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的酵母功能互补验证图。
图7植物激素茉莉酸甲酯和水杨酸处理后银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的表达模式；
如图7所示，图中每组柱状图从左至右依次为对照实验结果、茉莉酸甲酯参与实验结果和水杨酸参与实验结果。
图8植物激素茉莉酸甲酯和水杨酸处理后银杏中萜内酯含量变化；
如图8所示，图中每组柱状图从左至右依次为对照实验结果、茉莉酸甲酯参与实验结果和水杨酸参与实验结果。
图9银杏中总萜内酯和银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因表达量之间的关系(n＝21)。
具体实施方式
下面结合具体实施案例，进一步阐述本发明。这些实施案例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施案例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件；所述各类微生物均从市面购得。
实施例1银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的获得
(1)银杏叶总rna的提取
取1g新鲜的银杏叶片，液氮冷冻研磨成粉末状，采用rna提取试剂盒(takaraminibestplantrnaextractionkit)提取银杏rna，具体方法参考试剂盒说明书。
通过核酸测定仪检测样品rna质量。
(2)银杏rna反转录获得cdna
制备的银杏rna反转录获得cdna；
第一链cdna的合成使用takara公司的primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒，方法参照说明书。
(3)银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的克隆
根据银杏转录组数据设计银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因特异性引物扩增-f：5’-atgggttctacatcaggctcagatttgtt-3’(seqidno.3)；扩增-r：5’-ttacatgagctccaagacaactgcag-3’(seqidno.4)；以反转录获得的银杏cdna为模板，进行rt-pcr扩增反应。
目的条带胶回收参照胶回收试剂盒(takaraminibestagarosegeldnaextractionkit)说明书进行，将回收产物克隆到pmd19-t载体，然后转化大肠杆菌dh5α，挑选阳性克隆，进行测序。
经分析后获得seqidno.1所示序列，银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的orf为1215bp，编码404个氨基酸，氨基酸序列如seqidno.2所示。
实施例2银杏乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白质序列分析
tmhmm跨膜结构预测发现该蛋白没有跨膜结构(图1)。通过blastp查找genbank非冗余蛋白数据库发现预测的银杏乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白质序列与其他物种植物的乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白序列具有很高的相似度，如荷花(相似度81％，登录号xp_010252788.1)，无油樟(相似度80％，登录号xp_011628271.1)，蓖麻(相似度81％，登录号xp_015577103.1)，桑树(相似度80％，登录号ald84318.1)，泽漆(相似度78％，登录号alc76524.1)等。乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白在蛋白质归类上属于硫解酶大家族，根据催化活性的不同，硫解酶分为两种类型：ⅰ型硫解酶(acetyl-coac-acyltransferase)和ⅱ型硫解酶(acetyl-coac-acetyltransferase)，ⅰ型硫解酶是一类降解酶，ⅱ型硫解酶属于合成酶。通过在线网站interpro比对结果显示银杏乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白含有3个结构域，包括thiolase-like结构域，n-terminal和c-terminal。其中2个胱氨酸、1个组氨酸和1个天冬酰胺残基在不同植物的硫解酶中都高度保守(图2，星号标记)，在c-terminal具有一个保守结构域nvhggavsighpigcsg，ⅱ型硫解酶的活性位点(gvagvcnggggasa)可在乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白的尾部见到。
这些结果进一步确定了银杏乙酰辅酶a酰基转移酶与其他乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白高度同源，说明银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因可能在甲羟戊酸途径中发挥着重要作用，进而调节银杏萜内酯含量。
实施例3银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因系统进化分析
为了研究银杏乙酰辅酶a酰基转移酶与其他生物乙酰辅酶a酰基转移酶之间的进化关系，本研究从ncbi数据库分别筛选了细菌、真菌、裸子植物和被子植物的乙酰辅酶a酰基转移酶蛋白。通过nj法(neighbor-joining)构建了乙酰辅酶a酰基转移酶的系统进化树，自展值设定为1000。
如图3所示，乙酰辅酶a酰基转移酶在这些物种中由共同的祖先进化而来。不同生物的乙酰辅酶a酰基转移酶分化成不同的分支，其中冬虫夏草和酿酒酵母作为真菌聚类为一个分支，其次是鞘氨醇杆菌和粘液杆菌的细菌分支，植物分类在这两类之后出现，在植物分类中，银杏乙酰辅酶a酰基转移酶独立于其他被子植物物种，构成了独立的裸子植物分支。
本研究证明银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因属于高度保守的古老基因，且银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因属于乙酰辅酶a酰基转移酶基因家族的一员。
实施例4银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的原核表达分析
选择原核表达载体pet32a的bamhi和hindiii酶切位点进行双酶切获得线性化克隆载体，通过设计的含有酶切位点和表达载体部分序列的引物，即原核表达-up：5’-cgggatccatgggttctacatcaggctcag-3’(seqidno.9)；原核表达-dn：5’-cggaattcttacatgagctccaagacaactg-3’(seqidno.10)，扩增获得目的基因序列，一步克隆法将线性化质粒和目的基因连接成重组质粒。将重组质粒转入dh5α感受态细胞，涂板筛选单菌落，采用t7引物进行pcr检测阳性克隆。重新提取阳性克隆菌株质粒，转入到bl21(de3)大肠杆菌中用于iptg诱导表达银杏乙酰辅酶a酰基转移酶的蛋白质，含有银杏乙酰辅酶a酰基转移酶的原核表达载体以及空质粒的bl21菌株在iptg诱导4h后进行sds-page电泳检测，构建的原核表达载体银杏乙酰辅酶a酰基转移酶的原核表达载体(图4)能够表达出特异性的目的蛋白，蛋白大小在56.2kda左右，大小与预期相符。
通过原核表达验证了基因扩增产物银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因序列的完整性，以及基因转录翻译蛋白质结构的完整性。实验发现银杏乙酰辅酶a酰基转移酶在bl21大肠杆菌中能够翻译出完整的蛋白质，证实了克隆的银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因重组蛋白能在原核细胞中正确的表达。
实施例5银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因在不同组织中的表达分析
按照实施例1中的方法提取银杏根、茎、叶、雌花、雄花、果实rna，cdna的合成采用能消除rna中残留dna的试剂盒primescripttmrtregentkitwithgdnaeraser，设计定量引物内参基因-f：5’-ctggcgtagagtatgtggttgaat-3’(seqidno.7),内参基因-r:5’-cacgccaacaacgaacatg-3’(seqidno.8)，根据银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因序列设计表达检测引物定量-f：5’-cattgggggtctgagtggttc-3’(seqidno.5)，定量-r:5’-cattgttgctttcattcccga-3’(seqidno.6)。以来自不同组织cdna为模板进行实时定量pcr分析。
结果分析表明(图5)，银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因在银杏的不同组织均有表达且组织差异显著，在果中的表达量最高，其次是叶片和雄花，根中的表达量显著低于其它组织。一些紫花苜蓿的乙酰辅酶a酰基转移酶基因的研究中发现，乙酰辅酶a酰基转移酶基因能够提高转基因植物的耐盐性，并推测乙酰辅酶a酰基转移酶基因不仅是萜类合成的重要调节酶，还参与植物逆境胁迫的响应。本试验结果中银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因在果实中表达量最高可能与其果肉成分的合成密切相关。在叶片中表达量高说明叶片有可能涉及到了萜类物质的合成。
实施例6银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的酵母功能互补验证
甲羟戊酸途径对于酵母的存活至关重要，该途径基因的缺失会导致菌株死亡。pyes2质粒据具有半乳糖诱导的转录因子，在插入基因后半乳糖诱导下能够调控下游基因的表达，未插入基因的载体不表达，通过选取pyes2质粒作为载体，能够便于筛选出含有目的基因的重组质粒，含有空质粒的基因敲除菌株无法在ypd或ypg培养基中生长。
本发明通过构建银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因表达载体并转入基因缺失型菌株ypl028w(erg10)来检测银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的功能，含有重组质粒的菌株能够生长于ypg培养基，在ypd培养基中均不能生长(图6)，结果证明转入的银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因能够恢复ypl028w菌株中的乙酰辅酶a酰基转移酶基因功能缺失。本试验证明了银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因编码的蛋白质具备乙酰辅酶a酰基转移酶的酶活性，在萜内酯合成途径中行使催化功能。
实施例7茉莉酸甲酯和水杨酸对银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因表达水平的影响
本发明选取长势均匀的银杏一年生盆栽苗，生长在光周期为16h/8h，环境温度为光照下25℃，黑暗下18℃的恒温培养箱中。培养基质为1:1:1的草炭、腐殖土和珍珠岩，定期用自来水浇灌保持70％的土壤含水量。茉莉酸甲酯和水杨酸处理：取生长势相同的一年生银杏幼苗各10株，分别进行茉莉酸甲酯和水杨酸处理，以本课题组试验数据结果为参照设置茉莉酸甲酯和水杨酸的使用浓度为100μm，对照组使用含有0.1％酒精的水处理，各处理重复三次，分别在0h、8h、16h、24h、32h、64h和96h取样。叶片收集后液氮速冻，带回实验室放入―80℃超低温冰箱中保存。按照实施例1和5中的方法提取叶片rna，进行反转录成cdna，进行荧光定量pcr分析银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的转录水平。
结果如图7所示，茉莉酸甲酯和水杨酸处理显著提高了银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的转录水平，其中茉莉酸甲酯使银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的转录水平在0-64h之间持续增长，并在64h达到了对照组水平的3.73倍，水杨酸处理的植株在32h的时候银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的表达量达到了最高，接着出现了缓慢降低的现象。
实施例8茉莉酸甲酯和水杨酸对萜内酯含量变化的影响
对实施例7中的银杏，通过改进的大孔径毛细管柱方法提取和测定萜内酯含量，取银杏叶片添加液氮磨碎成粉末状，加入10ml60％甲醇溶液，40℃超声提取30min，12000rpm离心10min，将上清转入25ml容量瓶，沉淀中重新加入10ml甲醇溶液，重复上述离心和转入操作；用甲醇溶液定容至25ml。混合物80℃振荡加热2h，通过安装有30m×0.53mm×1.5μmtc-1毛细柱的shimadzugc-14b(shimadzu,japan)气相色谱仪测定含量。毛细柱、注入孔、检测器的温度分别为290℃、320℃和320℃。载气流动速度为3.1ml/min。通过银杏内酯a、银杏内酯b银杏内酯c和白果内酯的含量之和统计总萜内酯含量。每组样品进行三次重复，数据采用平均值±标准偏差方法(n＝3)。
结果如图所示，萜内酯的含量在水杨酸的处理下在8h时相对于对照组提高了5.8％，并且在0h～96h范围持续增长，在处理64小时后萜类含量最高；茉莉酸甲酯处理后萜内酯含量增长状况与水杨酸处理类似，在处理8h后银杏萜内酯含量较水杨酸处理上升明显，并在处理32h-96h之间持续高于水杨酸处理(图8)。银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因的表达水平在水杨酸处理后上升与萜类含量变化情况具有一定的相关性。茉莉酸甲酯处理的植株中银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因表达水平相对于水杨酸处理高，萜类物质的含量相对水杨酸处理同样较高，推测银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因在银杏萜类合成中具有重要的调控功能。
实施例9总萜内酯和银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因表达量之间的关系
对茉莉酸甲酯和水杨酸处理的银杏幼苗的银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因转录水平和银杏萜内酯含量数据进行线性回归分析。
如图9所示，用y＝27.762x+384.75表示的线性曲线方程，银杏萜内酯含量(y)和银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因表达水平(x)显着正相关(r2＝0.7281)。这些结果表明银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因是甲羟戊酸途径中涉及银杏萜内酯生物合成的关键酶基因，并可能参与银杏萜内酯积累的调控。
当然，以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。除上述实施例外，本发明还可以有其它实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求保护的范围之内。
序列表
<110>长江大学
<120>一种银杏乙酰辅酶a酰基转移酶基因及其编码蛋白与应用
<160>10
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1218
<212>dna
<213>银杏(ginkgobiloba)
<400>1
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<212>prt
<213>银杏(ginkgobiloba)
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