本发明属于生物
技术领域：
，涉及2型猪链球菌的分子生物学，涉及一种检测2型猪链球菌的方法及其用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增（rpa）技术快速检测2型猪链球菌的方法、其专用引物和探针及其用途。
背景技术：
：猪链球菌（streptococcussuis，s.suis），属芽孢杆菌纲乳杆菌目链球菌科链球菌属。猪链球菌是一种人畜共患病原体，可导致猪的脑膜炎、关节炎和败血症等，亦引起人类的感染，导致脑膜炎及中毒性休克综合征等，我国于1991年在广东省首次证实猪链球菌病的存在，并于1998年及2005年分别在江苏和四川暴发大规模2型猪链球菌流行感染猪和人的公共卫生事件，在我国南方各省每年都有散发病例出现，给从业人员的生命健康带来严重威胁，同时也造成巨大的经济损失。猪链球菌病潜伏期短，平均2-3天，最短仅数小时，最长7天，病人感染后，临床症状主要有畏寒、突发高热、头昏、全身不适、乏力，伴有头痛及腹泻等胃肠道症状，重症患者迅速发展为中毒性休克综合征，皮肤出现瘀点，四肢及头面部出现瘀斑，部分患者同时伴有脑膜炎、败血症等并发症，严重者可导致休克，甚至死亡。目前临床主要通过标本纯培养后经形态学、生化反应和pcr法检测猪链球菌特异性毒力基因进行鉴定。该法需要特定的设备、耗时、需对样品进行复杂处理，一旦发生疫情，无法快速、准确地进行检测，故建立一种简单、快速、适合现场应用的猪链球菌的检测方法具有重要意义。近年来，恒温核酸扩增技术得到了快速发展，其中重组酶聚合酶恒温扩增（recombinasepolymeraseamplification，rpa）技术被誉为是可替代pcr的核酸检测技术，该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内dna复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合（重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶）对dna模板进行扩增，可在25-43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。技术实现要素：本发明检测2型猪链球菌的rpa方法，所要解决的技术问题是提供一组用于快速检测2型猪链球菌的特异性引物和探针，以及一种快速、简便、特异性好的2型猪链球菌的检测方法。因此本发明检测2型猪链球菌的rpa方法，第一个目的是提供用于检测2型猪链球菌的引物，包括正向引物和反向引物，共两条。所述引物是根据2型猪链球菌荚膜多糖（cps2j）基因设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了2型猪链球菌cps2j基因的保守区，此区域为2型猪链球菌基因组（genbank：cp000407.1）位于第563057至564055核苷酸位点的一段序列，含有999个碱基的核苷酸片段，具有seqidno.1所示的核苷酸序列。从seqidno.1序列内筛选设计特异性引物。筛选的特异性引物包括正向引物f3和反向引物r1，分别位于基因组第563201至563230核苷酸位点和第563473至563502核苷酸位点，分别具有如seqidno.2和seqidno.3所示的寡核苷酸序列，引物的长度为30bp左右，其中反向引物5’端标记生物素（biotin）。正向引物和反向引物扩增完成后获得的双链dna将标记有生物素。seqidno.1：atggaaaaagtcagcattattgtacctatttttaatacggaaaagtacttaagagagtgtttagatagcattatttcccaatcgtatactaatctagagattcttttgatagatgacggttcttcagattcatcaacggatatatgtttggaatacgcagagcaagatggtagaataaaacttttccggttaccaaatggtggtgtttcaaacgcaaggaattacggtatcaaaaatagcacagcaaattatattatgtttgtagattctgatgatattgttgacggcaacattgttgagtccttatacacctgtttaaaagagaatgatagtgatttgtcgggagggttacttgctacttttgatggaaattatcaagaatctgagctgcaaaagtgtcaaattgatttggaagagataaaagaggtgcgagacttaggaaatgaaaattttccaaatcattatatgagcggtatctttaatagcccttgttgcaaactttataagaatatatatataaacaaaggttttgacactgaacagtggttaggagaggacttattatttaatctaaattatttaaagaatataaaaaaagtcagctatgtaaacagaaatctttattttgctagaagaggtatacaaagtactacaaatacgtttaaaaaagatgtttttattcaattagaaaatttagaagaaaaaacttttgatttgtttgttaaaatatttggtggacaatatgaattttctgtttttaaagagacgctacagtggcatattatttattatagcttattaatgttcaaaaatggagatgaatcgcttccaaagaaattgcatatatttaagtatttatacaataggcattctttagatactctaagtattaaacgaacgtcctctgtttttaaaagaatatgtaaattaattgttgctaataatttgtttaaaatttttttaaatactttaattagggaagaaaaaaataatgattaaseqidno.2：5’atgtttggaatacgcagagcaagatggtag3’seqidno.3：5’catttcctaagtctcgcacctcttttatct3’本发明检测2型猪链球菌的rpa方法，第二个目的是提供用于检测2型猪链球菌的探针。所述探针是根据2型猪链球菌cps2j基因设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了2型猪链球菌cps2j基因的保守区，此区域含有999个碱基的核苷酸片段，具有seqidno.1所示的核苷酸序列。从seqidno.1序列内筛选设计特异性探针，设计探针位于基因组第563379至563424核苷酸位点，具有seqidno.4所示的寡核苷酸序列，，且5’端标记荧光素fam，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），将第31位碱基替换为一个四氢呋喃（thf）。seqidno.4：5’gagaatgatagtgatttgtcgggagggttacttgctacttttgatg3’所述探针的长度为45bp，其中5’端30bp，3’端15bp。所述探针由荧光素（羧基荧光素fam）、5’端序列、四氢呋喃（thf）、3’端序列及3’端延伸阻断基团（磷酸基团）组成。所述探针与扩增后的标记有生物素的dna退火，rpa系统中的nfo酶将在thf部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得fam和biotin双标记的扩增产物。本发明检测2型猪链球菌的rpa方法，第三个目的是提供了用于2型猪链球菌快速检测的rpa检测方法，所述方法采用上述的rpa引物和探针进行扩增，并结合侧向层析核酸检测试纸条(hybridetect2t，mileniabiotecgmbh,germany)进行可视化判断。本发明所述的检测2型猪链球菌的rpa方法，包括以下步骤：（1）以待测样品基因组dna为模板，在所述引物组和探针的标记下进行rpa反应；（2）结果判断：用上述侧向层析核酸检测试纸条对rpa产物进行检测，检测线和质控线均显色，判断结果为阳性结果；检测线未显色，质控线显色，判断结果为阴性结果；质控线未显色，不管检测线是否显色，均判定结果无效。优选地，本发明所述的方法，具体步骤如下：（1）扩增试剂准备和加样：将浓度为10μmol/l的正向引物2.1μl、浓度为10μmol/l的反向引物2.1μl、浓度为5μmol/l的探针0.6μl、待测样品1μl、无dnase和rnase水12.2μl和缓冲液29.5μl混合，组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的twistamp®nfo反应管中。然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管盖内壁上。（2）扩增：将反应管盖内的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增15min，在反应4min时，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。（3）结果判断：取5μl的rpa扩增产物用pbst稀释至100μl，用上述侧向层析核酸检测试纸条对rpa产物进行检测，检测线和质控线均显色，判断结果为阳性结果；检测线未显色，质控线显色，判断结果为阴性结果；质控线未显色，不管检测线是否显色，均判定结果无效。本发明检测2型猪链球菌的原理是采用rpa技术，对2型猪链球菌的特异性保守靶序列，即2型猪链球菌cps2j的保守序列进行检测，该序列可作为2型猪链球菌的标志基因之一。本发明检测2型猪链球菌的rpa方法，节约了2型猪链球菌的检测时间，检测可在37℃下15min内完成扩增，整个检测过程可在1小时内完成，与常规pcr和实时荧光定量pcr需要数小时相比极大地缩短了检测时间。本发明检测2型猪链球菌的rpa方法，降低了反应温度，rpa只需要恒温37℃即可完成实验，该温度远远低于荧光定量pcr的60-95℃以及lamp的63℃。本发明检测2型猪链球菌的rpa方法，方法更加简单、便于携带：扩增所需的酶和一些其他必要的东西可冻干保存，能够在常温下长时间放置，扩增时只需要加入水解缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应即可，且样品不需要进行复杂反应。本发明检测2型猪链球菌的rpa方法，灵敏性高，特异性强，可用于现场或即时检测，具有广阔的应用前景。附图说明图1显示rpa检测体系最优引物组合筛选中不同引物组合的检测结果每组组合均设置一组阴性对照，试验结果如图所示，（a）为1-6组样品，（b）为1-6组的阴性对照。图2为确定检测2型猪链球菌rpa检测方法的最佳反向引物和探针组合浓度。设定反向引物的浓度梯度为10μmol/l、5μmol/l、2.5μmol/l，探针的浓度为10μmol/l、5μmol/l、2.5μmol/l，将三种浓度的反向引物分别与三种浓度的探针进行组合，组合成9组组合（组合编号见表3），每组组合均设置一组阴性对照，试验结果如图所示，nc代表阴性对照。图3为确定检测2型猪链球菌rpa检测方法的最佳扩增时间。设定扩增时间为10min、15min、20min、25min，并设置了一个阴性对照，试验结果如图所示，nc代表阴性对照。图4为检测2型猪链球菌rpa方法的灵敏度，对阳性质粒进行定量后进行十倍倍比稀释，获得浓度为104-100拷贝/μl的质粒dna，作为后续模板进行试验，试验条件为上述的最佳试验条件，试验结果如图所示，nc代表阴性对照。图5为检测2型猪链球菌rpa方法的的特异性，分别以2型猪链球菌、黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、普氏立克次体、立氏立克次体、恙虫病东方体、肺炎支原体和健康者dna的样本为模板进行试验，试验结果如图所示。具体实施方式下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。所用rpa引物和探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，所有序列测定工作均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1、2型猪链球菌rpa检测引物和探针的设计及筛选（1）引物和探针的设计发明人通过文献检索，分析确定本发明使用2型猪链球菌cps2j基因中的特异性序列为目标基因。从ncbi数据库中获得已知的模板基因序列，即seqidno.1所示的核苷酸序列，并由南京金斯瑞生物科技有限公司对上述序列进行合成，作为阳性质粒，在后续引物探针筛选、反应体系的优化等过程中作为模板使用。根据rpa引物及探针设计原则，设计5条引物及1条探针，如表1所示。表1引物及探针序列（2）引物筛选人工合成含有2型猪链球菌cps2j基因的seqidno.1所示的序列的阳性质粒，以此质粒为模板，将引物与探针进行全面组合成6组引物组合，组合编号如表2所示。6组引物组合分别进行在37℃条件下进行rpa扩增，以侧向层析核酸检测试纸条检测线显色情况为指标，筛选出在37℃条件下，扩增效率最高的引物探针组合，用于后续rpa检测的评价和应用。筛选用的50μl的rpa反应体系如下：将浓度为10μmol/l的正向引物2.1μl、浓度为10μmol/l的反向引物2.1μl、浓度为5μmol/l的探针0.6μl、浓度为1×104拷贝/μl的模板1μl、无dnase和rnase水12.2μl和缓冲液29.5μl混合，组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的twistamp®nfo反应管中，然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管盖的内壁上。考虑到rpa反应灵敏度较高，易出现假阳性，发明者设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。扩增：将反应管盖上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20min，在反应第4min时，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。结果判断：取5μl的rpa扩增产物用pbst稀释至100μl，再用上述侧向层析核酸检测试纸条对rpa产物进行检测。每个反应设置一个复孔。表2引物探针组合编号编号组合1f1+r12f2+r13f3+r14f1+r25f2+r26f3+r26组引物组合的侧向层析核酸检测结果见图1。图1为检测时间为20min时6组引物组合、阴性对照的侧向层析核酸检测试纸条的检测线和质控线的显示情况。本发明检测2型猪链球菌的rpa方法，确定的引物组合包括：正向引物（f3）和反向引物（r1），共两条，分别具有如seqidno.2和seqidno.3所示的寡核苷酸序列。（3）探针的确定表1列出的probe探针为本发明优选，探针的长度为45bp，其中5’端至thf共有30bp，3’端至thf共有15bp。探针由荧光素（羧基荧光素fam）、5’端序列、四氢呋喃（thf）、3’端序列及3’端延伸阻断基团（磷酸基团）几部分组成。探针具有seqidno.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素fam，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），将第31位碱基替换为四氢呋喃（thf）。所述探针与扩增后的标记有生物素的dna退火，rpa系统中的nfo酶将在thf部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得fam和biotin双标记的扩增产物。实施例2：rpa反应体系、扩增和检测条件的优化在引物筛选的过程中，侧向层析核酸检测试纸条在检测是仍存在假阳性的情况，因此需对rpa反应体系、扩增和检测条件进行优化（1）引物探针浓度设定反向引物的浓度梯度为10μmol/l、5μmol/l、2.5μmol/l，探针的浓度为10μmol/l、5μmol/l、2.5μmol/l，将三种浓度的反向引物分别与三种浓度的探针进行组合，组合成9组组合，每组组合均设置一组阴性对照。分别在37℃条件下进行rpa扩增，扩增完毕以侧向层析核酸检测试纸条检测线显色情况为指标。筛选出扩增效果最好，且不出现假阳性的组合。表3反向引物浓度和探针浓度组合编号编号组合编号组合编号组合1r1（10μm）+probe（10μm）4r1（10μm）+probe（5μm）7r1（10μm）+probe（2.5μm）2r1（5μm）+probe（10μm）5r1（5μm）+probe（5μm）8r1（5μm）+probe（2.5μm）3r1（2.5μm）+probe（10μm）6r1（2.5μm）+probe（5μm）9r1（2.5μm）+probe（2.5μm）通过对侧向层析核酸检测试纸条检测结果分析（见图2），并考虑经济因素，本发明确定的反向引物的浓度为10μmol/l、探针的浓度为5μmol/l。（2）rpa扩增时间的优化在引物筛选的过程中，侧向层析核酸检测试纸条在检测时仍存在假阳性的情况，因此需对rpa扩增时间进行优化。50μl的rpa反应体系如下：将浓度为10μmol/l的正向引物2.1μl、浓度为10μmol/l的反向引物2.1μl、浓度为5μmol/l的探针0.6μl、浓度为1×104拷贝/μl的模板1μl、无dnase和rnase水12.2μl和缓冲液29.5μl混合，组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的twistamp®nfo反应管中。然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管盖内壁上。扩增：将反应管盖上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增10min、15min、20min、25min，均在反应4min时，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。发明者设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。结果判断：取5μl的rpa扩增产物用pbst稀释至100μl，再用上述侧向层析核酸检测试纸条对rpa产物进行检测。通过对侧向层析核酸检测试纸条检测结果分析（见图3），扩增时间为15min时的样品检测线显色清晰，达到试验要求，本发明确定的扩增时间为15min。综上，通过rpa扩增和检测条件进行优化，本发现确定在使用10μmol/l的下游引物和5μmol/l的探针扩增15min，加样量为5μl，试纸条显色时间控制在3-5min时，检测效果最好。实施例3：rpa检测的检测限评价将2型猪链球菌阳性质粒按十倍倍比稀释成104-100拷贝/μl等一系列不同浓度，各取1μl分别加入实施例2所确定的反应体系，利用筛选出的引物组合，采用实施例2确定的反应条件对上述不同拷贝数的模板进行rpa检测，观察rpa检测的检测限。结果（见图4），从102拷贝/μl开始以上样品均呈阳性，阴性对照呈阴性，说明本发明rpa检测方法的检测限为102拷贝/反应。实施例4：rpa检测的特异性评价特异性评价以黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、普氏立克次体、立氏立克次体、恙虫病东方体、肺炎支原体和健康者的基因组dna为对照，以确定本发明rpa检测方法的特异性。分别以2型猪链球菌、黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、普氏立克次体、立氏立克次体、恙虫病东方体、肺炎支原体和健康者dna的样本为模板，采用如下反应体系：将浓度为10μmol/l的正向引物2.1μl、浓度为10μmol/l的反向引物2.1μl、浓度为5μmol/l的探针0.6μl、1μl样品、无dnase和rnase水12.2μl和缓冲液29.5μl混合，组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的twistamp®nfo反应管中。然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管盖内壁上。扩增：将反应管盖内上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增15min，在反应4min时，将反应管取出充分混匀。结果判断：取5μl的rpa扩增产物用pbst稀释至100μl，用上述侧向层析核酸检测试纸条对rpa产物进行检测，检测线和质控线均显色，判断结果为阳性结果；检测线未显色，质控线显色，判断结果为阴性结果；质控线未显色，不管检测线是否显色，均判定结果无效。结果（见图5）黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、普氏立克次体、立氏立克次体、恙虫病东方体、肺炎支原体和健康者的基因组dna样品检测线均显色，呈阴性，只有2型猪链球菌样品检测线显色，呈阳性，说明本发明rpa检测方法对2型猪链球菌有很强的特异性。一种检测2型猪链球菌的rpa方法、其专用引物和探针及用途序列表见附件文档：核苷酸或氨基酸序列表计算机可读载体。序列表<110>李佳萌<120>一种检测2型猪链球菌的rpa方法、其专用引物和探针及其用途序列表<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>999<212>dna<213>猪链球菌2型(streptococcussuistype2)<220><221>misc_feature<222>(1)..(999)<400>1atggaaaaagtcagcattattgtacctatttttaatacggaaaagtacttaagagagtgt60ttagatagcattatttcccaatcgtatactaatctagagattcttttgatagatgacggt120tcttcagattcatcaacggatatatgtttggaatacgcagagcaagatggtagaataaaa180cttttccggttaccaaatggtggtgtttcaaacgcaaggaattacggtatcaaaaatagc240acagcaaattatattatgtttgtagattctgatgatattgttgacggcaacattgttgag300tccttatacacctgtttaaaagagaatgatagtgatttgtcgggagggttacttgctact360tttgatggaaattatcaagaatctgagctgcaaaagtgtcaaattgatttggaagagata420aaagaggtgcgagacttaggaaatgaaaattttccaaatcattatatgagcggtatcttt480aatagcccttgttgcaaactttataagaatatatatataaacaaaggttttgacactgaa540cagtggttaggagaggacttattatttaatctaaattatttaaagaatataaaaaaagtc600agctatgtaaacagaaatctttattttgctagaagaggtatacaaagtactacaaatacg660tttaaaaaagatgtttttattcaattagaaaatttagaagaaaaaacttttgatttgttt720gttaaaatatttggtggacaatatgaattttctgtttttaaagagacgctacagtggcat780attatttattatagcttattaatgttcaaaaatggagatgaatcgcttccaaagaaattg840catatatttaagtatttatacaataggcattctttagatactctaagtattaaacgaacg900tcctctgtttttaaaagaatatgtaaattaattgttgctaataatttgtttaaaattttt960ttaaatactttaattagggaagaaaaaaataatgattaa999<210>2<211>30<212>dna<213>猪链球菌2型(streptococcussuistype2)<220><221>misc_feature<222>(1)..(30)<400>2atgtttggaatacgcagagcaagatggtag30<210>3<211>30<212>dna<213>猪链球菌2型(streptococcussuistype2)<220><221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>5’端标记生物素<400>3catttcctaagtctcgcacctcttttatct30<210>4<211>46<212>dna<213>猪链球菌2型(streptococcussuistype2)<220><221>misc_feature<222>(1)..(46)<223>5’端标记荧光素fam，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），将第31位碱基替换成一个四氢呋喃（thf）<400>4gagaatgatagtgatttgtcgggagggttacttgctacttttgatg46当前第1页12