本发明属于纳米药物检测领域，具体涉及一种评价纳米药物血脑屏障通透性的方法。
背景技术：
血脑屏障是一层由脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的生理性屏障。除某些氨基酸类、己糖类、神经肽类物质经特殊载体转运可穿透血脑屏障外，血脑屏障能够阻止约95％小分子和约100％大分子进入脑部，因此，血脑屏障在维持中枢动态稳定方面发挥了重要作用。但同时，绝大部分药物也难以穿透血脑屏障进入中枢系统起效，这为神经系统等脑部疾病的治疗增加了难度。基于这种情况，针对于治疗脑部疾病的药物，除了评价药物的治疗效果和安全性外，也需考察药物的血脑屏障通透性。
目前，评价药物血脑屏障通透性的方法包括体外模型和动物体内实验两类方法。
体外模型法中具有代表性的是transwell体外血脑屏障模型方法；具体方法是：准备transwell小室，其底层带有通透性的膜，将细胞(微血管内皮细胞)接种于transwell小室的膜上，待细胞生长致密且铺满膜后，将transwell小室放入培养板的板孔中，小室内称为上池，培养板与小室之间称为下池，向上下池内装入培养液，即建立好transwell体外血脑屏障模型(如图1所示)；向模型的上池中加入待测药物，在规定时间后测试下池的药物浓度，依此计算出药物对血脑屏障的通透率。
动物体内实验方法中比较常见的有斑马鱼模型法和大鼠模型法。其中：斑马鱼模型法是采用孵化成长4天后具有完整血脑屏障生理结构的斑马鱼幼鱼，向斑马鱼幼鱼心脏注射含荧光素的待测药物，一定时间后用激光共聚焦显微镜观察斑马鱼脑部的荧光出现情况，依此定性评价待测药物的血脑屏障通透性。大鼠模型法是对大鼠腹腔注射、皮下注射或尾静脉注射待测药物，一定时间后提取并检测脑脊液或脑匀浆的待测药物含量，依此评价待测药物的血脑屏障通透性。若待测药物具有荧光，也可以通过检测脑组织切片中的荧光强弱来定性评价待测药物的血脑屏障通透性。
但是，以上经典的评价血脑屏障通透性的方法存在如下的缺点：
(1)经典的transwell体外血脑屏障模型法中，需准确测试下池的药物浓度，以计算药物的通透率，但下池的高浓度培养液难以用液相色谱法检测，可采用的几种检测方法也存在各自缺陷，例如，若药物本身有荧光或能吸收荧光，则可考虑采用荧光分光光度计或紫外-可见分光光度计检测，但下池中的培养液容易产生光谱干扰，严重降低了方法的检测限，误差较大；又例如，如果采用常见的高灵敏度放射性检测法，则需在检测前对待测药物改性(如放射性同位素标记等)，这使得检测成本过高，并且，以上方法都是适用于检测溶解分散于体系中呈离子状态的药物分子，不适用于呈固体颗粒状态的中枢靶向纳米药物的血脑屏障通透性评价。
(2)斑马鱼模型法中，向心脏注射药物的操作比较繁琐和困难，并且，由脑部观察到的荧光也难以区分是来源于脑外层还是脑内皮层，因此无法准确评价药物的血脑屏障通透性。
(3)大鼠模型法中，大鼠脑组织液、脑脊液、脑匀浆的成分复杂，干扰较大，难以定性或定量测定其中的药物含量。
综上，现阶段亟需建立一种方便、简单、快速、准确地评价纳米颗粒血脑屏障通透性的方法。
技术实现要素：
本发明提供了一种评价纳米药物血脑屏障通透性的方法，该方法可在体外准确、快速地评价纳米药物的血脑屏障通透性，操作简便。
本发明涉及一种评价纳米药物血脑屏障通透性的方法，包括如下步骤：
(1)建立transwell体外血脑屏障模型；
(2)将含荧光纳米药物和/或荧光染色纳米药物的悬浊液加入到步骤(1)所建模型的上池中，静置；
(3)静置结束，取出小室中的膜，对膜上的细胞进行荧光染色，所染荧光色能与步骤(2)中的荧光色区分开，得到待测样品；
(4)采用激光共聚焦显微镜对步骤(3)所得的待测样品沿厚度方向逐层扫描拍照；
(5)将步骤(4)所得的照片按照扫描或拍照顺序叠加，然后取侧视图，通过观察侧视图来评价纳米药物的血脑屏障通透性。
本发明的某些实施方式中，所评价的纳米药物为荧光纳米药物和/或非荧光纳米药物。
本发明的某些实施方式中，步骤(2)中，荧光染色纳米药物为将纳米药物(例如：荧光纳米药物和/或非荧光纳米药物)进行荧光染色后得到的药物。
本发明的某些实施方式中，步骤(2)中，荧光染色纳米药物的荧光染色方法为本领域常规方法；例如，掺杂、浸渍、吸附等。其所采用的荧光染料为本领域常规使用的。
本领域技术人员公知，对纳米药物进行本领域常规的荧光染色并不会影响纳米药物血脑屏障通透性的定性/定量结果。
本发明的某些实施方式中，步骤(3)中，对膜上细胞的细胞核进行荧光染色。
本发明的某些实施方式中，步骤(3)所染荧光色与步骤(2)中的荧光色能被人的肉眼区分开。
本发明的某些实施方式中，所述待测样品包含膜、膜上的染色细胞以及膜上的荧光纳米药物和/或荧光染色纳米药物。
本发明的某些实施方式中，步骤(4)中，所述厚度方向是指待测样品中膜的厚度方向和/或细胞层的厚度方向。
本发明的某些实施方式中，步骤(4)中，激光共聚焦显微镜沿待测样品厚度方向逐层扫描的步进为0.3-2μm，例如0.6μm、0.8μm、1μm、1.4μm、1.6μm、1.7μm、1.9μm。
本发明的某些实施方式中，步骤(4)中，激光共聚焦显微镜沿待测样品厚度方向逐层扫描的步进为0.5-1.2μm。
本发明的某些实施方式中，步骤(5)中，通过计算机完成将步骤(4)所得的照片按照扫描或拍照顺序叠加的操作。
本发明的某些实施方式中，步骤(5)中，通过人工完成将步骤(4)所得的照片按照扫描或拍照顺序叠加的操作。
本发明的某些实施方式中，步骤(5)中，通过计算机完成叠加后取侧视图的处理。
本发明的某些实施方式中，步骤(5)中，通过人工完成叠加后取侧视图的处理。
本发明的某些实施方式中，步骤(2)中，所评价的纳米药物的粒径≤800nm，例如3nm、5nm、10nm、20nm、30nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、130nm、150nm、180nm、200nm、240nm、270nm、290nm、310nm、330nm、340nm、350nm、360nm、380nm、400nm、500nm、600nm、700nm。
本发明的某些实施方式中，步骤(2)中，所评价的纳米药物的粒径为1-600nm。
本发明的某些实施方式中，步骤(2)中，所评价的纳米药物为亲水性或疏水性纳米颗粒。
本发明的某些实施方式中，步骤(2)中，所评价的纳米药物为经修饰或未经修饰的硅纳米药物。
本发明的某些实施方式中，步骤(2)中，经修饰的硅纳米药物为转铁蛋白修饰的硅纳米药物。
本发明的某些实施方式中，步骤(2)中，悬浊液的浓度为0.04-1mg/ml，例如0.05mg/ml、0.07mg/ml、0.06mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.12mg/ml、0.13mg/ml、0.16mg/ml、0.17mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml。
本发明的某些实施方式中，步骤(2)中，悬浊液的浓度为0.08-0.14mg/ml。
本发明的某些实施方式中，其中，步骤(1)所建的模型中，小室中膜上的细胞为单层或双层，优选为单层。
本发明的某些实施方式中，步骤(2)中，静置的时间为0.5-4小时，例如1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时。
本发明的某些实施方式中，步骤(2)中，静置的时间为0.5-3小时。
本发明的某些实施方式中，步骤(5)中，通过观察侧视图定性评价纳米药物的血脑屏障通透性。
本发明的某些实施方式中，步骤(5)中，如果观察到纳米药物的荧光色和细胞的荧光色相互混合，则判断纳米药物可以穿透血脑屏障；
如果观察到纳米药物的荧光色和细胞的荧光色之间有明显的分界线，则判断纳米药物不能穿透血脑屏障。
本发明的某些实施方式中，步骤(5)中，如果观察到纳米药物的荧光色和细胞的荧光色相互混合，且两种颜色之间无明显的分界线，则判断纳米药物可以穿透血脑屏障。
本发明的某些实施方式中，步骤(5)中，如果观察到纳米药物的荧光色和细胞的荧光色之间有明显的分界线，且两种颜色几乎无相互混合，则判断纳米药物不能穿透血脑屏障。
本发明的某些实施方式中，步骤(5)中，经人工和/或计算机完成观察侧视图及给出定性评价结果的处理。
本发明的某些实施方式中，所述评价方法包括如下1)至10)中的一项或多项：
1)在步骤(1)和(2)之间，还包括步骤(1’)：初评步骤(1)所建的模型；
2)步骤(2)中的荧光色为荧光绿色；
3)步骤(2)中，悬浊液中的溶剂为pbs和/或d-hank’s；
4)步骤(2)中，在37℃、含5％co2的环境下静置；
5)步骤(3)中，在染色之前，还包括清洗膜的步骤；
6)步骤(3)中，细胞所染颜色为荧光亮蓝色；
7)步骤(3)中，采用dapi进行细胞染色；
8)步骤(4)中，激光共聚焦显微镜的放大倍率为8-120倍，优选为10-110倍，例如15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍；
9)步骤(4)中，激光共聚焦显微镜采用多波段激发(发射)波长；
10)步骤(4)中，逐层扫描拍照的范围是待测样品中细胞所染颜色的最底层至纳米药物荧光色的最顶层。
本发明的某些实施方式中，步骤(1’)中，初评方法为渗漏测试和跨内皮电阻值检测。
本发明的某些实施方式中，渗漏测试指：开始时，向模型的上下池中加入培养液，使上下池达到一液面差，静置一段时间后，观察上下池的液面差是否变小；如未变小，则通过渗漏测试；优选静置时间为3-8小时，例如4小时、5小时、6小时、7小时。
本发明的某些实施方式中，跨内皮电阻值检测指：将跨内皮电阻测定仪中u型探头的两个触手分别插入上池和下池中，测量电阻值；如检测电阻值≥200ω.cm2，则通过跨内皮电阻值检测。
本发明的某些实施方式中，步骤(2)中，含5％co2环境中的其余气体为空气。
本发明的某些实施方式中，步骤(3)中，清洗膜的方式是用溶剂pbs和/或d-hank’s冲洗膜上细胞的表面。
本发明的某些实施方式中，步骤(4)中，对荧光亮蓝色的激发波长为360nm，发射波长为460nm。
本发明的某些实施方式中，步骤(4)中，对荧光绿色的激发波长为495nm，发射波长为519nm。
本发明的某些实施方式中，步骤(4)中，逐层扫描拍照的范围是待测样品中最底层开始出现细胞所染颜色至最顶层纳米药物荧光色消失为止。
本发明的某些实施方式中，待测样品由上至下依次包含荧光纳米药物和/或荧光染色纳米药物、染色细胞以及膜。
本发明的某些实施方式中，步骤(1)中，按照本领域常规方法建立transwell体外血脑屏障模型。
本发明的某些实施方式中，步骤(1)中，建立transwell体外血脑屏障模型的方法包括如下步骤：
(1-1)将细胞接种于transwell小室的膜上，培养；
(1-2)培养结束后，将transwell小室放入培养板的孔中，向上下池内装入培养液即可，如图1所示。
本发明的某些实施方式中，建立transwell体外血脑屏障模型方法包括如下a至d中的一项或多项：
a.步骤(1-1)中，所述细胞为内皮细胞和/或胶质细胞(例如星型胶质细胞)；
b.步骤(1-1)中，transwell小室中膜的材料为聚乙烯或聚碳酸酯；
c.步骤(1-1)中，培养至细胞呈单层或双层(优选为单层)铺满膜表面且细胞融合，则培养结束；
d.步骤(1-2)中，所述培养板为6孔板、9孔板、12孔板、24孔板或96孔板。
本发明的某些实施方式中，步骤(1-1)中，所述细胞为脑微血管内皮细胞。
本发明的某些实施方式中，步骤(1-1)中，所述细胞为选自大鼠脑微血管内皮细胞、猪脑微血管内皮细胞、牛脑微血管内皮细胞、人脑微血管内皮细胞和bend.3细胞中的至少一种，优选为大鼠脑微血管内皮细胞。
本发明的某些实施方式中，步骤(1-1)中，培养至细胞呈单层铺满膜表面且细胞融合，则培养结束；
优选地，单层细胞为单层脑微血管内皮细胞。
本发明的某些实施方式中，步骤(1-1)中，培养至细胞呈双层铺满膜表面且细胞融合，则培养结束；
优选地，双层细胞为一层脑微血管内皮细胞和一层星型胶质细胞。
本发明的某些实施方式中，步骤(1-1)中，培养时间为1-10天，例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天。
本发明的某些实施方式中，步骤(1-2)中，所述培养板为6孔板。
本发明中，如无特殊说明，
术语“纳米药物”是指药物的纳米级制剂。一般称为药剂学中的纳米粒或称纳米载体、纳米药物，其尺寸界定于1-1000nm之间。其中，纳米载体是指溶解或分散有药物的各种纳米粒。纳米药物则是指直接将原料药加工成纳米粒。
术语“荧光纳米药物”是指自身能发出荧光的纳米药物。“纳米药物”的术语定义见上面。
术语“非荧光纳米药物”是指自身不能发出荧光的纳米药物。“纳米药物”的术语定义见上面。
术语“transwell小室”是指外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1-12μm；膜的材料根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜或聚乙烯膜。
术语“悬浊液”是指纳米颗粒悬浮于液体里形成的混合物。纳米颗粒的尺寸界定于1-1000nm之间。
术语“孵育”是指在细胞培养箱中生长。
术语“pbs”是指磷酸缓冲溶液。
术语“d-hank’s”是指生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液，其不含钙和镁离子，主要用于配制培养液，稀释剂和细胞清洗液，而不能单独作为细胞组织培养液。
术语“dapi”是指4，6-二脒基-2-苯基吲哚。
术语“基础液”是指不含生长因子、双抗、胎牛血清的内皮细胞培养液。
术语“fbs”是指胎牛血清。
术语“as”是指星型胶质细胞。
术语“生长因子ecgs”是指内皮细胞生长因子。
术语“双抗”是指青霉素和链霉素。
术语“转铁蛋白”是指血浆中一种能与铁结合的β1球蛋白，又称β1金属结合蛋白，血浆中的含量为200～300mg/l，转铁蛋白主要在肝脏合成，脾脏、骨髓和淋巴细胞亦可合成。
本发明取得的有益效果：
本发明方法能在体外准确、快速地评价纳米药物的血脑屏障通透性，操作简单、方便，对于纳米药物的测试和研发有重要意义。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为现有的transwell体外血脑屏障模型结构示意图；
其中，1-1为transwell小室，1-2为膜，1-3为细胞，1-4为培养板，1-5为上池，1-6为下池。
图2为本发明中待测样品的示意图；
其中，2-1为膜，2-2为细胞，2-3为纳米药物。
图3为本发明采用激光共聚焦显微镜对待测样品逐层扫描拍照的示意图。
图4为本发明集成侧视图的示意图。
图5为本发明实施例1中评价5nm硅纳米药物的血脑屏障通透性所得到的侧视图。
图6为本发明实施例1中评价100nm硅纳米药物的血脑屏障通透性所得到的侧视图。
图7为本发明实施例1中评价360nm硅纳米药物的血脑屏障通透性所得到的侧视图。
图8为本发明实施例2中100nm硅纳米药物的扫描电子显微镜照片。
图9为本发明实施例2中经转铁蛋白修饰的100nm硅纳米药物的扫描电子显微镜照片。
图10为本发明实施例2中评价经转铁蛋白修饰的100nm硅纳米药物的血脑屏障通透性所得到的侧视图。
图11为对比例中评价多柔比星血脑屏障通透性所得到的侧视图。
具体实施方式
下述实施例和对比例中所使用的材料或试剂如下：
5nm、100nm及360nm硅纳米药物：分别按照文献“fabricationoftwo-andthree-dimensionalsilicananocolloidalparticlearrays”j.phys.chem.b2003,107,3400-3404中的方法合成；
含0.1％(w/w)胶原酶/分散酶(含40μldnasei)的d-hank’s溶液：购买自roche公司；
多柔比星：购买自sigma试剂公司，分子药物。
实施例1评价5nm、100nm及360nm硅纳米药物的血脑屏障通透性(1)sd大鼠脑微血管内皮细胞的分离与transwell体外血脑屏障模型的建立：
将2周龄sd大鼠的脑皮质分离，加入4ml含0.1％(w/w)ii型胶原酶(含120μldnasei)的d-hank’s溶液，放置到37℃水浴锅内消化1.5小时，然后以1000r/min转速在室温下离心8分钟，弃去上清液；加入20％(w/w)bsa重悬后离心(1000g，20分钟，4℃)，去除中层组织及大血管，留取底部沉淀；再加入2ml含0.1％(w/w)胶原酶/分散酶(含40μldnasei)的d-hank’s溶液，消化1小时，然后以1000r/min转速在室温下离心8分钟，弃去上清液，并用percoll(内皮细胞分离液)进行密度梯度离心方法纯化。将最终获得的细胞用内皮细胞专用培养液(含有500ml基础液、25mlfbs、5ml生长因子ecgs、5ml双抗)培养接种于用纤维黏连蛋白包被的细胞培养瓶中，置于37℃含5％co2的培养箱进行孵育，16小时后换全液，之后的2-3天后再换液。待融合致70-80％时，用胰酶(含edta)将其从培养瓶中消化下来，以1.0×106个/孔接种于6孔培养板的各transwell小室的膜(膜材料为聚碳酯膜)上，置于37℃含5％co2的培养箱内培养，至细胞呈融合状态且细胞呈单层铺满膜表面(3-4天)，则结束培养。
(2)transwell体外血脑屏障模型的初评：
向transwell体外血脑屏障模型的上、下池中加入培养基，至上、下池的液面差为0.5厘米，放置4小时后，观察液面差是否减少；同时，用跨内皮电阻仪测试体系的电阻值；测试方法是：将跨内皮电阻仪中u型探头的两个触手分别放入上下池内，检测电阻值。
如果上、下池液面差仍能维持≥0.5厘米(液面差未减小)，且电阻值达到200ω.cm2，则证明模型基本建立成功，可进行下一步实验。
(3)加入待测纳米药物：
将2mg呈绿色荧光的5nm硅纳米药物、2mg掺杂有绿色荧光素fitc的100nm硅纳米药物和2mg掺杂有绿色荧光素fitc的360nm硅纳米药物(掺杂荧光素fitc的方法请参见文献“synthesisofbiomolecule-modifiedmesoporoussilicananoparticlesfortargetedhydrophobicdrugdeliverytocancercells”small2011,7,no.13,1816–1826)分别分散在20mld-hank’s中，充分超声搅拌后，分别得到悬浊液。将1ml悬浊液加入模型的上池中，随后将模型在37℃、含5％co2的培养箱中静置1小时。
(4)制备待测样品：
静置结束后，取出模型中的小室，从小室底层取下膜，用pbs或d-hank’s反复冲洗膜表面，清洗除掉未进入细胞的纳米药物，随后将膜浸泡入pbs或d-hank’s中，向其中滴加即用型dapi溶液(10μg/ml)进行细胞核染色，染色后的细胞核呈荧光亮蓝色，取出膜，得到待测样品，如图2所示。
(5)激光共聚焦显微镜扫描拍照：
如图3所示，采用激光共聚焦显微镜对待测样品沿厚度方向逐层扫描拍照，扫描拍照的范围是由最底层开始出现细胞核所染的荧光亮蓝色至最上层纳米药物的荧光绿色消失为止。激光共聚焦显微镜的放大倍率为40倍率，步进为0.8微米；激光共聚焦显微镜采用多波段激发(发射)波长，对应于荧光绿的激发波长为495nm、发射波长为519nm，对应于荧光亮蓝色的激发波长为360nm、发射波长为460nm。
(6)集成侧视图：
将步骤(5)得到的所有图片按扫描的顺序叠加，取叠加后的侧视图，如图4所示。通过观察侧视图评价硅纳米药物的血脑屏障通透性。
如图5-7所示，观察图5可知，5nm硅纳米药物的荧光绿色与细胞所染的荧光亮蓝色相互混合，两种颜色之间无明显的分界线，判断5nm硅纳米药物可以穿透血脑屏障；观察图6可知，100nm硅纳米药物所染的荧光绿色与细胞所染的荧光亮蓝色之间有明显的分界线，且两种颜色几乎无相互混合，判断100nm硅纳米药物不能穿透血脑屏障；观察图7可知，360nm硅纳米药物所染的荧光绿色与细胞所染的荧光亮蓝色之间有明显的分界线，且两种颜色几乎无相互混合，判断360nm硅纳米药物不能穿透血脑屏障。以上评价结果与现有方法的定性测试结果相符。
实施例2评价外层修饰的纳米药物的血脑屏障通透性
经转铁蛋白修饰的100nm硅纳米药物的制备方法如下：称取40mg的100nm硅纳米药物超声分散于10ml甲苯中，形成混悬液；将混悬液注入圆底烧瓶中，再向混悬液中加入150μl(3-环氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷，在60℃及氮气保护下反应5小时；反应结束后，用无水乙醇对样品清洗并离心三次，此时纳米药物颗粒表面已键合上(3-环氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷分子。将得到的样品分散于5mlpbs缓冲液中，再向其中加入450μl转铁蛋白，避光反应30分钟；反应结束后，将样品用去离子水清洗并离心三次，得到经转铁蛋白修饰的100nm硅纳米药物(tf-msn)。
图8-9分别为100nm硅纳米药物和经转铁蛋白修饰的100nm硅纳米药物的扫描电子显微镜照片。
在步骤(3)中，将2mg掺杂有绿色荧光素fitc的100nm硅纳米药物和2mg掺杂有绿色荧光素fitc的经转铁蛋白修饰的100nm硅纳米药物(掺杂荧光素的方法同实施例1)分别分散在20mld-hank’s中，充分超声及搅拌后，分别得到悬浊液。其中，将1ml悬浊液加入模型的上池中，随后将模型在37℃含5％co2的培养箱中静置1小时。其余的步骤与实施例1相同。
得到侧视图如图6与10所示，可知，100nm硅纳米药物所染的荧光绿色与细胞所染的荧光亮蓝色之间有明显的分界线，且两种颜色之间几乎无相互混合(图6)，判断100nm硅纳米药物不能穿透血脑屏障；而经转铁蛋白修饰的100nm硅纳米药物所染的荧光绿色与细胞所染的荧光亮蓝色相互混合，呈青色，且两种颜色之间无明显分界线(图10)，判断经转铁蛋白修饰的100nm硅纳米药物能有效穿透血脑屏障。以上评价结果与现有方法的定性测试结果相符。
对比例评价分子药物的血脑屏障通透性
步骤(3)中，将自带红色荧光的多柔比星加入d-hank’s，充分超声及搅拌后，配置成0.1mg/ml溶液。将1ml溶液加入模型的上池中，随后将模型在37℃含5％co2的培养箱中静置1小时。其余步骤参照实施例1中进行。
得到的侧视图如图11所示，由图中可见，多柔比星的红色荧光与细胞所染的荧光亮蓝色之间存在一定程度的相互混合，呈现品红色；同时，多柔比星的红色荧光与细胞所染的荧光亮蓝色之间也存在明显的分界；故而，根据侧视图无法很好判断多柔比星的血脑屏障通透性。而实际上，多柔比星难以穿透血脑屏障。
因此，与评价其它种类药物的血脑屏障通透性相比，本发明方法更适于评价纳米药物的血脑屏障通透性，评价结果更为准确。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。