本发明属于酸对β-葡萄糖苷酶水解速率的抑制机理研究领域，涉及纤维素底物在有机酸存在的条件下β-葡萄糖苷酶酶水解速率受到抑制及其抑制动力学机理，还涉及不同酸对酶反应速率抑制程度不同，本发明将有助于合理设计木质纤维素预处理技术，以在改进的工艺条件下释放较弱的抑制剂和提高木质纤维素的乙醇转化产量。
背景技术：
纤维素酶(cellulase，又称β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单体酶，而是起协同效应的多组分酶系，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成。
纤维素酶在水解木质纤维素过程中反应速率受到抑制剂影响。这些抑制剂包括有机酸、糖降解产物、以及木质素降解产物，它们使酶的活力减弱，酶水解速率降低。这些抑制剂对纤维素酶反应速率的抑制为化学性抑制，为可逆抑制，包含竞争性、非竞争性、反竞争性和混合型抑制。纤维素酶在可逆抑制中与抑制剂通常以非共价键结合，它们的结合存在解离平衡关系，而这些抑制剂对纤维素酶分子的抑制程度与作用时间无关，是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂浓度以及底物浓度决定的。
长期以来生物工艺中利用微生物发酵生产酶降解木质纤维素生产乙醇的主要包括木质纤维素的预处理、酶水解、微生物发酵产酶和乙醇发酵。研究表明，木质纤维素的预处理在木质纤维素醇化工艺中是至关重要的。但是，其在通过破坏木质素和半纤维素屏障，并破坏结晶纤维素结构变成无定形形式使纤维素可供纤维素酶有效水解的同时，产生的降解产物有机酸等成分对酶反应速率表现出抑制效应，抑制机理尚未清晰。
因此，本发明通过一种木质纤维素预处理过程中的副产物有机酸对β-葡萄糖苷酶酶促反应速率的抑制机理研究方法，基于酶反应动力学原理，定量研究有机酸对β-葡萄糖苷酶酶促反应速率的抑制性能。通过本研究方法获得的酸对β-葡萄糖苷酶反应速率的抑制机理广泛适用酸抑制纤维素酶研究领域。
技术实现要素：
为了克服现有存在的上述问题，本发明提供了一种基于酶反应动力学方法研究有机酸对纤维素酶酶促反应速率的抑制机理的方法，本发明将有助于合理设计木质纤维素预处理技术，以在改进的工艺条件下释放较弱的抑制剂和提高木质纤维素的乙醇转化产量。
木质纤维素预处理副产物中含有机酸成分，有机酸包含甲酸、乙酸、乙酰丙酸等。本发明利用毕赤酵母gs115异源表达草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶，重组β-葡萄糖苷酶在有机酸存在的条件下降解纤维素底物水杨苷，以研究酸对其反应速率的抑制机理，且其抑制机理适用于其他纤维素酶反应抑制研究。异源表达草酸青霉16β-葡萄糖苷酶基因的毕赤酵母gs115接种于250mllb液体培养基中，30℃发酵48h，检测酶的活力为0.5-1iu/ml。
本发明提出的一种木质纤维素预处理降解产物有机酸对酶反应速率的抑制机理研究方法，提出了在1％纤维素底物中酶反应速率被不同浓度范围的有机酸及混合酸的抑制，研究其抑制机理的方法：
a、有机酸抑制酶解反应速率的浓度范围，甲酸浓度范围为1-25mg/ml；
b、乙酸浓度范围为5-30mg/ml；
c、乙酰丙酸浓度范围为10-30mg/ml；
d、甲酸、乙酸和乙酰丙酸混合酸比例为9：2：3，混合酸浓度范围为1-30mg/ml。
酶促反应：取100μlβ-葡萄糖苷酶，加入1％的底物，加入不同浓度的酸，用柠檬酸缓冲液(ph5.0)定容至1ml，置于摇床50℃和150rpm振荡1-2h，后测定其葡萄糖浓度。
葡萄糖比(％)＝(含抑制剂时酶解反应生成的葡萄糖含量/未加入抑制剂时葡萄糖含量)·100％。
本发明还提出了纤维素酶在不同底物浓度中，不同浓度有机酸及混合酸对酶解速率的抑制机理研究方法，其特征在于酸对酶反应速率的抑制程度随底物浓度的不同而变化，所述方法包括以下步骤：
a、底物浓度范围为0-50mg/ml；
b、有机酸抑制酶解反应速率的浓度范围，甲酸浓度范围为1-25mg/ml；
c、乙酸浓度范围为5-30mg/ml；
d、乙酰丙酸浓度范围为10-30mg/ml。
酶解反应：取50μlβ-葡萄糖苷酶，加入不同浓度的底物，加入不同浓度的酸，用柠檬酸缓冲液(ph5.0)定容至500μl，置于50℃水浴反应10-60min，后加入500μldns试剂终止反应，于沸水中煮沸10min，冷却至室温后测定吸光度值。
酶解反应速率(mg/ml·min)＝还原糖含量/反应体系体积。
本发明的有益效果：本发明将有助于合理设计木质纤维素预处理技术，以在改进的工艺条件下释放较弱的抑制剂和提高木质纤维素的乙醇转化产量。
具体实施方式
通过以下具体实施案例，对本发明作详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除本领域的普遍知识和公知常识外，本发明没有特别限制内容。
木质纤维素预处理过程中的副产物有机酸对β-葡萄糖苷酶酶促反应速率的抑制机理研究。基于酶反应动力学原理，定量研究有机酸对β-葡萄糖苷酶酶促反应速率的抑制性能，其抑制性能包括kmapp、ki、km等动力学常数。
实施例一
异源表达草酸青霉16β-葡萄糖苷酶基因的毕赤酵母gs115接种于250mllb液体培养基中，30℃发酵48h，检测β-葡萄糖苷酶的酶活力为0.657iu/ml。
甲酸的有效抑制浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml；
乙酸的抑制浓度分别为10mg/ml、12.5mg/ml、15mg/ml、17.5mg/ml、20mg/ml；
乙酰丙酸的抑制浓度分别为10mg/ml、12.5mg/ml、15mg/ml、17.5mg/ml、20mg/ml；
乙酸和乙酰丙酸的混合酸抑制浓度分别为10mg/ml、12.5mg/ml、15mg/ml、17.5mg/ml、20mg/ml。
分别取100μlβ-葡萄糖苷酶，加入1％的水杨苷，加入上述浓度的甲酸、乙酸、乙酰丙酸和混合酸，用柠檬酸缓冲液(ph5.0)定容至1ml，置于摇床50℃和150rpm振荡2h，后测定其葡萄糖浓度。
表一葡萄糖比
实施例二
酶液的制备如上述实施例一。
水杨苷浓度分别为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml；
甲酸的有效抑制浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml；
乙酸的有效抑制浓度分别为5mg/ml、7.5mg/ml、10mg/ml、12.5mg/ml、15mg/ml；
乙酰丙酸的抑制浓度分别为10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml。
取50μl纤维素酶，加入上述浓度的水杨苷，分别加入上述浓度的甲酸、乙酸、乙酰丙酸，用柠檬酸缓冲液(ph5.0)定容至500μl，甲酸和乙酸置于50℃水浴反应60min，乙酰丙酸反应时间为30min，后加入500μldns试剂终止反应，于沸水中煮沸10min，冷却至室温后测定吸光度值。
表二甲酸酶解反应速率
表三乙酸酶解反应速率
表四乙酰丙酸酶解反应速率