本发明涉及生物检测领域。更具体地，涉及具有4至10个核苷酸单体的寡聚核苷酸的检测方法。
背景技术：
：生物体内天然存在片段长度小于或等于10个nt(核苷酸)的寡聚核苷酸(如转录起始时产生的流产性转录本和长片段核苷酸降解后产生的小片段核苷酸)。现有的发现暗示这些小片段核苷酸在体内可能有重要的生物学作用，但对10个及10个以下的小片段核苷酸一直无法进行定性和定量检测。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一种根据碱基堆积杂交原理设计锁核酸探针，并加以rna副探针辅助，从而可以对10个nt(核苷酸)以下寡聚核苷酸检测的方法。为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：具有4至10个核苷酸单体的寡聚核苷酸的检测方法，包括如下步骤：(1)设计单链锁核酸探针作为主探针，所述单链锁核酸探针为单链dna或单链rna，并且所述单链锁核酸探针与待检测寡聚核苷酸结合的片段上至少具有一个锁核酸单体；优选的主探针为单链dna，因为dna稳定性好，而rna稳定性差、易降解、不利于长期保存及运输(2)设计rna副探针作为辅助探针；(3)将过量的副探针与主探针混合、杂交并检测样本中小片段dna或小片段rna含量。上述具有4至10个核苷酸单体的寡聚核苷酸的检测方法，主探针的长度大于或等于副探针与待检测寡聚核苷酸的长度之和。上述具有4至10个核苷酸单体的寡聚核苷酸的检测方法，所述单链锁核酸探针与待检测寡聚核苷酸结合的片段上锁核酸位点数大于或等于1且小于或等于待检测寡聚核苷酸的碱基数。上述具有4至10个核苷酸单体的寡聚核苷酸的检测方法，主探针包括a片段和b片段，a片段的长度与副探针的长度相等，b片段的长度与待检测寡聚核苷酸的长度相等；副探针与a片段的核苷酸序列反向互补，且a片段没有与待检测寡聚核苷酸互补的序列；b片段的长度与待检测寡聚核苷酸的长度相等且反向互补，副探针的一端与待检测寡聚核苷酸的一端形成互补关系。上述具有4至10个核苷酸单体的寡聚核苷酸的检测方法，对主探针和副探针采用不同的标记物进行标记，或者仅对主探针进行标记而对副探针不进行标记，或者仅对副探针进行标记而对主探针不进行标记。上述具有4至10个核苷酸单体的寡聚核苷酸的检测方法，主探针和副探针均不能形成发夹结构。上述具有4至10个核苷酸单体的寡聚核苷酸的检测方法，a片段的长度大于19个核苷酸单体。上述具有4至10个核苷酸单体的寡聚核苷酸的检测方法，基于电泳技术进行检测的探针设计与检测程序如下：(1)设计单链锁核酸探针作为主探针，所述单链锁核酸探针为单链dna或rna，并且所述单链锁核酸探针与待检测寡聚核苷酸结合的片段上至少具有一个锁核酸单体；所要检测的小片段dna或小片段rna长度为x，第1位为5′端；设计长度为y+x的单链dna或rna作为主探针，y>19；主探针不能形成发夹结构；主探针第1至y位没有与被检测片段互补的序列，在主探针的第y+1位至y+x位，设计z个锁核酸，1<z<x；主探针的第y+1位至y+x位与所要检测的小片段dna或小片段rna反向互补；(2)设计rna副探针作为辅助探针；设计与主探针第1至y位核苷酸反向互补的rna副探针作为辅助探针；副探针不能形成发夹结构；对主探针和副探针采用不同的标记物进行标记，或者仅对主探针进行标记而对副探针不进行标记，或者仅对副探针进行标记而对主探针不进行标记；主探针第1位为3′端时：主探针y位核苷酸与待检测小片段rna的第1位核苷酸相同，副探针的y位与被检测小片段的第1位形成互补关系；主探针第1位为5′端时：主探针第y位核苷酸与待检测小片段rna的第x位核苷酸相同，副探针的第y位与被检测小片段的第x位形成互补关系；(3)先将过量的副探针与主探针混合，使其形成稳定的局部双链，再与被检测样品孵育杂交，然后根据主探针标记物性质进行检测，确定被检测样品中目标物的丰度。上述具有4至10个核苷酸单体的寡聚核苷酸的检测方法，基于芯片技术进行检测的探针设计与检测程序：(1)设计单链锁核酸探针作为主探针，所述单链锁核酸探针为单链dna或rna，并且所述单链锁核酸探针与待检测寡聚核苷酸结合的片段上至少具有一个锁核酸单体；所要检测的小片段dna或小片段rna长度为x，第1位为5′端；合成长度为10+y+x+8的单链dna或单链rna作为主探针，y>19；主探针的第1-10位为连接片段，主探针的第10+y位核苷酸与待检测小片段dna或小片段rna的第x位核苷酸相同，主探针的第10+y+1位至10+y+x位与待检测小片段dna或小段rna反向互补，第10+y+x+1位核苷酸与待检测小片段dna或小片段rna的第1位核苷酸相同；主探针5′端根据芯片载玻片的化学性质进行修饰；主探针不能形成发夹结构，主探针1至y位不能有与被检测片段互补的序列，在主探针的10+y+1位至10+y+x位设计z个锁核酸，1<z<x；(2)设计rna副探针作为辅助探针；设计副探针1作为辅助探针一：设计与主探针11至10+y位核苷酸反向互补的副探针1作为辅助探针一；设计副探针2作为辅助探针二：副探针2与主探针的第10+y+x+1位至10+y+x+8位反向互补；用可探测的标记物对副探针2进行记，副探针1和副探针2均不能形成发夹结构；(3)将过量的副探针与主探针混合，杂交并检测；将过量副探针1和副探针2与待测样本的smallrna充分混合，然后按现有技术中的常规芯片检测方法检测。本发明的有益效果如下：本发明根据碱基堆积杂交原理设计含锁核酸单体的dna或rna探针，并加以副探针辅助，实现了对10个nt以下寡聚核苷酸的定性和定量检测。y小于19，副探针结合不牢固，灵敏度会降低；在基于芯片技术的检测程序中，与副探针二结合的主探针部分不需要那么长，这是因为：只要副探针一能够和待测片段与主探针稳定结合，副探针二也会与主探针稳定结合。本发明中锁核酸单体的作用：1、增大待测寡聚核苷酸与主探针的结合率；2、增大待测样品的识别率、降低主探针与待测样品的误配率；3、锁核酸的个数一般为1-2个，超过2个锁核酸之后，对检测精度的区别不太明显，从成本角度考虑，锁核酸一般为1个或者2个。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。图1：r4\r6稀释后电泳图泳道1为r6稀释10000倍，泳道2为r6稀释1000倍，泳道3为r6稀释100倍；泳道4为r4稀释10000倍，泳道5为r4稀释100倍，泳道6为r4稀释1000倍(稀释1000、10000倍后，eb染色法灵敏度未能检测出目的片段)。图2：r4\r6稀释后northernblot图泳道1为r6稀释10000倍，条带不明显；泳道2为r6稀释1000倍，隐约有条带；泳道3为r6稀释100倍，条带清晰；泳道4为r4稀释10000倍，条带隐约；泳道5为r4稀释100倍，条带清晰；泳道6为r4稀释1000倍，条带模糊。图3：smallrna电泳图，泳道1、泳道2为复孔。图4：smallrnanorthernblot图，泳道1、泳道2为复孔。图5：本发明中基于电泳技术检测的探针设计方案的示意图(主探针1位为3’端)。图6：本发明中基于电泳技术检测的探针设计方案的示意图(主探针1位为5’端)。图7：本发明中基于基因芯片技术的探针设计方案的示意图。图8：用条带体积(int)(y)对样品浓度(mol/l)(x)进行线性回归所得标准曲线。具体实施方式为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。一、检测方法和原理基于电泳技术进行检测的探针设计与检测程序如下：(1)设计单链锁核酸探针作为主探针，所述单链锁核酸探针为单链dna或rna，并且所述单链锁核酸探针与待检测寡聚核苷酸结合的片段上至少具有一个锁核酸单体；所要检测的小片段dna或小片段rna长度为x，第1位为5′端；设计长度为y+x的单链dna或rna作为主探针，y>19；主探针不能形成发夹结构；主探针第1至y位没有与被检测片段互补的序列，在主探针的第y+1位至y+x位，设计z个锁核酸，1<z<x；主探针的第y+1位至y+x位与所要检测的小片段dna或小片段rna反向互补；(2)设计rna副探针作为辅助探针；设计与主探针第1至y位核苷酸反向互补的rna副探针作为辅助探针；副探针不能形成发夹结构；对主探针和副探针采用不同的标记物进行标记，或者仅对主探针进行标记而对副探针不进行标记，或者仅对副探针进行标记而对主探针不进行标记；如图5所示，主探针第1位为3′端时：主探针y位核苷酸与待检测小片段rna的第1位核苷酸相同，副探针的y位与被检测小片段的第1位形成互补关系；如图6所示，主探针第1位为5′端时：主探针第y位核苷酸与待检测小片段rna的第x位核苷酸相同，副探针的第y位与被检测小片段的第x位形成互补关系；(3)先将过量的副探针与主探针混合，使其形成稳定的局部双链，再与被检测样品孵育杂交，然后根据主探针标记物性质进行检测，确定被检测样品中目标物的丰度。基于芯片技术进行检测的探针设计与检测程序：(1)设计单链锁核酸探针作为主探针，所述单链锁核酸探针为单链dna或rna，并且所述单链锁核酸探针与待检测寡聚核苷酸结合的片段上至少具有一个锁核酸单体；所要检测的小片段dna或小片段rna长度为x，第1位为5′端；合成长度为10+y+x+8的单链dna或单链rna作为主探针，y>19；如图7所示，主探针的第1-10位为连接片段(自由区)，主探针的第10+y位核苷酸与待检测小片段dna或小片段rna的第x位核苷酸相同，主探针的第10+y+1位至10+y+x位与待检测小片段dna或小段rna反向互补，第10+y+x+1位核苷酸与待检测小片段dna或小片段rna的第1位核苷酸相同；主探针5′端根据芯片载玻片的化学性质进行修饰；主探针不能形成发夹结构，主探针1至y位不能有与被检测片段互补的序列，在主探针的10+y+1位至10+y+x位设计z个锁核酸，1<z<x；(2)设计rna副探针作为辅助探针；设计副探针1作为辅助探针一：设计与主探针11至10+y位核苷酸反向互补的副探针1作为辅助探针一；设计副探针2作为辅助探针二：副探针2与主探针的第10+y+x+1位至10+y+x+8位反向互补；用可探测的标记物对副探针2进行记，副探针1和副探针2均不能形成发夹结构；(3)将过量的副探针与主探针混合、杂交并检测样本中小片段rna含量；将过量副探针1和副探针2与待测样本的smallrna充分混合，然后按现有技术中的常规芯片检测方法检测。二、基于电泳技术的检测1体外实验与标准曲线的构建1.1、样品与探针待检测标准品小片段rnar4长4nt，其序列为aaca(由takara合成)。r6长6nt，其序列为aacaga(由takara合成)。根据标准品小片段rnar4和r6序列设计主探针如下：r4主探针(如seqidno:1所示)：tg+ttactcactcgctacaccagctac-digoxigenin(其中+右侧碱基为锁核酸，地高辛请标记在3′端)。r6主探针(如seqidno:2所示)：t+ctg+ttactcactcgctacaccagctac-digoxigenin(其中+右侧碱基为锁核酸，地高辛请标记在3′端)。r4与r6共同副探针(如seqidno:3所示)：guagcugguguagcgagugagu。1.2、实验方法：1.2.1、仪器、试剂、材料(一)仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，uv交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉(或微波炉)，离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。(二)材料rna、主副探针、尼龙膜(三)试剂：northernmaxkit、rnase抑制剂(rnasin)、18％(质量百分比)琼脂糖凝胶(预制胶)，depc、x光底片、底片暗盒、10xbuffer、sephadexg-50、sds、双氧水、灭菌水等。所有玻璃器皿均在180℃高温下烘烤4～6小时，塑料器皿均用0.1％(质量百分比)depc水处理过夜并高压灭菌，所有试剂配制均要用0.1％(质量百分比)depc处理并高压灭菌后的超纯水(rnase-freeh2o)配制。1.2.2、方法与步骤主副探针预结合电泳检测1、将小rna溶解于甲酰胺中，电泳玻璃板、梳子、胶条用3％h2o2浸泡30min，再用0.1％dpec处理并高压灭菌的水冲洗干净。2、将18％琼脂糖凝胶预制胶灌入步骤1处理晾干后的电泳装置中。试剂配方尿素(8mol/l)12.6g40％(质量百分比)arc-bis11.8ml5×tbe6mlrnase-freeh2o3.2ml10％(质量百分比)aps80μltemed12μl3、混合均匀后水平灌胶，小心插入梳子，室温下静置30min。4、拔取梳子，将凝胶固定在电泳槽上，并用1×tbe电泳缓冲液住满上层及下层槽，120v预电泳18min。5、将待检小片段核苷酸1od的r4(对应的mol浓度为3.87×10-5mol/l)和r6(对应的mol浓度约2.54×10-5mol/l)分别稀释100倍和1000倍和10000倍，加入10μl的样本和等体积的2×变性缓冲液，于80℃变性处理5min，迅速至于冰水浴冷却5min。6、0.1％depc处理并高压灭菌水吹洗梳孔并排尽孔中尿素，将上步骤处理的样本加入到梳孔中，150v电泳25min，使样品进入凝胶中，然后电压升高至180v，继续电泳70min。northernblot验证1、剥胶：利用bio-rad湿转转印仪将rna从变性胶中转移到硝酸纤维素膜(hybonen+)上；2、按胶块大小剪取一块膜和两张普通滤纸，剪取膜一角以作标记，浸泡在0.5×tbe中别用；3、在0.5×tbe中轻轻冲洗胶块以除掉其表面的碎胶，然后将胶块整齐的放在膜上，并用玻璃棒排尽之间的气泡，再将另一张已经浸湿的滤纸平铺在胶块上；4、卡上转印仪负极板，接通电源，以4ma/cm2恒流转移2.5h，在转膜过程中，将转印仪置入冰槽中，每隔30min更换冰水浴；5、转移结束后，小心揭去上层滤纸及胶块，将膜取出置于紫外交联仪中交联2min，3次，然后80℃烘烤50min，最后用保鲜膜将膜封好，4℃保存备用。探针标记预杂交：将杂交液预热到60℃，将膜置于热密封的杂交袋中，加杂交液(1ml/5cm2膜)。60℃缓慢振摇，预杂交1.5h。杂交：按15nmol/l的终浓度将主副探针孵育后的探针加入杂交液，杂交液完全覆盖膜，不能有气泡，温和振摇，孵育温度55℃，孵育杂交过夜(16h)。洗脱、封闭和检测用washingbuffer洗膜5min后，blockingbuffer孵育30min。将膜置于antidigoxigenin-apconjugatsolution(1:20000)中孵育20min，再用washingbuffer洗2次，每次30min，最后在dectionbuffer中平衡5min。加cdp-star均匀覆盖膜，孵育5min，用单层保鲜膜包裹放入压片夹中，在暗室中取出胶片压片5min，取出胶片在显影液中显影30s，蒸馏水中洗膜6次，定影液中定影1min，观察、扫描图片。实验结果如图1和图2所示：图1中，泳道1为r6稀释10000倍，泳道2为r6稀释1000倍，泳道3为r6稀释100倍；泳道4为r4稀释10000倍，泳道5为r4稀释100倍，泳道6为r4稀释1000倍，可以看出，稀释1000、10000倍后，eb染色法灵敏度未能检测出目的片段。图2中，泳道1为r6稀释10000倍，条带不明显；泳道2为r6稀释1000倍，隐约有条带；泳道3为r6稀释100倍，条带清晰；泳道4为r4稀释10000倍，条带隐约；泳道5为r4稀释100倍，条带清晰；泳道6为r4稀释1000倍，条带模糊。利用imagelab软件对图2进行分析检测，可以得到如下结果：根据上面的结果，用条带体积(int)(y)对样品浓度(mol/l)(x)进行线性回归，标准曲线如图8所示，得到回规方程式y＝9×10-12x-3×10-8r2＝0.999，结果表明r4在3.87×10-7-3.87×10-9mol/l有着良好的线性关系，r6在2.54×10-7-2.54×10-9mol/l浓度范围内有着良好的线性关系。上述结果表明，可以探测到4nt的寡聚核苷酸，用地高辛标记法其可探测的最小浓度为2.54×10-9mol/l；本领域技术人员在本发明公开的技术方案的基础上，可以根据实际检测中灵敏度的需要，更换其他标记物，如采用放射性标记，其灵敏度可以进一步提高。三、细胞内表达检测实验为了验证上述检测方法对体内天然小片段rna检测的可行性，我们检测了大肠杆菌重组酶a(recombinasea,reca)的流产性转录本r6(序列同上)的含量(reca在大肠杆菌中表达稳定，是公认的大肠杆菌内参基因，研究发现每一次基因转录都会有流产性转录本的产生，所以大肠杆菌体内天然就有r6的存在)。1、实验方法1.1菌种实验所用大肠杆菌bl21购自南京博世鑫生物有限公司1..3试剂试剂名称来源胰蛋白胨amresco酵母提取物amresco琼脂粉生工生物琼脂糖amresco乳糖sigmanorthernmaxkitthermornaisoforsmallrnatakara预制胶(5-20％)life溴化乙锭(eb)amerscodnaladderthermofisherr6主、副探针同上1.4仪器设备所有玻璃器皿均在180℃高温下烘烤4～6h，塑料器皿均用0.1％depc水处理过夜并高压灭菌，所有试剂配制均要用0.1％depc处理并高压灭菌后的超纯水(rnase-freeh2o)配制。2、实验步骤2.1、将bl21菌种活化后，进行划线培养，随机挑取平板上的菌落，接种于4ml液体培养基中，37℃振荡培养过夜。2.2、smallrna提取(1)取1mlbl21培养液，8000g，4℃离心5min，弃上清。(2)加入1ml的rnaisoforsmallrna，移液枪反复吹洗直至裂解液中无明显沉淀。(3)室温静置5min。(4)上述步骤(3)中加入200μl氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s，待充分乳化后，在室温静置5min。(5)12000g，4℃离心15min。(6)从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中。(7)向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10min。(8)12000g4℃离心10min。(9)小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％(质量百分比)的乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12000g4℃离心5min后小心弃去乙醇。(10)室温干燥沉淀2～5min加入适量的rnase-free水溶解沉淀，然后用移液枪轻轻吹打沉淀，待rna沉淀完全溶解后于-80℃保存。2.3、smallmrna电泳检测1、将小rna溶解于甲酰胺中，电泳玻璃板、梳子、胶条用3％(质量百分比)h2o2浸泡30min，再用0.1％dpec处理并高压灭菌的水冲洗干净。2、将预制胶灌入步骤1处理晾干后的电泳装置中。3、混合均匀后水平灌胶，小心插入梳子，室温下静置30min。4、拔取梳子，将凝胶固定在电泳槽上，并用1×tbe电泳缓冲液住满上层及下层槽，120v预电泳18min。5、向待检smallrna加入等体积的2×变性缓冲液，于80℃变性处理5min，迅速至于冰水浴冷却5min。6、0.1％depc处理并高压灭菌水吹洗梳孔并排尽孔中尿素，将上步骤处理的样本加入到梳孔中，150v电泳25min，使样品进入凝胶中，然后电压升高至180v，继续电泳70min。2.4、主副探针预结合2.5、northernblot验证1、剥胶：利用bio-rad湿转转印仪将rna从变性胶中转移到硝酸纤维素膜(hybonen+)上；2、按胶块大小剪取一块膜和两张普通滤纸，剪取膜一角以作标记，浸泡在0.5×tbe中别用；3、在0.5×tbe中轻轻冲洗胶块以除掉其表面的碎胶，然后将胶块整齐的放在膜上，并用玻璃棒排尽之间的气泡，再将另一张已经浸湿的滤纸平铺在胶块上；4、卡上转印仪负极板，接通电源，以4ma/cm2恒流转移2.5h，在转膜过程中，将转印仪置入冰槽中，每隔30min更换冰水浴；5、转移结束后，小心揭去上层滤纸及胶块，将膜取出置于紫外交联仪中交联2min，3次，然后80℃烘烤50min，最后用保鲜膜将膜封好，4℃保存备用。2.6、探针标记预杂交：将杂交液预热到60℃，将膜置于热密封的杂交袋中，加杂交液(1ml/5cm2膜)。60℃缓慢振摇，预杂交1.5h；杂交：按15nmol/l的终浓度将主副探针孵育后的探针加入杂交液，杂交液完全覆盖膜，不能有气泡，温和振摇，孵育温度55℃，孵育杂交过夜(16h)。2.10洗脱、封闭和检测用washingbuffer洗膜5min后，blockingbuffer孵育30min。将膜置于antidigoxigenin-apconjugatsolution(1:20000)(质量百分比)中孵育20min，再用washingbuffer洗2次，每次30min，最后在dectionbuffer中平衡5min。加cdp-star均匀覆盖膜，孵育5min，用单层保鲜膜包裹放入压片夹中，在暗室中取出胶片压片5min，取出胶片在显影液中显影30s，蒸馏水中洗膜6次，定影液中定影1min，观察、扫描图片。rna提取、northernblot步骤与前面所述步骤一致，smallrna提取结果如图3所示，northernblot结果如图4所示。泳道1和2为重复实验。根据图4的结果，用imagelab分析表明，泳道1中条带的体积为43533int，泳道2为41098int，根据标准曲线，可以计算出它们对应的浓度约为3.62×10-7和3.40×10-7mol/l。四采用芯片法检测的方案待检测标准品小片段rnar4长4nt,其序列为aaca(由takara合成)。r6长6nt，其序列为aacaga(由takara合成)。用芯片法检测，其探针可以设计为：r4主探针(如seqidno:4所示)：tacgatcatg+ttactcactcgctacaccagctacgcacaaaaaaaaaa-nh2(其中+右侧碱基为锁核酸，3′端用nh2修饰，以便于探针的固定)。r6主探针(如seqidno:5所示)：tacgatcat+ctg+ttactcactcgctacaccagctacgcacaaaaaaaaaa-nh2(其中+右侧碱基为锁核酸，3′端用nh2修饰，以便于探针的固定)。r4与r6共同副探针一(如seqidno:6所示)：guagcugguguagcgagugagu。r4和r6共同的副探针二：tgatcgta-hex(绿色荧光标记在3′端)。按常规芯片检测方法(现有技术中已知的芯片检测方法)检测，结果表明：同样可以探测到4nt的寡聚核苷酸，可探测的最小浓度为2.54×10-9mol/l。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。当前第1页12