专利名称：一种牙鲆用复合核苷酸免疫增强剂的制作方法
技术领域：
本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种牙鲆用复合核苷酸免疫增强剂。
背景技术：
牙鲆是我国重要的海水养殖鱼类之一，其肉质鲜美、营养价值丰富。随着牙鲆工厂化养殖规模和密度的加大，疾病发生率也不断增大，给养殖业带来了很大的经济损失。养殖者不得不使用抗生素来预防和治疗疾病。但抗生素长期使用，极易产生抗药性，致使水产养殖动物本身的免疫力下降，严重影响水产品的质量，尤其是导致整个水体的环境污染。因此绿色无公害免疫增强剂的开发和使用成为一种趋势。
发明内容
本发明目的是提供一种牙鲆用复合核苷酸免疫增强剂，即将各种单一核苷酸按比例进行合理搭配，提供一种牙鲆用的复合核苷酸免疫增强剂，以减少疾病对牙鲆养殖造成的危害，保障牙鲆养殖业的健康发展。本发明的牙鲆用复合核苷酸免疫增强剂，由如下的重量百分比的物质组成胞嘧啶核苷酸55 65%、尿嘧啶核苷酸5 15%、胸腺嘧啶核苷酸5 15%、次黄嘌呤核苷酸I 5%、生物活性肽10 20%。本发明的复合核苷酸免疫增强剂的制备方法如下先按照重量百分比分别称取胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、次黄嘌呤核苷酸和生物活性肽，进行粉碎成粉状后过筛，筛网细度为80-120目，再将粉末进行干燥完成制备。本发明的复合核苷酸免疫增强剂用作牙鲆的饲料添加剂。本发明的复合核苷酸免疫增强剂能够明显提高牙鲆的摄食和生长，显著提高牙鲆的细胞免疫、体液免疫、免疫基因表达量和疾病抵抗力等。而且，还可以直接添加到牙鲆饲料中，口服投喂；具有无毒副残留性、无抗药性，不污染环境的优点。
具体实施例方式核苷酸是生物体内重要的低分子化合物，近年来也被认为是半必需营养素。它参与到动物体内的生理、生化过程中起重要调节作用，同时能刺激动物的特异性、非特异性免疫反应，影响与免疫有关细胞的发生与分化以及巨噬细胞、辅助性T细胞的活性与数量及其分泌的白细胞介素2、3 (IL-2、3)，最后影响细胞免疫。其中嘌呤碱或嘧啶碱参与到鱼类的一些生理生化反应过程中，包括基因信息的编码与解码，能量代谢和细胞信号的调停。同时也是构成辅酶，变构效应因子及细胞兴奋剂的成分。生物活性肽是一类分子量小于6000道尔顿、结构较松散且具有多种生物学功能的小肽。它存在于机体中的各种组织中，在机体内发挥着相当重要的作用。申请人:在长期的研究中发现，将核苷酸与生物活性肽进行复配制成免疫增强剂，能够更有效的发挥核苷酸的免疫效果，从而促成了本发明。
为了更清楚的理解本发明以及本免疫增强剂的疗效，以下通过具体实施例和相关试验对本发明作进一步的详细描述。实施例1按重量百分比分别称取购自山东双凤股份有限公司的胞嘧啶核苷酸60g、尿嘧啶核苷酸8g、胸腺卩密唳核苷酸10g、次黄嘌呤核苷酸(hypoxanthine nucleotide ;IMP)2g和购自北京桑普生物技术有限公司的生物活性肽20g，将混合物进行研磨粉碎后用筛子过筛，其中筛孔的细度要求为80-120目。将过滤后的粉剂进行通过干燥，至粉剂重量比干燥前减少10% ;从而制成所需的免疫增强剂。实施例2按重量百分比分别称取购自山东双凤股份有限公司的胞嘧啶核苷酸55g、尿嘧啶 核苷酸log、胸腺嘧啶核苷酸15g、次黄嘌呤核苷酸5g和购自北京桑普生物技术有限公司的生物活性肽15g。细度要求为80-120目，干燥失重< 10.0%。得所需的免疫增强剂。实施例3按重量百分比分别称取购自山东双凤股份有限公司的胞嘧啶核苷酸65g、尿嘧啶核苷酸5g、胸腺嘧啶核苷酸15g、次黄嘌呤核苷酸3g和购自北京桑普生物技术有限公司的生物活性肽12g。细度要求为80-120目，干燥失重< 10.0%。得所需的免疫增强剂。上述免疫增强剂的使用方法与用量为将免疫增强剂按每公斤牙鲆饲料中添加免疫增强剂O. 2-0. 5克，制成颗粒饲料进行投喂。以下结合复合核苷酸免疫增强剂饲喂试验得出的非特异性免疫指标和疾病抵抗力对本发明作进一步说明。实施例4养殖试验依据发明中实施例1中核苷酸和生物活性肽的浓度配比复合核苷酸，设置不同浓度梯度，对初始体重IOg左右的牙鲆进行养殖。实验共分5个处理。每个处理3个重复。每天饱食投喂两次。试验过程中，水温18±1°C、溶氧7. 9-8. 2mg/L、盐度平均32±1%。。养殖试验开始后的第1、2、3、4周分别取样。取样之前鱼禁食24h，从每个处理中随机选4尾鱼。重击鱼头部使其昏迷，用I毫升注射器从尾静脉抽血。收集于离心管中，室温下静置24h后离心(3000Xg，10min，4°C )，分离血清，于-70°C下保存备用。头肾巨噬细胞的分离采用Ortufi0的方法并稍作修改。取下头肾，研磨，过100目筛絹制成细胞悬液，percoll梯度离心，分离细胞并调整至IO7细胞/ml，培养于96孔板中备用，测定免疫相关指标。头肾巨噬细胞免疫指标主要测定了氧呼吸爆发活性、吞噬活性及巨噬细胞增殖活性；体液免疫指标主要测定了血清溶菌酶活力及血清替代途径补体活力。另外分别在实验开始后的第二周和第四周进行攻毒试验，攻毒试验所用的菌为鳗弧菌，分别从每个处理随即选取12条鱼进行攻毒试验，每尾鱼注射鳗弧菌Iml (约IO8Cfu),记录攻毒后14天的死亡率并计算累计死亡率和相对存活率。研究结果显示摄食复合核苷酸后，牙鲆头肾巨噬细胞免疫活力与对照组相比均有不同程度的提高，在实验梯度范围内，复合核苷酸添加量为0. 03%实验组的免疫力影响最明显。牙鲆血清补体活力与对照组相比也均有不同程度的提高，其中复合核苷酸添加量为0. 03%实验组影响最大，且在试验后第三周影响达到最大。血清溶菌酶活力的变化与补体活力变化基本一致。攻毒试验结果显示两次攻毒实验中，复合核苷酸添加量为O. 02%实验组死亡率最低，且随着浓度的增加，死亡率增加。在两次攻毒实验中，同一注射浓度下在第二周的死亡率比第四周低。攻毒试验结果与免疫指标测定结果一致。按照实施例1制备的免疫增强剂去掉生物活性肽的配方来配制仅有核苷酸的增强剂，按照上述的条件进行养殖实验，结果表明去掉生物活性肽的增强剂的免疫效果差于添加组，死亡率高出O. 5-0. 7%。从而证明生物活性肽能够有效的提高核苷酸的免疫活性。实施例5、实际养殖应用实验地点为山东省鳌山卫养殖厂，试验中将健康牙鲆分为两组，在鱼饲料中使用按照实施例2制备的复合核苷酸免疫增强剂，每公斤饲料中添加O. 3克。投喂3个月后，实验组10个池中牙鲆平均体重为43±3g，空白对照组牙鲆平均体重为34. 7±4g，试验组的死亡率比空白组低5. 8%。
权利要求
1.一种复合核苷酸免疫增强剂，由如下的重量百分比的物质组成胞嘧啶核苷酸55 ·65%、尿嘧啶核苷酸5 15%、胸腺嘧啶核苷酸5 15%、次黄嘌呤核苷酸I 5%，生物活性肽·10 20%o
2.权利要求1所述的复合核苷酸免疫增强剂的制备方法，首先分别称取胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、生物活性肽，进行粉碎成粉状后过筛,筛网细度为80-120目，再将粉末进行干燥完成制备。
3.权利要求1所述的复合核苷酸免疫增强剂在制备牙鲆的饲料添加剂中的应用。
4.权利要求1所述的免疫增强剂的使用方法，是将免疫增强剂按每公斤饲料中添加·0.2-0. 5克的剂量来添加到饲料中。
全文摘要
本发明涉及一种牙鲆用复合核苷酸免疫增强剂，由如下的重量百分比的物质组成胞嘧啶核苷酸55～65%、尿嘧啶核苷酸5～15%、胸腺嘧啶核苷酸5～15%、次黄嘌呤核苷酸1～5%、生物活性肽10～20%。本发明的复合核苷酸免疫增强剂能够明显提高牙鲆的摄食和生长，显著提高牙鲆的细胞免疫、体液免疫、免疫基因表达量和疾病抵抗力等。而且，还可以直接添加到牙鲆饲料中，口服投喂；具有无毒副残留性、无抗药性，不污染环境的优点。
文档编号A23K1/16GK103005164SQ20121059422
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月29日 优先权日2012年12月29日
发明者王正丽, 杨宁 申请人:青岛农业大学