专利名称：液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法
技术领域：
本发明涉及ー种菌粉，尤其是涉及ー种液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法。
背景技术：
冬虫夏草，是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，是ー种传统的名贵滋补中药材，有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳等多种功效。冬虫夏草生长在寒冷高海抜的地区，其生长的环境和条件比较苛刻。由于野生虫 草的生长环境不断受到破坏，虫源锐减，加上人为采集的过量过早，导致野生虫草资源日益匮乏。为了满足市场需求，人工培养冬虫夏草成为了主要的来源。但因为其エ艺复杂，生长周期长及产量低的问题就出现人工发酵冬虫夏草的方法。通过科研工作者的不断研究，发现人工发酵虫草菌丝体其主要药理药化成分基本类似于天然虫草，这就为冬虫夏草人工发酵奠定了重要的理论支持。在国内也有很多科研工作者发表了相关的专利，中国专利CN1478886A公开ー种中国被毛胞液体菌种发酵エ艺方法，该申请公开了发酵所用的菌种的获取、ー级固体三角瓶菌种培养、液体种子培养、液体发酵罐生产エ序，其不足之处是发酵周期长，为456h。中国专利CN101134940B公开ー种冬虫夏草真菌-蝙蝠蛾被毛胞的发酵方法，该申请公开了发酵所用培养基成分、发酵エ艺控制參数，其不足之处是发酵周期长，发酵周期长达720h，能耗高，发酵罐利用率低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供ー种液体发酵产生冬虫夏草菌粉的方法，克服了现有技术中冬虫夏草液体发酵周期过长、菌丝得率低以及发酵罐利用率低等问题。本发明包括如下步骤I)斜面菌种培养配制斜面培养基,所述斜面培养基的组分为葡萄糖15 35g/L、蛋白胨0. 5 4g/L、MgSO4 7H201 5g/L、KH2PO4O. 5 lg/L、大豆浸汁 150 250mL/L、辅液 I I 4mL/L、琼脂20 25g/L、其余为水，pH5. 9 6. 6，以上各组分除辅液Iタト，于121°C灭菌30min，辅液I于118°C単独灭菌22min后加入无菌培养基，接种环粘少量无菌水，把冬虫夏草菌种从保藏斜面上接入无菌斜面进行培养，待斜面长满新鮮成熟孢子即可；在步骤I)中，所述冬虫夏草菌种为冬虫夏草(Cordycepes sinensis(Berk. )Sacc)菌种，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC50562 ；所述辅液I组分可为盐酸硫胺I 4g/L、核黄素I 4g/L、维生素B30. 5 Ig/L、盐酸吡哆素0. 6 1. 2g/L、甘氨酸0. 8 1. 4g/L、生物素0. 08 1. 2g/L、赤霉素0. 02
0.04g/L、NaSeO3O. 001 0. 004g/L，其余为水；所述大豆浸汁的制备方法可为称取150 200g马铃薯，洗浄去皮切碎，加水煮沸半个小时，纱布过滤，最后定容到IOOOmL ；所述培养的条件可为湿度控制在45% 55%，在15 18°C下恒温培养15 25天。2)大米孢子培养配制固料培养基，由固料以及营养液组成，其中固料营养液=Ig (0.5 0.7)mL，固料由大米和麸皮组成，其中大米麸皮按质量比为7 3，营养液组分除去琼脂以外与斜面培养基的组分相同，固料与营养液混匀后75 80°C蒸或煮，冷却至室温后将成团的大米弄散，装入K瓶，121°C灭菌30 40min，灭菌完后充分抖散，使固料培养基厚度保持在·I 4cm，向长满孢子的斜面加入无菌生理盐水，用接种铲将孢子刮下，将孢子浓度控制在1.0 2. 5X IO6个/mL，按固料质量体积比的3% 6%将孢子悬液均匀的喷在固料培养基的表面，抖动均匀后保持厚度在I 4cm，培养条件为湿度控制45% 55%，温度控制15 18°C，每隔6h翻抖一次固料，待长出菌丝体后静止培养，长满孢子后加入无菌生理盐水震荡制成孢子悬液，其中每粒亲米孢子数量为0. 02 0. 04X IO9个/粒，按照体积比为1% 5%接入一级种子罐培养；在步骤2)中，所述蒸或煮的时间可为30 40min ;所述静止培养的时间可为5 9d;所述孢子的浓度可为0.8 1. 6 X IO9个/し3)发酵培养(I) 一级种子罐培养配制ー级种子培养基，其组分为大豆浸汁200 300mL/L、葡萄糖10 30g/L、蔗糖 10 30g/L、酵母浸膏 5 20g/L、蛋白胨 5 20g/L,KH2PO4L 5 4g/L,MnSO4O. 03 0. 06g/L、NaC15 20g/L、氯化铵 0. 2 0. 6g/L、氯化钙 0. 01 0. 06g/L、辅液 II I 4mL/し其余为水，以上组分除辅液I1、葡萄糖外，于121°C灭菌30min，辅液I1、葡萄糖于118°C单独灭菌22min后添加到ー级种子罐中，其中辅液II的组分为盐酸硫胺0.1 0. 4g/L、核黄素0. 5 2g/L、维生素B30. 5 2g/L、盐酸卩比卩多素0. 3 0. 6g/L、甘氨酸0. 8 1. 6g/L、生物素0. 04 0. 08g/L、赤霉素0. 02 0. 06g/L,NaSeO3O. 002 0. 006g/L，其余为水;把步骤2)培养好的孢子接入ー级种子罐，培养条件为pH维持在5. 9 6. 6、温度18 20°C、罐压0. 03 0. 05MPa、通气比V V=1: (0. 5 0. 8)、转速为130 170r/min、连续培养50 70h，待菌丝长稠呈丝状，菌丝团大小均一，有中小空泡即可移入ニ级发酵罐；(2) ニ级发酵培养配制ニ级发酵培养基，其组分为大豆浸汁200 300mL/L、葡萄糖10 30g/L、蔗糖 10 30g/L、酵母浸膏 0. 5 2g/L、蛋白胨 I 4g/L,KH2PO4O. 5 4g/L,MnSO4O. 03
0.08g/L、NaCl5 30g/L、氯化铵 2 8g/L、氯化钙 0. 05 0. 3g/L、辅液III 20 40mL/L,其余为水，以上组分除辅液II1、葡萄糖外，于121°C灭菌30min，辅液II1、葡萄糖于118°C単独灭菌22min后添加到ニ级种子罐中，其中辅液III组分为维生素B10. 02 0. 08g/L、维生素B20. 01 0. 06g/L、维生素 B60. 03 0. 09g/L、烟酰胺 0. 5 lg/L、甘氨酸 0. 4 lg/L、生物素0. 004 0. 008g/L、赤霉素0. 01 0. 04g/L，其余为水，将ー级种子发酵罐培养好的菌丝按体积百分比20% 30%的接种量移入ニ级发酵罐，培养条件为pH维持在5. 9 6. 6、温度 18 20°C、罐压 0. 03 0. 05MPa、通气比 V V=1: (0. 6 0. 9)、转速 130 150r/min,在发酵24h、40h、56h时分别补加体积比为1% 5%的全料和0. 5% 2%的葡萄糖，其中全料的组分为酵母浸膏2 6g/L、蛋白胨2 12g/L、KH2P043 10g/L、MnS040. 2 0. 4g/L、NaCl2 5g/L、氯化铵 6 15g/L、氯化钙 0. 2 0. 4g/L，辅液III 20 40mL/L,于 121。。灭菌40min，葡萄糖浓度为24 48g/L，于118°C灭菌22min ；连续发酵至70 90h，待残糖< 0. 5% 1%，氨态氮< 0. 05% 0. 1%，镜检菌丝产量大量孢子时即可出罐；4)制备菌粉收集发酵液进行过滤，用无菌水洗涤菌体、过滤，重复三次，然后离心收集菌体，将菌体置于60°C烘干至衡重，用超微粉碎法将干的菌体制成菌粉。本发明有益效果是按照上述エ艺发酵生产冬虫夏草菌粉能够有效缩短发酵时间，约为120 160h，菌体产率达到4% 6%，菌体干重达到40 60g/L，提高发酵罐利用率及产能，节约生产成本，能达到エ业化生产的要求。
具体实施例方式以下实施例将对本发明作进ー步的说明。实施例1 :把冬虫夏草(Cordycepessinensis (Berk. )Sace)菌种 ACCC50562 从保藏斜面上接入无菌斜面进行培养，培养条件为湿度控制在45%，15°C恒温培养15天，待斜面长满新鲜孢子即可。斜面培养基组分为葡萄糖15g/L、蛋白胨0. 5g/L、MgS04 *7H201g/L,KH2P040. 5g/し大豆浸汁150mL/L、辅液I lmL/L、琼脂20g/L、其余为水，pH5. 9，以上组分除辅液I夕卜，于121°C灭菌30min，其中辅液I于118°C単独灭菌22min后加入培养基，辅液I的组分为盐酸硫胺lg/L、核黄素lg/L、维生素B30. 5g/L、盐酸吡哆素0. 6g/L、甘氨酸0. 8g/L、生物素
0.08g/L、赤霉素0. 02g/L、NaSeO3O. 001g/L，其余为水。大豆浸汁制备方法称取150g马铃薯，洗净去皮切碎，加水煮沸半个小时，纱布过滤，最后定容到1000mL。将斜面孢子转接到固料培养基，固料培养基由固料以及营养液组成，其中固料:营养液(w/v)=lg 0.6mL，其中固料大米麸皮质量比为7 3，其中营养液组分为同斜面培养基(除去琼脂)，固料与营养液混匀后80°C蒸煮30min，晾干冷却，使固料培养基厚度保持约2cm。向长满孢子的斜面加入无菌生理盐水，用接种铲将孢子刮下，将孢子浓度控制在
1.OX IO6个/mL，按固料质量体积比的3%将孢子悬液均匀的喷在固料培养基的表面，充分抖动均匀后保持厚度约2cm，培养条件为湿度控制45%，温度控制15°C，每隔6h翻抖一次固料，待长出菌丝体后静止培养5 9d，长满孢子后加入无菌生理盐水震荡制成孢子悬液，孢子浓度控制在0. 8 X IO9个/L，其中每粒亲米孢子数量为0. 03 X IO9个/粒，按照体积比为1%接入ー级种子罐培养。一级种子培养基组分大豆浸汁200mL/L、葡萄糖10g/L、蔗糖10g/L、酵母浸膏5g/し蛋白胨 5g/L、KH2P04l. 5g/L,MnSO4O. 03g/L、NaC15g/L、氯化铵 0. 2g/L、氯化钙 0. 01g/L、辅液II lmL/L，其余为水，以上组分除辅液II和葡萄糖外，于121°C灭菌30min，辅液I1、葡萄糖于118°C単独灭菌22min后添加到ー级种子罐中，其中辅液II的成分为盐酸硫胺0. lg/L、核黄素0. 5g/L、维生素B30. 5g/L、盐酸卩比卩多素0. 3g/L、甘氨酸0. 8g/L、生物素0. 04g/L、赤霉素0. 02g/L、NaSeO3O. 002g/L，其余为水，培养条件pH5. 9、温度18°C、罐压维持0. 03MPa、通气比V: V=1:0. 5、转速为150r/min、连续培养50h，待菌丝长稠呈丝状，菌丝团大小均一，有中小空泡即可移入200L ニ级发酵罐。ニ级发酵培养基大豆浸汁200mL/L、葡萄糖10g/L、蔗糖10g/L、酵母浸膏0. 5g/し蛋白胨 lg/L、KH2P040. 5g/L,MnSO4O. 03g/L、NaC15g/L、氯化铵 2g/L、氯化钙 0. 05g/L、辅液III 20mL/L，其余为水，以上组分除辅液III和葡萄糖外，于121°C灭菌30min，辅液III和葡萄糖于118°C単独灭菌22min后添加到ニ级种子罐中，其中辅液III的成分为维生素BIO. 02g/L、维生素B20. 01g/L、维生素B60. 03g/L、烟酰胺0. 5g/L、甘氨酸0. 4g/L、生物素0. 004g/し赤霉素0. 01g/L，NaSeO3O. 001g/L，其余为水，用压差法将ー级种子罐培养好的菌丝体按照体积百分比20%的接种量移入200L ニ级发酵罐培养，培养条件为pH5. 9、温度18°C、罐压0. 03MPa、通气比V V=1 0. 6、转速130r/min，在发酵24h、40h、56h时分别补加体积比为1%的全料和0. 5%的葡萄糖，其中全料的组分为酵母浸膏2g/L、蛋白胨2g/L、KH2P043g/L、MnSO4O. 2g/L、NaC12g/L、氯化铵 6g/L、氯化钙 0. 2g/L，辅液III 20mL/L,于 121°C 灭菌 40min，葡萄浓度为24g/L, 118°C灭菌22min。连续发酵至70h，待残糖< 0. 5%，氨态氮< 0. 05%,镜检菌丝产量大量孢子时即可出罐收集发酵液进行过滤,用无菌水洗涤菌体、过滤,重复3次，然后离心收集菌体，将菌体置于60°C烘干至衡重，测的干重达到41g/L，菌体得率为4. 1%，发酵周期为120h，用超微粉碎法将干的菌体制成菌粉。实施例2 把冬虫夏草(Cordycepessinensis (Berk. )Sace)菌种 ACCC50562 从保藏斜面上接入无菌斜面进行培养，培养条件为湿度控制在50%，16°C恒温培养20天，待斜面长满新鲜孢子即可。斜面培养基组分为葡萄糖25g/L、蛋白胨2g/L、MgS04 *7H203g/L,KH2P040. 75g/し大豆浸汁200mL/L、辅液I 3g/L、琼脂20g/L、其余为水，pH6. 2，以上组分除辅液Iタト，于121°C灭菌30min，其中辅液I 118°C单独灭菌22min后加入培养基，辅液I的组分为盐酸硫胺3g/L、核黄素3g/L、维生素B30. 75g/L、盐酸吡哆素0. 9g/L、甘氨酸lg/L、生物素0.1g/し赤霉素0. 03g/L、NaSeO3O. 003g/L，其余为水。大豆浸汁制备方法称取180g马铃薯，洗净去皮切碎，加水煮沸0. 5h，纱布过滤，最后定容到1000mL。将斜面孢子转接到固料培养基，固料培养基由固料以及营养液组成，其中固料营养液(w/v)=lg 0.6mL，其中固料大米麸皮质量比为7 :3，其中营养液组分为同斜面培养基(除去琼脂)，固料与营养液混匀后80°C蒸煮30min，晾干冷却，然后按照规格为每IOOOmL的K氏瓶装130g固料培养基，121°C灭菌40min，灭完后充分抖散，使固料培养基厚度保持约2cm左右。向长满孢子的斜面加入无菌生理盐水，用接种铲将孢子刮下，将孢子浓度控制在1. 8X IO6个/mL，按固料质量体积比的4. 5%将孢子悬液均匀的喷在固料培养基的表面，充分抖动均匀后保持厚度约2cm，培养条件为湿度控制50%，温度控制16°C，每隔6h翻抖一次固料，待长出菌丝体后静止培养7d，长满孢子后加入无菌生理盐水震荡制成孢子悬液，孢子浓度控制在1. 2 X IO9个/L，其中每粒亲米孢子数量为0. 03 X IO9个/粒，按照体积比为3%接入ー级种子罐培养。一级种子培养基组分大豆浸汁200mL/L、葡萄糖20g/L、蔗糖20g/L、酵母浸膏Ig/し蛋白胨 lg/L、KH2P042g/L、MnSO4O. 04g/L、NaC110g/L、氯化铵 0. 4g/L、氯化钙 0. 03g/L、辅液II 3mL/L，其余为水，以上组分除辅液I1、葡萄糖外，于121°C灭菌30min，辅液I1、葡萄糖于118°C単独灭菌22min后添加到ー级种子罐中，辅液II的成分为盐酸硫胺0. 2g/L、核黄素lg/L、维生素B31g/L、盐酸卩比卩多素0. 4g/L、甘氨酸lg/L、生物素0. 06g/L、赤霉素0. 04g/L、NaSeO3O. 004g/L,其余为水，培养条件为pH6. 2、温度19で、罐压维持0. 04MPa、通气比V V=I 0. 6、转速为150r/min、连续培养60h，待菌丝长稠呈丝状，菌丝团大小均一，有中小空泡即可移入200L ニ级发酵罐。ニ级发酵培养基大豆浸汁250mL/L、葡萄糖20g/L、蔗糖20g/L、酵母浸膏lg/L、蛋白胨 3g/L、KH2P042g/L、MnSO4O. 06g/L、NaCl 10g/L、氯化铵 6g/L、氯化钙 0. lg/L、辅液III 30mL/L，其余为水，以上组分除辅液II1、葡萄糖外，于121°C灭菌30min，辅液II1、葡萄糖于118°C単独灭菌22min后添加到ニ级种子罐中，辅液III的成分维生素BIO. 06g/L、维生素 B20. 04g/L、维生素 B60. 06g/L、烟酰胺 0. 75g/L、甘氨酸 0. 8g/L、生物素 0. 006g/L、赤霉素0. 02g/L, NaSeO3O. 002g/L，其余为水，用压差法将ー级种子罐培养好的菌丝体按照体积百分比25%的接种量移入200L ニ级发酵罐培养，培养条件为pH6. 2、温度19°C、罐压0. 04MPa、通气比V V=I 0. 7、转速140r/min，在发酵24h、40h、56h时分别补加体积比3%的全料和1%的葡萄糖，其中全料的组分为酵母浸膏4g/L、蛋白胨8g/L、KH2P046g/L、MnSO4O. 3g/L、NaC14g/L、氯化铵 10g/L、氯化钙 0. 3g/L，辅液III 30mL/L，于 121°C 灭菌 40min， 葡萄糖浓度36g/L,于118°C灭菌22min。连续发酵至80h，待残糖< 0. 8%，氨态氮< 0. 08%,镜检菌丝产量大量孢子时即可出罐收集发酵液进行过滤,用无菌水洗涤菌体、过滤,重复3次,然后离心收集菌体,将菌体置于60°C烘干至衡重，测的干重达到54g/L，菌体得率为5. 4%，发酵周期为140h，用超微粉碎法将干的菌体制成菌粉。实施例3 把冬虫夏草(Cordycepessinensis (Berk. ) Sacc)菌种 ACCC5O562 从保藏斜面上接入无菌斜面进行培养，培养条件为湿度控制在55%，18°C恒温培养25天，待斜面长满新鲜孢子即可。斜面培养基组成为葡萄糖35g/L、蛋白胨4g/L、MgSO4 7H205g/L、KH2PO4Ig/し大豆浸汁250mL/L、辅液I 4mL/L、琼脂25g/L、其余为水，pH6. 6，以上组分除辅液I外于121°C灭菌30min，其中辅液I 118°C单独灭菌22min后加入培养基，辅液体I组分为盐酸硫胺4g/L、核黄素4g/L、维生素B31g/L、盐酸吡哆素1. 2g/L、甘氨酸1. 4g/L、生物素1. 2g/し赤霉素0. 04g/L、NaSeO3O. 004g/L，其余为水。大豆浸汁制备方法称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水煮沸0. 5h，纱布过滤，最后定容到1000mL。将斜面孢子转接到固料培养基，固料培养基由固料以及营养液组成，其中固料营养液(w/v)=lg 0.7mL，其中固料由大米麸皮质量比为7:3，其中营养液组分为同斜面培养基(除去琼脂)，固料与营养液混匀后80°C蒸煮40min，冷却至室温后将成团大米的弄散，装入K瓶，121 °C灭菌30 40min，灭菌完后充分抖散，使固料培养基厚度保持约3cm左右，向长满孢子的斜面加入无菌生理水，用接种铲将孢子刮下，将孢子浓度控制在2. 5X IO6个/mL，按固料质量体积比的6%将孢子悬液均匀的喷在固料培养基的表面，然后充分抖动均匀后保持厚度约3cm，培养条件为湿度控制55%，温度控制18°C，每隔6h进行抖动，待长出菌丝体后静止培养至Sd后长满新鲜孢子后加入无菌水生理盐水制备成孢子悬液，孢子浓度控制在1. 6 X IO9个/L，其中每粒亲米孢子数量为0. 04X IO9个/粒，按照体积比为5%接入ー级种子罐培养。一级种子培养基组分大豆浸汁300mL/L、葡萄糖30g/L、蔗糖30g/L、酵母浸膏20g/L、蛋白胨 20g/L、KH2P044g/L、MnSO4O. 06g/L、NaC120g/L、氯化铵 0. 6g/L、氯化钙 0. 06g/し辅液II 4mL/L，其余为水，以上组分除辅液I1、葡萄糖外，于121°C灭菌30min，辅液I1、葡萄糖于118°C単独灭菌22min后添加到ー级种子罐中，辅液II的成分为盐酸硫胺0. 4g/L、核黄素2g/L、维生素B32g/L、盐酸卩比卩多素0. 6g/L、甘氨酸1. 6g/L、生物素0. 08g/L、赤霉素
0.06g/L,NaSeO3O. 006g/L，其余为水，培养条件为pH6. 6、温度20°C、罐压维持0. 05MPa、通气比V V=I 0. 8、转速为170r/min、连续培养70h，待菌丝长稠呈丝状，菌丝团大小均一，有中小空泡即可按30%接种量移入200L ニ级发酵罐。ニ级发酵培养基组分大豆浸汁300mL/L、葡萄糖30g/L、蔗糖30g/L、酵母浸膏2g/し蛋白胨 4g/L、KH2P044g/L、MnSO4O. 08g/L、NaC130g/L、氯化铵 8g/L、氯化钙 0. 3g/L、辅液III 40mL/L，其余为水，以上组分除辅液II1、葡萄糖外，于121°C灭菌30min，辅液II1、葡萄糖于118°C単独灭菌22min后添加到ニ级种子罐中，其辅液III的成分维生素BIO. 08g/L、维生素B20. 06g/L、维生素B60. 09g/L、烟酰胺lg/L、甘氨酸lg/L、生物素0. 008g/L、赤霉素0. 04g/し其余为水，用压差法移入将ー级种子发酵罐培养好的菌丝按接种量为30%移入200L发 酵罐进行培养，培养条件为PH6. 6、温度20°C、罐压0. 05MPa、通气比V V=I 0. 9、转速150r/min，在发酵24h、40h、56h时分别补加体积比为5%的全料和2%的葡萄糖，其中全料的组分为酵母浸膏 6g/L、蛋白胨 12g/L、KH2P0410g/L、MnSO4O. 4g/L、NaC15g/L、氯化铵 15g/L、氯化钙0. 4g/L，辅液III 40mL/L,于121°C灭菌40min，葡萄糖浓度为48g/L，于118°C灭菌22min。连续发酵至90h，待残糖< 1%，氨态氮< 0. 1%，镜检菌丝产量大量孢子时即可出罐收集发酵液进行过滤，用无菌水洗涤菌体、过滤，重复3次，然后离心收集菌体，将菌体置于60°C烘干至衡重，测的干重达到61. 3g/L，菌体得率为6. 1%，发酵周期为160h，用超微粉碎法将干的菌体制成菌粉。
权利要求
1.液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于包括如下步骤1)斜面菌种培养；2)大米孢子培养；3)发酵培养,包括一级种子罐培养和二级发酵培养；4)制备囷粉。
2.如权利要求1所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于在步骤I)中， 所述斜面菌种培养的具体方法如下配制斜面培养基，所述斜面培养基的组分为葡萄糖 15 35g/L、蛋白胨 O. 5 4g/L,MgSO4 ·7Η201 5g/L、KH2PO4O. 5 lg/L、大豆浸汁 150 250mL/L、辅液I I 4mL/L、琼脂20 25g/L、其余为水，ρΗ5· 9 6. 6，以上各组分除辅液 I夕卜，于121°C灭菌30min，辅液I于118°C单独灭菌22min后加入无菌培养基，接种环粘少量无菌水，把冬虫夏草菌种从保藏斜面上接入无菌斜面进行培养，待斜面长满新鲜成熟孢子即可；所述冬虫夏草菌种为冬虫夏草(Cordycepes sinensis (Berk. ) Sacc),购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC50562。
3.如权利要求2所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于所述辅液I组分为盐酸硫胺I 4g/L、核黄素I 4g/L、维生素B30. 5 lg/L、盐酸批卩多素O. 6 1. 2g/ L、甘氨酸 O. 8 1. 4g/L、生物素 O. 08 1. 2g/L、赤霉素 O. 02 O. 04g/L、NaSeO3O. 001 O.004g/L，其余为水。
4.如权利要求2所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于所述大豆浸汁的制备方法为称取150 200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水煮沸半个小时，纱布过滤，最后定容至Ij IOOOmL0
5.如权利要求2所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于所述培养的条件为湿度控制在45% 55%，在15 18°C下恒温培养15 25天。
6.如权利要求1所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于在步骤2)中， 所述大米孢子培养的具体方法如下配制固料培养基，由固料以及营养液组成，其中固料 营养液=Ig : (0.5 O. 7)mL，固料由大米和麸皮组成，其中大米麸皮按质量比为7 3， 营养液组分除去琼脂以外与斜面培养基的组分相同，固料与营养液混匀后75 80°C蒸或煮，冷却至室温后将成团的大米弄散，装入K瓶，121°C灭菌30 40min，灭菌完后充分抖散，使固料培养基厚度保持在I 4cm，向长满孢子的斜面加入无菌生理盐水，用接种铲将孢子刮下，将孢子浓度控制在1. O 2. 5X IO6个/mL，按固料质量体积比的3% 6%将孢子悬液均匀的喷在固料培养基的表面，抖动均匀后保持厚度在I 4cm，培养条件为湿度控制 45% 55%，温度控制15 18°C，每隔6h翻抖一次固料，待长出菌丝体后静止培养，长满孢子后加入无菌生理盐水震荡制成孢子悬液，其中每粒亲米孢子数量为O. 02 O. 04X IO9个 /粒，按照体积比为1% 5%接入一级种子罐培养。
7.如权利要求4所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于所述蒸或煮的时间为30 40min ;所述静止培养的时间为5 9d ;所述孢子的浓度可为O. 8 1. 6 X IO9 个/L。
8.如权利要求1所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于在步骤3)中， 所述一级种子罐培养的具体方法如下配制一级种子培养基，其组分为大豆浸汁200 300mL/L、葡萄糖10 30g/L、鹿糖10 30g/L、酵母浸膏5 20g/L、蛋白胨5 20g/L、KH2PO4L 5 4g/L、MnSO4O. 03 O. 06g/L、NaCl5 20g/L、氯化铵 O. 2 O. 6g/L、氯化钙O.01 O. 06g/L、辅液II I 4mL/L，其余为水，以上组分除辅液I1、葡萄糖外，于121°C灭菌30min，辅液I1、葡萄糖于118°C单独灭菌22min后添加到一级种子罐中，其中辅液II的组分为盐酸硫胺O.1 O. 4g/L、核黄素O. 5 2g/L、维生素B30. 5 2g/L、盐酸卩比卩多素O.3 O. 6g/L、甘氨酸 O. 8 1. 6g/L、生物素 O. 04 O. 08g/L、赤霉素 O. 02 O. 06g/L、 NaSeO3O. 002 O. 006g/L，其余为水；把步骤2)培养好的孢子接入一级种子罐，培养条件为 pH维持在5. 9 6. 6、温度18 20°C、罐压O. 03 O. 05MPa、通气比V V=I (O. 5 O.8)、转速为130 170r/min、连续培养50 70h，待菌丝长稠呈丝状，菌丝团大小均一，有中小空泡即可移入二级发酵罐。
9.如权利要求1所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于在步骤3) 中，所述二级发酵培养的具体方法如下配制二级发酵培养基，其组分为大豆浸汁200 300mL/L、葡萄糖10 30g/L、鹿糖10 30g/L、酵母浸膏O. 5 2g/L、蛋白胨I 4g/L、 KH2PO4O. 5 4g/L,MnSO4O. 03 O. 08g/L、NaC15 30g/L、氯化铵 2 8g/L、氯化钙 O. 05 O.3g/L、辅液11120 401^/1，其余为水，以上组分除辅液111、葡萄糖外，于1211灭菌301^11， 辅液II1、葡萄糖于118°C单独灭菌22min后添加到二级种子罐中，其中辅液III组分为维生素 B10. 02 O. 08g/L、维生素 B20. 01 O. 06g/L、维生素 B60. 03 O. 09g/L、烟酰胺 O. 5 lg/L、甘氨酸O. 4 lg/L、生物素O. 004 O. 008g/L、赤霉素O. 01 O. 04g/L，其余为水， 将一级种子发酵罐培养好的菌丝按体积百分比20% 30%的接种量移入二级发酵罐，培养条件为pH维持在5. 9 6. 6、温度18 20°C、罐压O. 03 O. 05MPa、通气比V V=I (O. 6 O. 9)、转速130 150r/min,在发酵24h、40h、56h时分别补加体积比为1% 5% 的全料和O. 5% 2%的葡萄糖,其中全料的组分为酵母浸膏2 6g/L、蛋白胨2 12g/ L、KH2P043 10g/L、MnSO4O. 2 O. 4g/L、NaCl 2 5g/L、氯化铵 6 15g/L、氯化钙 O. 2 O.4g/L，辅液III 20 40mL/L，于121°C灭菌40min，葡萄糖浓度为24 48g/L，于118°C灭菌 22min ；连续发酵至70 90h，待残糖< O. 5% 1%，氨态氮< O. 05% O. 1%，镜检菌丝产量大量孢子时即可出罐。
10.如权利要求1所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于在步骤4)中， 所述制备菌粉的具体方法如下收集发酵液进行过滤，用无菌水洗涤菌体、过滤，重复3次， 然后离心收集菌体，将菌体置于60°C烘干至衡重，用超微粉碎法将干的菌体制成菌粉。
全文摘要
液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，涉及一种菌粉。提供一种液体发酵产生冬虫夏草菌粉的方法。1)斜面菌种培养；2)大米孢子培养；3)发酵培养，包括一级种子罐培养和二级发酵培养；4)制备菌粉。能够减少种子扩级次数，发酵周期约为120～160h，能有效缩短发酵时间，提高发酵罐利用率，提高产能，节约生产成本，最终菌体产率达到4%～6%，菌体干重达到40～60g/L，能达到工业化生产的要求。
文档编号C05G3/00GK103005402SQ201210593118
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者朱自春, 陈金卿 申请人:厦门金达威集团股份有限公司, 内蒙古金达威药业有限公司