专利名称：冬虫夏草大规模发酵生产及菌粉加工工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以藏药(药食同源)提取液等为复合培养基的冬虫夏草大规模发酵生产及菌粉加工工艺，是冬虫夏草(Cordyceps Sinensis(Berk.)Sacc.)无性阶段的发酵工艺，特别是以中国被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu etZeng，异名为冬虫夏草真菌头孢子菌属菌种)为发酵菌种的大规模发酵生产及菌粉加工工艺。
背景技术：
冬虫夏草系我国中药三大宝之一，在防病治病、保健强身方面具有不可替代的作用。天然冬虫夏草是冬虫夏草真菌寄生在蝙蝠蛾幼虫体上而形成的虫菌复合体，仅分布于我国青藏高原海拔3500-5000米之间的高山草甸和灌木丛中。其药理药效的不可替代作用、生态环境恶劣的特点和采挖难度大的特殊性等使其珍贵而稀少。随着生活水平的不断提高，人们对冬虫夏草的需求量越来越大，而资源量却越来越少，供求矛盾越来越突出。为了解决这一问题，近几年，我国生物医学界的研究人员先后分离出多株虫草真菌菌株，试图利用人工发酵方式生产虫草菌丝体，用以代替天然冬虫夏草。经过不懈的努力，有几家已生产出在药理、毒理及功效成份等方面与天然虫草相似的产品。但还未达到与天然冬虫夏草等同的目标。我们经过几十年的探索，终于生产出在基因方面与天然冬虫夏草等同，在有效成分方面全面达到或超过天然冬虫夏草的冬虫夏草菌粉。并能实现现代化条件下的大规模生产。
本发明的目的是发明一种药效好、成本低、工艺简单、菌丝体生长速度快、收率高的大规模发酵生产及菌粉加工工艺。具体有以下特点(1)以藏药(药食同源)提取液等复合培养基为条件，可促进冬虫夏草真菌的生长，提高冬虫夏草菌粉的质量，缩短冬虫夏草真菌的发酵周期，比目前同类产品的发酵周期约少12天。
(2)收率高，比同类产品发酵工艺的收率高20％。
(3)成本低。比同类产品的成本低20％。
(4)自动化程度高。发酵过程的PH值、压力系数、搅拌速率、溶氧量、发酵液浓度等均能在自动控制下进行。
(5)污染几率降低，产量高。接种器先进，发酵设备无死角，污染率降到2％以下，产量比常规发酵技术有很大提高。
(6)本发明产品具有补肺肾、益精气、抗病毒、抗肿瘤，对肺肾两虚引起的咳嗽、气喘、咯血、腰背酸痛等疾病和肿瘤、病毒性疾病有治疗作用。
发明内容
本发明采用一种以藏药提取液等为复合培养基的冬虫夏草大规模发酵生产及菌粉加工工艺1、冬虫夏草菌种的分离将天然新鲜的冬虫夏草菌核洗净，用无菌水多次冲洗，消毒，在无菌条件下，切去外皮，避开肠道，切取白净组织为薄片，接于分离培养基表面，在5～15℃温度下，静止培养10天，白色菌丝即可从薄片上长出，将白色菌丝进一步分离纯化，可得到冬虫夏草菌种，此菌种经中国科学院微生物研究所(郭英兰教授)鉴定为中国被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng，异名为冬虫夏草真菌头孢子菌属菌种)，为真正的冬虫夏草真菌菌种。
2、斜面培养基马铃薯30克，蛋白胨10克，奶粉10粉，黄豆粉3克，维生素10克，硫酸镁0.5克，磷酸二氢钾1克，琼脂20克，水1000毫升，在15～18℃的温度下培养30～40天。
3、摇瓶培养基马铃薯3～5％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，黄豆粉0.5～2％，大黄提取液0.1～1％，红景天提取液0.2～2％，磷酸氢二钾、硫酸镁少许，其余为水。
将上述成份混合，定容到一定体积，用氢氧化钠或盐酸调PH到7.3。然后分装到容积为500毫升的三角瓶中，每瓶100毫升培养液，压力0.5～1公斤/平方厘米，灭菌30分钟。
在15～20℃往复式摇床上振荡培养3天，往复式摇床振荡频率110次/分，振幅5厘米。
4、发酵生产(1)种子罐培养马铃薯3～5％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，黄豆粉0.5～2％，大黄提取液0.1～1％，红景天提取液0.2～2％，磷酸氢二钾、硫酸镁少许，其余为水。PH为6.8～7.4。
培养基制作方法同摇瓶。种子罐装液量为总容积的70％，压力0.5～1公斤/平方厘米，灭菌30分钟。
在无菌条件下，将摇瓶种子液转接入种子罐中，接种量1/10～1/20，培养温度15±3℃，搅拌转速150～200转/分，通气量1∶0.2～1，培养时间5～6天。
(2)发酵罐培养基马铃薯3～5％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，黄豆粉0.5～2％，大黄提取液0.1～1％，红景天提取液0.2～2％，磷酸氢二钾、硫酸镁少许，其余为水。PH为6.8～7.4。
发酵生产条件将菌液接种到大规模(50T以上)工业生产发酵罐中，接种量5％～20％，接种温度为23±1℃。培养温度采取分阶段变温控制方式发酵第1～2天为15±1℃，发酵第3～5天为18±1℃，发酵第6～7天为21±1℃)。通气量1∶0.2～1(V∶V)，转速每分钟150～200转，搅拌均匀，罐压0.5～1公斤/平方厘米，连续发酵5～7天，开始发酵24小时后，每隔16小时取发酵液样，测定PH值、还原糖及氨态氮。当PH值降至5.5～5.0，还原糖1％以下，氨态氮0.1％以下，镜检菌丝体已产生大量分生孢子时，就可出罐。冬虫夏草大规模生产工艺流程图见附图15、菌粉加工工艺当四级深度发酵罐内的发酵液符合放罐质量标准时可出罐。本发明菌粉加工方法有如下几种(1)将发酵物(菌丝体、发酵液)减压浓缩，喷雾干燥得发酵粉。
(2)用板框过滤或离心方法，将发酵物中固、液分离，获得菌丝体及滤液。再将菌丝体切片，在60℃以下干燥、粉碎成粉(A)。同时，将滤液减压浓缩成浸膏，60℃以下干燥、粉碎成粉(B)。上述切片、干燥、粉碎、过筛、包装等加工过程均在洁净度为10万级的净化区进行，最后贴签得到冬虫夏草菌粉产品。该产品具有补肺肾、益精气、抗病毒、抗肿瘤，对肺肾两虚引起的咳嗽、气喘、咯血、腰背酸痛等疾病和肿瘤、病毒性疾病有治疗作用。
附图1 冬虫夏草大规模生产工艺流程图附图2 菌粉加工工艺流程图具体实施方式
一种以藏药提取液等为复合培养基的冬虫夏草菌大规模发酵生产及菌粉加工工艺，其特征在于取新鲜冬虫夏草虫体，切成薄片，接于分离培养基表面，在15℃温度下，静止培养10天，白色菌丝即可从薄片上长出，将白色菌丝进一步分离纯化，得到冬虫夏草中国被毛孢菌株，置于培养基上培养。
1、斜面培养基马铃薯30克，蛋白胨10克，奶粉10粉，黄豆粉3克，维生素10克，硫酸镁0.5克，磷酸二氢钾1克，琼脂20克，水1000毫升，在15-18℃的温度下培养30～40天。
2、摇瓶培养基马铃薯3～5％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，黄豆粉0.5～2％，大黄提取液0.1～1％，红景天提取液0.2～2％，磷酸氢二钾、硫酸镁少许，其余为水。
将上述成份混合，定容到一定体积，用氢氧化钠或盐酸调PH到7.3。然后分装到容积为500毫升的三角瓶中，每瓶100毫升培养液，压力0.5～1公斤/平方厘米，灭菌30分钟。
在15～20℃往复式摇床上振荡培养3天，往复式摇床振荡频率110次/分，振幅5厘米。
3、发酵生产(1)种子罐培养马铃薯3～5％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，黄豆粉0.5～2％，大黄提取液0.1～1％，红景天提取液0.2～2％，磷酸氢二钾、硫酸镁少许，其余为水。PH为6.8～7.4。
种子罐培养基及种子罐培养条件培养基成份同摇瓶培养基，制作方法也相同。种子罐装液量为总容积的70％，压力1公斤/平方厘米，灭菌30分钟。
在无菌条件下，将摇瓶种子液转接入种子罐中，接种量1/10，培养温度15±2℃，搅拌转速160转/分，通气量1∶0.2～1，培养时间6天。经镜检无杂菌污染，可转入发酵罐生产。
(2)发酵罐培养基马铃薯3～5％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，黄豆粉0.5～2％，大黄提取液0.1～1％，红景天提取液0.2～2％，磷酸氢二钾、硫酸镁少许，其余为水。PH为6.8～7.4。
将菌液接种到大规模(50T以上)工业生产发酵罐中，接种量5％～20％。培养温度为15～21℃(分阶段变温控制，发酵第1～2天为16±1℃，发酵第3～5天为18±1℃，发酵第6～7天为21±1℃)。通气量1∶0.2～1(V∶V)，转速每分钟150～200转，搅拌均匀，罐压0.5～1公斤/平方厘米，连续发酵5～7天，开始发酵24小时后，每隔16小时取发酵液样，测定PH值、还原糖及氨态氮。当PH值降至5.5～5.0，还原糖1％以下，氨态氮0.1％以下，镜检菌丝体已产生大量分生孢子时，就可出罐。
5、菌粉加工工艺当四级深度发酵罐内的发酵液符合放罐质量标准时可出罐。本发明菌粉加工方法有2种(1)将发酵物(菌丝体、发酵液)减压浓缩，喷雾干燥得发酵粉。
(2)用板框过滤或离心方法，将发酵物固、液分离，获得菌丝体及滤液。再将菌丝体切片，在60℃以下干燥、粉碎成粉(A)。同时，将滤液减压浓缩成浸膏，60℃以下干燥、粉碎成粉(B)。上述切片、干燥、粉碎、过筛、包装等加工过程均在洁净度为10万级的净化区进行，最后贴签得到冬虫夏草菌粉产品。
6、本发明产品通过各项检测，在虫草素、腺苷、虫草多糖、甾醇、生物碱、总氮、各种氨基酸、微量元素等几十种有效成份均超过了天然虫草。在药理作用上，具有补肺肾、益精气、抗病毒、抗肿瘤，对肺肾两虚引起的咳嗽、气喘、咯血、腰背酸痛等疾病和肿瘤、病毒性疾病有治疗作用，优于天然冬虫夏草。
(1)DNA分子检测采用本发明实施例所得的冬虫夏草菌粉，经国家唯一的菌类鉴定部门——中科院微生物研究所(2004)微检字第165号鉴定报告表明，青海月王青藏药业有限责任公司送检的冬虫夏草发酵液，经DNA提取、扩增、测序，与天然冬虫夏草DNA分子序列完全相同。充分证明我们的产品冬虫夏草发酵液为天然冬虫夏草菌种产品。
(2)本工艺所得冬虫夏草菌丝体与天然虫草中功效成份对比
(3)本工艺所得冬虫夏草菌丝体与天然虫草中微量元素对比
(4)本工艺冬虫夏草菌丝体与天然虫草在游离氨基酸和总氨基酸的比较
权利要求
1.一种以藏药提取液等为复合培养基的冬虫夏草大规模发酵生产工艺及其菌粉加工工艺，其特征在于从新鲜冬虫夏草中分离出中国被毛孢菌株，将其置于斜面培养基上培养。1.1斜面培养基马铃薯30克，蛋白胨10克，奶粉10粉，黄豆粉3克，维生素10克，硫酸镁0.5克，磷酸二氢钾1克，琼脂20克，水1000毫升，在15～18℃的温度下培养30～40天。1.2摇瓶培养基马铃薯3～5％，黄豆粉0.5～2％，大黄提取液0.1～1％，红景天提取液0.2～2％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，磷酸氢二钾、硫酸镁少许，其余为水。1.3种子罐培养基马铃薯3～5％，黄豆粉0.5～2％，大黄提取液0.1～1％，红景天提取液0.2～2％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，磷酸氢二钾、硫酸镁少许，其余为水。PH为6.8～7.4。在无菌条件下，将摇瓶种子液转接入种子罐中，接种量1/10～1/20，培养温度15±3℃，搅拌转速150～200转/分，通气量1∶0.2～1，培养时间5～7天。1.4发酵罐培养基马铃薯3～5％，黄豆粉0.5～2％，大黄提取液0.1～1％，红景天提取液0.2～2％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，磷酸氢二钾、硫酸镁少许，其余为水。PH为6.8～7.4。发酵生产条件将菌液接种到大规模(50T以上)工业生产发酵罐中，接种量5％～20％，接种温度为23±1℃。培养温度采取分阶段变温控制方式发酵第1～2天为15±1℃，发酵第3～5天为18±1℃，发酵第6～7天为21±1℃)。通气量1∶0.2-1(V∶V)，转速每分钟150～200转，搅拌均匀，罐压0.5～1公斤/平方厘米，连续发酵5～7天，开始发酵24小时后，每隔16小时取发酵液样，测定PH值、还原糖及氨态氮。当PH值降至5.5～5.0，还原糖1％以下，氨态氮0.1％以下，镜检菌丝体已产生大量分生孢子时，就可出罐。1.5当深度发酵罐内的发酵液符合放罐质量标准时可出罐。本发明将发酵液加工成菌粉的方法有2种1.5.1将发酵物(菌丝体、发酵液)减压浓缩，喷雾干燥得发酵粉。1.5.2用板框过滤或离心方法，将发酵物固、液分离，获得菌丝体及滤液。再将菌丝切片，在60℃以下粉碎成粉(A)。同时，将滤液减压浓缩成浸膏，60℃以下干燥、粉碎成粉(B)。上述切片、干燥、粉碎、过筛、包装等加工过程均在洁净度为10万级的净化区进行，最后贴签得到冬虫夏草菌粉产品。
2.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于摇瓶、种子罐、发酵罐培养基麸皮2～4％，马铃薯1～4％，蛋白胨0.5～2％，红景天提取液0.4～2％，葡萄糖0.5～5％，磷酸氢二钾、硫酸镁少许，其余为水。
3.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于摇瓶、种子罐、发酵罐培养基马铃薯2～4％，茱芽蓼水解液0.4～2％，蛋白胨0.5～2％，人参果提取液0.2～1％，葡萄糖0.5～5％，磷酸氢二钾、硫酸镁少许，其余为水。
全文摘要
本发明提供了一种冬虫夏草大规模发酵生产及菌粉加工工艺。其特征在于以中国被毛孢菌株为发酵菌种，经斜面和摇瓶培养，采用马铃薯3～5％，黄豆粉0.5～2％，卓老沙僧(人参果)0.01～0.02％，山药0.01～0.02％，蛋白胨0.5～2％，葡萄糖0.5～5％，磷酸氢二钾、硫酸镁少许，其余为水的培养基。相继进入各级发酵罐全自动控制的发酵和菌粉加工工艺。发酵物收率比同类方法提高20％，发酵周期缩短12天，成本降低20％。污染率低于2％。经中科院微生物所DNA分子测序，发酵物与天然虫草完全一致，虫草素、腺苷、虫草多糖、甾醇、生物碱、多种氨基酸和微量元素等有效成份均超过天然虫草。药理作用优于天然虫草。
文档编号C12N1/14GK1796539SQ200410101728
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月24日 优先权日2004年12月24日
发明者郝基荣, 李俊杰, 戴如琴, 汤风娣, 李广群, 马玉莲, 王玉花 申请人:青海月王青藏药业有限责任公司