本发明涉及l-苏氨酸发酵，具体涉及一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术：
l-苏氨酸是由w.c.rose1935年从纤维蛋白水解产物中分离和鉴定出来的一种氨基酸，现已证明是最后被发现的必需氨基酸，人体自身不能合成，必须从食物中摄取。l-苏氨酸作为食品添加剂广泛应用于饲料工业、保健食品和医药工业，由于l-苏氨酸的作用广泛，近些年全球苏氨酸的市场需求高速增长，未来苏氨酸的市场仍将快速增加，苏氨酸的需求量也将不断增大。
l-苏氨酸的制备方法主要有蛋白质水解法、化学合成法、微生物发酵法，微生物发酵法具有节约资源，成本低，环境污染小等优点，已经广泛应用于l-苏氨酸生产中。随着现代社会基因工程技术的如飞猛进，工业微生物和工业技术应用需求量增多，特别是工业微生物载体系统的构建，为优良的l-苏氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供可靠的技术保障，使微生物直接发酵法生产l-苏氨酸成为一种廉价的工业化生产方法。现阶段能够生产苏氨酸的微生物有埃希氏菌属、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等。大肠杆菌产苏氨酸现在普遍运用到微生物发酵实验中，其优点是菌种繁殖快，发酵周期短，成本低等特点，但相对于氨基酸行业的需求，虽然产量稳定增加，但是速度还是比较慢。
技术实现要素：
发明目的：为了解决现有大肠杆菌发酵生产l-苏氨酸时产量低、发酵周期长的问题，本发明提供了一种大肠杆菌基因工程菌，本发明进一步提供了所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，本发明更进一步地提供了所述大肠杆菌基因工程菌在发酵生产l-苏氨酸中的应用。
技术方案：本发明所述一种大肠杆菌基因工程菌，其导入了携带fimh基因的重组质粒。本发明从医学领域出发，大多数的细菌感染与生物膜的形成息息相关，医学中采用减少生物膜的形成降低细菌的感染；本发明首次提出通过增加大肠杆菌的生物膜量从而增加大肠杆菌的粘附性，可以粘附在非生物表面，改善了发酵生产l-苏氨酸的过程中l-苏氨酸的产量和发酵周期。
其中，所述原始大肠杆菌为cctccno:m2015233；所述重组质粒为携带fimh基因的pet-28a质粒。
本发明进一步地提供所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)提取原始大肠杆菌的基因组；
(2)以步骤(1)提取得到的基因组为模板，采用pcr技术扩增fimh基因；
(3)将步骤(2)得到的fimh基因插入pet-28a质粒的ncoⅰ/xbaⅰ酶切位点间，得到携带fimh基因的重组质粒；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化到e.colidh5α的感受态细胞中，从e.colidh5α中提取重组质粒；
(5)将步骤(4)提取得到的重组质粒转化到原始大肠杆菌的感受态细胞中，即得大肠杆菌基因工程菌。
其中，步骤(1)中所述原始大肠杆菌赠自中国科学院上海生命科学研究院，所述大肠杆菌已申请专利201510199036.1并进行了保藏，保藏编号为cctccno:m2015233，菌株号为cibts1688。
其中，步骤(2)中所述pcr使用的引物如下：
fimh-f：ggataacaattcccctctagaatgaaacgagttattaccctgtttgc
fimh-r：gatgatggctgctgcccatggttattgataaacaaaagtcacgcca。
本发明更进一步地提供所述大肠杆菌基因工程菌在发酵生产l-苏氨酸中的应用。
其中，发酵条件如下：发酵温度为25～37℃，发酵时间为30～32h。
有益效果：本发明通过构建过表达fimh基因的大肠杆菌基因工程菌，使大肠杆菌在发酵产l-苏氨酸过程中生物膜产量提高，黏附性增加，菌群数量增加，提高了l-苏氨酸的产量和糖转化率，缩短了发酵周期。
附图说明
图1为原始大肠杆菌基因组的电泳图；
图2为fimh基因的电泳图；
图3为重组质粒的电泳图；
图4为重组质粒的图谱；
图5为菌株cibts1688的生物膜电镜图；
图6为菌株cibts1688fimh*的生物膜电镜图；
图7为菌株cibts1688和菌株cibts1688fimh*的发酵结果。
具体实施方式
实施例1
一、提取原始大肠杆菌cibts1688基因组
使用takara公司提取细菌基因组的试剂盒(takaraminibestbacteriagenomicdnaextractionkitver.3.0)
(1)甘油菌活化：10μl原始菌株cibts1688+5mllb液体培养基，过夜培养；
其中，lb液体培养基配方如下：氯化钠10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，121℃，灭菌20min；
(2)用1.5ml离心管收集菌液(每1.5ml离心管装1.2ml菌液)，12000rpm离心2min，弃上清；
(3)向步骤(2)得到的菌体中加入180μl的buffergl、20μl的proteinasek(20mg/ml)和10μl的rnasea(10mg/ml)充分振荡混匀，于56℃水浴温浴10min，此时溶液呈透明、澄清状；
(4)向步骤(3)得到的体系中加入200μl的buffergb和200μl的无水乙醇，充分吸打混匀；
(5)将spincolumn安装在collectiontube上，步骤(4)得到的溶液移至spincolumn中，12000rpm离心2min，弃滤液；
(6)将500μl的bufferwa加入至spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液；
(7)将700μl的bufferwb加入至spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液；
(8)沿spincolumn管壁四周加入bufferwb，有助于完全冲洗沾附管壁上的盐份；
(9)重复操作步骤(8)；
(10)将spincolumn安置于collectiontube上，12000rpm离心2min；
(11)将spincolumn安置于新的1.5ml离心管上，在spincolumn膜的中央处加入50～200μl的灭菌水或elutionbuffer，室温静置5min；其中，将灭菌水加热至65℃使用有利于提高洗脱效率；
(12)然后12000rpm离心2min洗脱dna。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到spincolumn膜的中央或再加入50～200μl的灭菌水，室温静置5min后，12000rpm离心2min洗脱dna，原始大肠杆菌dna的电泳图见图1。
二、运用pcr技术扩增目的基因fimh
(1)以步骤一得到的dna为模板，运用pcr技术扩增目的基因fimh，反应体系见表1；
fimh-f：ggataacaattcccctctagaatgaaacgagttattaccctgtttgc
fimh-r：gatgatggctgctgcccatggttattgataaacaaaagtcacgcca
表1pcr反应体系
使用0.8％(0.8g/100ml)琼脂糖凝胶对上述pcr产物(fimh基因片段)进行电泳，结果见图2。
(2)胶回收纯化片段fimh
使用takara试剂盒(takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0)
2.1使用tbe缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的片段fimh进行琼脂糖凝胶电泳；
2.2在紫外灯下切出含有目的片段fimh的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽表面液体；
2.3切碎胶块，称量胶块重。计算体积时，以1mg＝1μl进行计算；
2.4向胶块中加入溶解液buffergm，buffergm加量没过胶块即可，均匀混合后室温15～25℃溶解胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解；
2.5将试剂盒中的spincolum安置于collectiontube上；
2.6将步骤2.4得到的溶液转移至spincolumn中，1200000rpm离心1min，弃滤液；
2.7将700μl的bufferwb加入spincolumn中，室温12000rpm离心1min，弃滤液；
2.8重复操作步骤2.7；
2.9将spincolumn安置于collectiontube上，室温12000rpm离心1min，弃滤液；
2.10将spincolumn安置于新的1.5ml的离心管上，在spincolumn膜的中央处加入30μl灭菌水，室温静置1min；
2.11室温12000rpm离心1min洗脱fimh片段；
2.12对纯化后的fimh目的片段进行琼脂糖凝胶电泳验证，计算浓度；其中fimh基因的核苷酸序列见seqidno：1。
三、提取质粒pet-28a
利用takara试剂盒(takaraminibestplasmidpurificationkitver.4.0)
(1)从平板培养基上挑选e.colidh5α单菌落(内含pet-28a，来自柯雷生物科技有限公司，其核苷酸序列见seqidno：2)，其中e.colidh5α购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司，no.b528413，pet-28a的保存方法参考按照《分子克隆实验指南》(黄培堂等译，中国，科学出版社，2002，第三版)中方法进行；然后接种至5ml的含有抗生素的lb液体培养基中(抗性为卡那霉素50μg/ml)，37℃过夜培养12～16h；
(2)取1～4ml的过夜培养菌液，12000rpm离心2min，弃上清；
(3)用250μl的solutionⅰ(含rnasea)充分悬浮细菌沉淀；
(4)加入250μl的solutionⅱ轻轻上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液；
(5)加入350μl的4℃预冷的solutionⅲ，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2min；
(6)室温12000rpm离心10min，取上清液；
(7)将试剂盒中的spincolumn安置于collectiontube上；
(8)将步骤(6)得到的上清液转移至spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液；
(9)将500μl的bufferwa加入spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液；
(10)将700μl的bufferwb加入spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液；
(11)重复操作步骤(10)；
(12)重新将spincolumn安置于collectiontube上，12000rpm离心1min，除尽残留洗液；
(13)将spincolumn安置于新的1.5ml的离心管上，在spincolumn膜的中央处加入30～50μl的65℃灭菌水，室温静置1min；
(14)12000rpm离心1min洗脱dna；
(15)对提取后的质粒pet-28a进行琼脂糖凝胶电泳验证，计算浓度。
四、利用限制性内切酶ncoⅰ和xbaⅰ双酶切质粒pet28a
表2酶解体系
五、连接目的基因fimh和双酶切后质粒pet28a得到重组质粒pet28a+fimh
使用诺唯赞一步克隆试剂盒
表3酶连体系
六、将重组质粒pet28a+fimh转化到e.colidh5α
(1)从-80℃冰箱中取出一管200μle.colidh5α感受态细胞(上海生工生物工程(上海)股份有限公司no.b528413))悬液，室温下解冻，解冻后立即置于冰上；
(2)加入步骤五得到的重组质粒pet-28a+fimh溶液于e.colidh5α感受态细胞悬液中，轻轻摇匀，冰上放置30min；
(3)42℃水浴热激90s，立即置于冰上冷却5min；
(4)加入1ml的lb液体培养基混匀后，37℃振荡培养40min，使菌体恢复正常生长状态；
(5)将上述菌液摇匀后取100μl涂布于lb抗性板，倒置培养皿，37℃恒温培养箱培养12h；
其中lb抗性板的配方如下：氯化钠10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、琼脂粉20g/l，121℃灭菌20min，冷却后加卡那霉素至终浓度为50μg/ml。
(6)从抗性板上挑取单菌落，保菌后，按步骤三提取质粒pet-28a+fimh，对提取后的质粒pet-28a+fimh进行琼脂糖凝胶电泳验证和测序验证，结果正确，见图3，质粒pet-28a+fimh的图谱见图4，其核苷酸序列见seqidno：3。
七、将重组质粒pet-28a+fimh转化到原始大肠杆菌
将验证正确的重组质粒pet-28a+fimh按照步骤六转化到原始菌株cibts1688的感受态细胞中，挑取单菌落按步骤三提取质粒进行测序验证，得到构建好的重组大肠杆菌cibts1688fimh*。
其中，cibts1688的感受态细胞按如下步骤制备：
(1)将500μl步骤一甘油活化得到的新鲜的过夜cibts1688细胞菌液转到50mllb液体培养基中，于37℃振荡摇匀3h(摇床200r/min)，测量od600＝0.8-1.0左右；
(2)在无菌条件下，将1.5ml细菌培养液转移到冰预冷的离心管中，在冰上放置10min；
(3)然后于4℃4000r/min离心10min；
(4)弃去上清液，将离心管倒置1min，使残留培养液流尽；
(5)各加150μl冰预冷的0.1mcacl2水溶液重悬细胞，合并两管，冰浴10min；
(6)然后于4℃4000r/min离心10min；
(7)弃去上清液，将离心管倒置1min，使残留的痕量培养液流尽；
(8)先加入800μl冰预冷的0.1mcacl2水溶液重悬细胞，再加入25μl预冷的30％v/v的甘油，之后分装于-80℃贮存备用。
实施例2
(1)各取100μl甘油菌cibts1688和cibts1688fimh*加入灭菌的5mllb液体培养基中过夜培养，活化；
(2)然后按1:100稀释，37℃慢摇5h，使其达到对数期od6000.8-1.0；
(3)取2ml菌液在od600下测量吸光值，用灭菌的蒸馏水稀释菌液，使得稀释后菌液od600为0.01；
(4)取200μl菌液加入96孔板，lb液体培养基做对照，37℃培养24h；
(5)将96孔板菌液倒出，用纯水缓冲3次，拍干；
(6)取1％结晶紫溶液200μl加入96孔板，染色10min，自来水冲洗，晾干；
(7)取33％冰醋酸200μl加入96孔板溶解后，轻轻振荡，od600测量生物膜产率，取平均值：cibts1688在96孔板培养24hod值为1.9-2.1，cibts1688fimh*在96孔板培养24hod值为2.6-2.7，生物膜电镜图分别见图5和图6。
实施例3
(1)取10μlcibts1688和改造后cibts1688fimh*甘油菌接种于5mllb液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜；
(2)按体积比1:10将步骤(1)得到的菌液接种于50ml的lb液体培养基中，37℃，200rpm培养2h，菌液浓度达到od600＝1.0左右；
(3)按体积比5％的比例将菌液接种于发酵培养基中，37℃，200～250rpm，发酵，葡萄糖耗尽后反应结束，利用高效液相色谱仪测定发酵液中l-苏氨酸的含量，结果见表5，图7。
其中，发酵培养基配方如下：一水合葡萄糖33g/l，氯化钠0.8g/l，硫酸铵22g/l，三水合磷酸氢二钾2.65g/l，七水硫酸镁0.8g/l，无水硫酸铜0.02g/l，七水硫酸铁0.02g/l，盐酸硫胺0.002g/l，酵母粉1.0g/l，碳酸钙30g/l，ph7.2。
其中，hplc检测方法如下：
色谱条件：sepaxaa专用柱，4.6*150mm、检测波长254nm、柱温：36℃，进样量5μl。
衍生剂配置：三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4ml，加乙腈2ml混匀；
异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯25μl加乙腈2ml混匀。
流动相a：称取15.2g的醋酸钠，加水1850ml，溶解后用冰醋酸调ph值至6.5。
流动相b：80％乙腈(v/v)；
流速：0.8ml/min，数据采集时间50min。
表4为hplc梯度洗脱程序
表5为基因工程菌的l-苏氨酸产量
注：菌群数量是在发酵稳定后测定，cibts1688发酵36h苏氨酸的产量达到稳定且达到最高值，糖耗结束，cibts1688fimh*发酵32h苏氨酸产量达到稳定且达到最高值，糖耗结束。
实施例4
方法同实施例3，不同的是葡萄糖浓度为100g/l，结果见表6。
表6为葡萄糖浓度为100g/l时基因工程菌的l-苏氨酸产量
序列表
<110>南京工业大学
<120>一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>903
<212>dna
<213>fimh
<400>1
atgaaacgagttattaccctgtttgctgtactgctgatgggctggtcggtaaatgcctgg60
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<210>2
<211>5369
<212>dna
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<400>2
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ggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccg4260
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attagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcg4380
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