实现两个基因等量表达的基于2A裂解肽的多基因元件及表达载体和应用的制作方法

文档序号：15362978发布日期：2018-09-05 01:04阅读：1559来源：国知局

本发明属于生物技术领域，涉及实现两个基因等量表达的基于2a裂解肽的多基因元件，还涉及包含该元件的表达载体和应用。

背景技术：

在家蚕体内高效地重组表达多个基因可以推动家蚕的基础与应用研究，例如研究多个基因之间的相互关系、重组表达多亚基蛋白复合物的基因、与荧光蛋白同时表达可视化地研究靶标基因在体内的移动以及培育能够抗家蚕质型多角体病毒与核型多角体病毒的家蚕品种等。得益于2000年家蚕转基因操作体系的建立，此前，在家蚕体内同时表达多个基因主要是通过遗传杂交来实现的。首先，必须先建立多个单一表达靶标基因的转基因家蚕品系，再杂交，最后在杂交后代中筛选同时表达多个外源基因的家蚕个体。例如2006年，takahiroadachi等人成功将家蚕脯酰羟基酶β-亚基与人胶原蛋白同时表达在家蚕后部丝腺；2009年，masashiiizuka等人同时表达了鼠单克隆抗体的轻链基因与重链基因，将完整的鼠单克隆抗体表达在了家蚕茧壳；2015年，minorutada等人还利用gal4/uas系统，采用两轮杂交的方式在家蚕中部丝腺中重组表达了anti-cd20单克隆抗体。该方法不仅耗时长，而且杂交过程比较繁琐。

2a裂解肽是一个在1991年于口蹄疫病毒中发现的、存在于两个蛋白(2a、2b)之间的寡肽，通常还有19-22个氨基酸。当核糖体到达2a的c端最后两个氨基酸甘氨酸与脯氨酸时，由于核糖体酰胺中心内部结构的改变导致无法翻译下游基因，此时，上游初生肽被水解释放出核糖体，然后核糖体再翻译下游基因，理论上可以实现两个基因的等量表达。目前，2a已经在多个细胞系、物种(小鼠，斑马鱼，猪，果蝇和羊种)中成功共表达了多个基因组合，应用于治疗癌症和其他疾病，或遗传改良具有特定功能或抗性植物和动物新品种。因此，前期研究中，我们也利用来至于猪肠病毒的p2a构建了家蚕丝腺2a多基因表达系统，但是，该系统并不能等量地重组表达位于2a上下游的dsred基因与egfp基因。

kozak序列(kozakconsensussequence)是位于真核生物mrna5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是gccaccaugg，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mrna翻译起始。1981年，女科学家kozak在研究真核生物中起始密码子aug周边碱基定点突变后对靶标基因的转录和翻译所造成的影响时，首先总结出在真核生物中，起始密码子两端序列为：-g/n-c/n-c/n-annaugg-，如gccaccaugg、gccaugaugg时，转录和翻译效率最高，特别是-3位的a、+4位的g对翻译效率非常重要。目前，诸多研究者也相继报道kozak序列可以影响基因的表达水平。例如，2014年，通过将wnt16基因上游的调节序列(gcaccc)优化成为kozak序列(gccacc)后，其表达量被提高了3.7倍，另外，gata4基因上游kozak序列-6位的g突变成c后，gata4基因的表达量就被严重下调。

但是将kozak序列用于优化家蚕丝腺中2a多基因表达系统，使其能够等量地重组表达位于2a两端的基因未见报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供实现两个基因等量表达的基于2a裂解肽的基因元件；本发明的目的之二在于提供含有所述基因元件的多基因表达载体；本发明的目的之三在于提供基因元件的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1.实现两个基因等量表达的基于2a裂解肽的基因元件，所述基因元件由ck与2a裂解肽组成；所述ck的核苷酸序列seqidno.39所示。

优选的，所述基因元件由经过gsg接头优化的猪肠病毒的p2a序列和sk连接而成，所述经过gsg接头优化的猪肠病毒的p2a序列如seqidno.38所示；所述sk核苷酸序列seqidno.40所示。

2.含有所述基因元件的多基因表达载体。

优选的，所述表达载体如seqidno.36所示。

3.所述基因元件在实现多基因等量表达中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了实现两个基因等量表达的基于2a裂解肽的基因元件，通过利用kozak序列优化家蚕丝腺中2a多基因表达系统，使其能够等量地重组表达位于2a两端的基因，为在家蚕丝腺与蚕丝中重组表达多个基因提供技术支持。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为在sf9细胞中ck通过提高下游基因的翻译效率增强其表达水平(a：瞬时表达载体结构图，k为根据kozak规则设计的序列；b：瞬时表达载体转染sf9细胞后的荧光结果；标尺为400um；c：rt-pcr分析sf9细胞中dsred基因转录情况；d：转染后sf9细胞中rfp的表达情况；d：转染后sf9细胞中rfp的相对含量)。

图2为在bme细胞中ck增强bmcpv2a(30)下游egfp基因的表达水平(a：瞬时表达载体结构图；sk为家蚕内源基因丝胶1基因n端的kozak序列；b：rt-pcr检测瞬时表达载体转染bme细胞后融合基因的转录水平；c：瞬时表达载体转染sf9细胞后的荧光结果，标尺为400um；d：转染后bme细胞中rfp与egfp表达情况；e与f分别为转染后bme细胞中rfp、egfp相对表达量分析。

图3为ck在转基因家蚕pr-ckg中部丝腺中介导dsred与egfp基因高效表达(a：转基因表达载体，红色箭头为rt-pcr引物；b：转基因家蚕pr-ckg中部丝腺中的荧光结果，标尺为2mm；c和d分别为rt-pcr检测融合基因dsred-p2a-ckegfp在正常家蚕与pr-ckg转基因家蚕中部丝腺中的转录情况；e：转基因家蚕pr-ckg中部丝腺中重组蛋白的检测。pr-ckg-1泳道中的总蛋白质浓度是pr-ckg-2中的1/2，是pr-ckg-3中的1/4，红色的五角星和绿色的五角星分别表示被成功断裂的rfp和egfp蛋白；f转基因家蚕pr-ckg中部丝腺中重组蛋白rfp与egfp的含量分析)。

图4为转基因家蚕pckg-ckr中高效表达dsred基因与egfp基因(a：转基因表达载体；b：阳性转基因家蚕蛾子的筛选；c与d：分别为rt-pcr检测融合基因ckg-ckr在正常家蚕与pckg-ckr转基因家蚕中部丝腺中的转录情况；e：转基因家蚕pg-r、pckg-ckr中部丝腺与茧壳中的荧光结果，标尺为2mm；f：转基因家蚕pg-r、pckg-ckr茧壳中重组蛋白rfp与egfp的检测：g：转基因家蚕pckg-ckr茧壳中重组蛋白rfp与egfp的含量分析。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明实施使用的材料如下：

细胞系：斜纹夜蛾sf9卵巢细胞系、家蚕胚胎bme细胞。sf9细胞和bme细胞均使用含有10％胎牛血清(gibco)的培养基(gibco)培养；

靶标基因：红色荧光蛋白基因(dsred)、绿色荧光蛋白基因(egfp)，以及融合基因dsred-p2a-ckegfp、ckegfp-p2a-ckdsred与egfp-p2a-dsred，均由金斯瑞公司合成；

家蚕品系：非滞育品种d9l。

一、瞬时表达载体与转基因表达载体的构建

根据kozak序列的设计规则：在aug中的碱基a、u、g分别标为1、2、3位，(1)第4位的偏好碱基为g；(2)aug的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基t；(3)在-3、-6和-9位置，g是偏好碱基；(4)除-3、-6和-9位，在整个侧翼序列区，c是偏好碱基。因此设计了一个经典的kozak序列-accaccatgg-(ck)(seqidno.39)。然后，在dsred基因的n端加入了ck，构建了由a4启动子、hr3增强子和根据经典的kozak序列规则设计的kozak序列，序列为-accaccatgg-。sk是家蚕内源丝胶1基因n端的kozak序列，序列为-accgccaacatgg-(seqidno.40)。p2a已经经过gsg接头优化(seqidno.38)。

然后利用表1所示引物进行重叠pcr的方法组装融合基因dsred-bmcpv2a(30)-egfp、dsred-bmcpv2a(30)-ckegfp、dsred-bmcpv2a(30)-skegfp、dsred-p2a-ckegfp、egfp-p2a-dsred与ckegfp-p2a-ckdsred。其中用seqidno.1、seqidno.2、seqidno.7和seqidno.8组装融合基因dsred-bmcpv2a(30)-egfp；seqidno.1、seqidno.2、seqidno.9和seqidno.10组装融合基因dsred-bmcpv2a(30)-ckegfp、seqidno.1、seqidno.2、seqidno.11和seqidno.12组装融合基因dsred-bmcpv2a(30)-skegfp；seqidno.3、seqidno.4、seqidno.13和seqidno.14组装融合基因egfp-p2a-dsred；seqidno.3、seqidno.4、seqidno.15和seqidno.16组装融合基因dsred-p2a-ckegfp；seqidno.4、seqidno.5、seqidno.17和seqidno.18组装融合基因ckegfp-p2a-ckdsred。

经过bamhi与noti双酶切后回收目的片段，亚克隆后得到的1180psl瞬时表达载体包括(亚克隆前的载体为1180psl[hr3ser1dsredser1pa]或1180psl[hr3ser1egfpser1pa])：1180psl[hr3ser1dsredser1pa]、1180psl[hr3ser1egfpser1pa]、1180psl[hr3ser1dsred-bmcpv2a(30)-egfpser1pa]、1180psl[hr3ser1dsred-bmcpv2a(30)-ckegfpser1pa]、1180psl[hr3ser1dsred-bmcpv2a(30)-skegfpser1pa]、1180psl[hr3ser1dsred-p2a-egfpser1pa]、1180psl[hr3ser1egfp-p2a-dsredser1pa]与1180psl[hr3ser1dsred-p2a-ckegfpser1pa]。bmcpv2a(30)是来自家蚕质型多角体病毒的2a序列，含有30个氨基酸(seqidno.37)。

融合基因dsred-p2a-ckegfp、ckegfp-p2a-ckdsred与egfp-p2a-dsred经过两次亚克隆，最终，得到的转基因表达载体包括：piggybac[3xp3dsredsv30；hr3ser1dsred-p2a-ckegfpser1pa]、piggybac[3xp3dsredsv30；hr3ser1egfp-p2a-dsredser1pa]与piggybac[3xp3dsredsv30；hr3ser1ckegfp-p2a-ckdsredser1pa]。

表1.构建载体所使用的引物

二、细胞转染

将构建好的质粒重新转化后挑单一菌斑摇菌12h，取10ml菌液利用qiagen超纯试剂盒抽提质粒，利用dna浓度仪测定质粒纯度，260/280比值在1.8～1.9，备用。利用含有10％胎牛血清的grace培养基或tc培养基将sf9、bme细胞均匀铺于24孔板，细胞密度约80％，过夜培养。利用无抗、无血清的grace培养基或tc培养基清洗细胞3次，再加入200μl的无抗、无血清grace培养基或tc培养基，待用。质粒转染溶液的配置：将1.5μg转染质粒与900μl无抗、无血清grace培养基或tc培养基充分混匀后，加入2.5μl转染试剂x-treme，混合摇匀，静置30min后，取300μl加入到上述待用的细胞孔中，总体积为500μl。培养6～8小时后，用无抗、无血清的培养基或tc培养基清洗细胞3次，再加入500μlgrace完全培养基或tc完全培养基，连续培养3天。

三、转基因家蚕的培育

多化性家蚕品种d9l经优质桑叶饲养至上蔟，经蛹期化蛾后，采用自交的方式交配6～8小时，母蛾放置于4℃，备用；注射质粒的制备：以1:1的质量比例配置待注射质粒与含有piggybac转座酶的help质粒混合液，备用；取出母蛾，在szx16显微镜(olympus)下，使用transfermannk2显微操纵器和femtojet5247微量注射器(eppendorf)向产后2h内的蚕卵注射质粒混合液。注射后的蚕卵置于25℃、相对湿度90％的条件下催青11天后得到g0代蚁蚕，以新鲜的桑叶精心饲养至上蔟，待化蛾后自交制种得到g1到家蚕。待g1代家蚕胚胎发育6天后，使用szx12荧光立体显微镜(olympus)筛选家蚕胚胎的眼睛与神经组织，呈现绿色荧光的即为阳性的转基因家蚕品系。

四、靶标蛋白的检测

细胞蛋白样品的提取：弃去培养基，利用1mlpbs(135mmnac、2.7mmkcl、1.5mmkh2po4和8mmk2hpo4，ph7.4)清洗细胞3次，加入150μl新配的含有蛋白酶抑制剂pspf的ripa裂解液，置于冰上30min，收集细胞后13400rpm离心5min，取上清液为细胞蛋白样品；

家蚕中部丝腺蛋白样品的提取：解剖家蚕中部丝腺，剪碎，浸入pbs中4℃过夜提取。提取物经13400rpm离心5min，取上清液为家蚕中部丝腺蛋白样品；

茧壳蛋白样品的提取：利用粉碎机将茧壳粉碎。取20mg茧粉，利用1ml的蛋白提取液(8m尿素、25mmtris-hcl，ph7.0)在80度条件下震荡提取30min。提取液经13400rpm离心5min，取上清为茧壳蛋白样品；

sds-page与westernblotting：上述细胞蛋白样品、家蚕中部丝腺蛋白样品与茧壳蛋白样品采用增强型bca蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度(beyotime)后，取等质量的蛋白样品进行sds-page电泳，采用考马斯亮蓝染色与westernblotting检测靶标蛋白。电泳完成后，通过转膜仪将蛋白样品转到pvdf膜，经过5％脱脂奶粉封闭、敷一抗(抗rfp抗体、抗egfp抗体、抗hsa抗体、抗fgf1抗体、抗vgr抗体或抗tubulin抗体)、5次pbst洗膜、敷二抗(抗鼠或兔igg抗体)、5次pbst洗膜后，利用eclwesternblotting检测试剂(amershambiosciences)显现膜上的条带，曝光方式采用自动曝光。并利用imagej软件分析westernblotting条带强度，转化为数值。

五、荧光信号的观察

利用olympusszx12荧光立体显微镜(olympus)直接观察、拍照24孔板中的sf9、bme和bmn细胞的红色荧光信号、绿色荧光信号。红色荧光信号的曝光时间为15ms，绿色荧光信号的曝光时间为100ms；利用olympusszx12荧光立体显微镜直接观察、拍照家蚕第七天的中部丝腺与茧壳中的红色荧光信号、绿色红色荧光信号、绿色荧光信号。红色荧光信号的曝光时间为30ms，绿色荧光信号的曝光时间为80ms。

六、定量pcr

细胞样品rt-pcr方法：瞬时表达载体转染细胞3天后收集细胞，利用总rna抽提试剂盒(omega)提取细胞总rna。利用反转录试剂盒(omega)将一定量的rna反转录成为cdna模板。利用sybrpremixextaq试剂盒(takara)在abifast7000定量pcr仪(appliedbiosystems)检测各个样品中的dsred基因、egfp基因的表达水平。以sw22934作为内参基因。

转基因家蚕中部丝腺rt-pcr方法：解剖家蚕五龄中部丝腺，利用总rna抽提试剂盒提取总rna。利用反转录试剂盒将2ugrna反转录成为cdna。利用sybrpremixextaq试剂盒(takara)在abifast7000定量pcr仪(appliedbiosystems)对样品cdna中的内源丝胶1基因(ser1)、dsred与egfp基因的mrna进行检测(表2)。

表2、rt-pcr实验中使用到的引物

上述引物^1-7分别是检测基因dsred,egfp,dsred-2a-ckegfp,egfp-2a-dsred、ckegfp-2a-ckdsred、ser1与sw22934的定量pcr引物。

七、实验结果

1.ck通过提高下游基因的翻译效率增强其表达效率

通过在dsred基因的n端加入了ck，构建了由a4启动子、hr3增强子和ser1pa终止子序列调控的瞬时表达载体ck-dsred(seqidno.32)与正常表达dsred基因的对照表达载体dsred(图1，a)。转染sf9细胞后，发现，相较于dsred组sf9细胞，在dsred基因的n端添加了ck的ck-dsred组中sf9细胞的红色荧光信号得到了明显地提高(图1，b)。定量pcr结果显示，dsred与ck-dsred组细胞中dsred基因在mrna水平上的表达无明显差异(图1，c)；westernblotting结果显示，ck-dsred组sf9细胞中的rfp蛋白含量显著地高于dsred组sf9细胞中的rfp，rfp的含量被提高了1.8倍(图1，d-e)，表明ck能够通过提高其下游基因的翻译效率，增强基因的表达水平。

2.ck增强bmcpv2a(30)下游egfp基因的表达水平

为了验证ck能否有效地提高2a下游基因的表达效率，选择了bmcpv2a(30)作为靶标2a序列，因为前期的研究已经证明，bmcpv2a(30)不能有效地表达其下游的egfp基因。为了比较ck与sk增强bmcpv2a(30)下游egfp基因表达的效率，分别将ck与sk融合到了bmcpv2a(30)连接的融合基因dsred-ckegfp、dsred-skegfp上，构建了相应的瞬时表达载体bmcpv2a(30)+ck(seqidno.34)、bmcpv2a(30)+sk(seqidno.35)(图2，a)，转染了bme细胞。rt-pcr结果显示，转染瞬时表达载体bmcpv2a(30)(seqidno.33)、bmcpv2a(30)+ck与bmcpv2a(30)+sk后，3个dsred-2a-egfp融合基因的转录水平无显著性差异(图2，b)。转染后sf9细胞的荧光结果显示，bmcpv2a(30)、bmcpv2a(30)+ck与bmcpv2a(30)+sk组中sf9细胞的红色荧光信号无差异，但bmcpv2a(30)+ck与bmcpv2a(30)+sk组sf9细胞的绿色荧光信号明显强于bmcpv2a(30)组细胞，bmcpv2a(30)+ck组sf9细胞的绿色荧光信号最强(图2，c)。westernblotting结果也显示，bmcpv2a(30)、bmcpv2a(30)+ck与bmcpv2a(30)+sk组sf9细胞中rfp的表达水平无明显差异，bmcpv2a(30)+ck与bmcpv2a(30)+sk组sf9细胞中egfp的表达量显著高于bmcpv2a(30)组(图2，d-f)。以上结果说明，在sf9细胞水平，kozak序列的优化能够通过增强bmcpv2a(30)下游egfp基因的翻译效率从而提高其表达水平，并且ck比sk的效率更高。

3.ck优化后的家蚕丝腺2a多基因表达系统在家蚕中部丝腺中等量地重组表达dsred基因与egfp基因

为了验证ck在家蚕个体水平能够增强2a下游基因的表达效率，组装了融合基因dsred-p2a-ckegfp(r-ckg)，构建了其家蚕转基因表达载体(seqidno.36)，得到了转基因家蚕品系(图3，a)。总的来说，从注射的400粒蚕卵中得到了35头g0代蚁蚕，经过精心饲养、自交制种后得到5个g1代蛾圈，其中有2个阳性蛾圈(表3)。将在该转基因茧壳中外源蛋白rfp与egfp表达量最高的转基因品系命名为pr-ckg。rt-pcr结果显示，在转基因家蚕pr-ckg中部丝腺中成功地检测到了融合基因r-ckg的转录，其转录水平相对于家蚕内源ser1基因的72.7％(图3，c-d)；荧光信号的结果显示，相对于正常的家蚕，转基因家蚕pr-ckg的中部丝腺呈现出强烈、特异性的红色荧光与绿色荧光信号(图3，b)；sds-page结果显示，在转基因家蚕pr-ckg中部丝腺中检测到了重组表达的、且被断裂的rfp与egfp蛋白(图3，e)。说明p2a有效地介导了融合基因r-ckg中dsred基因与egfp基因的重组表达与断裂。对转基因家蚕pr-ckg的中部丝腺中重组表达的rfp与egfp的含量分析后，发现，rfp与egfp的含量分别为0.18±0.03％、0.23±0.04％，无显著性差异(图3，f)，相较于在转基因家蚕pr-g中rfp的含量远远高于egfp的含量，说明在家蚕个体水平，ck也能够有效地增强p2a下游egfp基因的表达效率。

表3转基因家蚕pr-ckg、pg-r与pckg-ckr转基因注射统计

4.ck优化提高家蚕丝腺2a多基因表达系统在家蚕中部丝腺与蚕丝中重组表达外源靶标基因的效率

为了验证在家蚕丝腺2a多基因表达系统中加入ck能否提高基因的表达水平，分别构建了转融合基因egfp-2a-dsred(g-r)、ckegfp-p2a-ckdsred(ckg-ckr)的转基因家蚕品系(图4，a-b，表3)。经过初步筛选，分别将在转基因茧壳中重组蛋白rfp与egfp表达量最高的因品系命名为pg-r、pckg-ckr。

rt-pcr结果显示，在转基因家蚕pckg-ckr中部丝腺中成功地检测到了融合基因ckg-ckr的表达，其表达水平约为家蚕内源ser1基因表达量的55.3％(图4，c-d)。荧光结果显示，在转基因家蚕pg-r、pckg-ckr中部丝腺与茧壳中均出现强烈、特异性的红色与绿色荧光信号(图4，e)；sds-page结果显示，在转基因家蚕pg-r、pckg-ckr茧壳中成功地检测到了断裂的rfp与egfp蛋白(图4，f)。说明，融合基因g-r、ckg-ckr中的dsred基因与egfp基因均被成功地表达，分泌到了茧壳。此外，与转基因家蚕pg-r中部丝腺与茧壳中的荧光信号相比，转基因家蚕pckg-ckr的中部丝腺与茧壳呈现出了更强的红色荧光信号与绿色荧光信号(图4，e)，转基因家蚕pckg-ckr茧壳中的rfp与egfp蛋白的含量也显著高于转基因家蚕pg-r茧壳，提高了约50％(图4，f)，说明在转基因家蚕个体水平，通过引入ck能够显著地提高基因的表达效率。更重要的是，在转基因家蚕pckg-ckr茧壳中的rfp与egfp蛋白的含量分别为0.36±0.03％、0.28±0.07％，无明显差异(图4，g)。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>西南大学

<120>实现两个基因等量表达的基于2a裂解肽的多基因元件及表达载体和应用

<160>40

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ctgacggatccgatggtgcgctcctccaagaa32

<210>2

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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ctgacggatccgatgcgcttcgtattatgct31

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<211>42

<212>dna

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cagtgcggccgcttatttgtataactcatccattcctaaggt42

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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ggaacaggtgg71

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<212>dna

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tttttcgctctaattatgacctactaaagttgtgcggtgatatcgagtctaatcctggac60

ctgtgagcaagggcg75

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<212>dna

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c61

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c61

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cctacgaaggtcacaacacagtc23

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<211>23

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