本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种马克斯克鲁维酵母启动子、含有该马克斯克鲁维酵母启动子的重组表达载体、含有该马克斯克鲁维酵母启动子或重组表达载体的基因工程菌及其制备方法与应用。
背景技术：
马克斯克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus，下文简称km)是同宗配合的半子囊菌酵母，位于酵母科克鲁维属。km通常在酸奶，马乳酒，奶酪，牛奶，以及甘蔗叶子中出现。km是一种被普遍认可的食品级的酵母。它已经通过了fda的gras认证，欧盟的qps认证，还被中国卫计委批准为新食品原料。由于其安全性高，km在生产食用、饲用和药用蛋白领域具有得天独厚的优势。但是km目前缺乏高效的表达元件和配套的表达载体，限制了km表达系统的发展。
技术实现要素：
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种马克斯克鲁维酵母启动子、含有该马克斯克鲁维酵母启动子的重组表达载体、含有该马克斯克鲁维酵母启动子或重组表达载体的基因工程菌及其制备方法与应用。其具体技术方案如下：
本发明在第一方面提供了一种马克斯克鲁维酵母启动子，为菊粉酶基因启动子，其包含菊粉酶基因起始密码子上游1136bp的序列，去除了n端的poly-a序列，并且包含潜在的转录因子的结合位点。
优选地，上述转录因子为zn(ii)2cys6转录因子。菊粉酶基因的表达可能受到zn(ii)2cys6转录因子的调控，该因子的识别位点为(cggn8cgg)。通过对启动子的分析，发现在起始密码子上游-1087到1073bp之间存在一个很相似的转录因子的结合位点(cggcggggctgccgg)，提示该区域参与调控菊粉酶基因启动子的活性。因此，保留这一区域可能有助于提升菊粉酶基因启动子的活性。
在较优实施例中，马克斯克鲁维酵母启动子至少包括以下核苷酸序列：
1)如seqidno.3所示的核苷酸序列；或
2)如seqidno.3所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，具有菊粉酶基因启动子活性的衍生核苷酸序列。
本发明在第二方面提供了一种重组表达载体，其包含本发明在第一方面提供的马克斯克鲁维酵母启动子。
优选地，上述重组表达载体还包含菊粉酶信号肽、菊粉酶基因终止子、ura3基因和酵母自主复制序列。
在较优实施例中，重组表达载体的核苷酸序列如seqidno.10所示。
优选地，重组表达载体还包含与上述马克斯克鲁维酵母启动子可操作地连接的目的基因。
更优选地，目的基因为阿魏酸酯酶基因。
本发明在第三方面提供了一种基因工程菌，其含有本发明在第一方面提供的马克斯克鲁维酵母启动子。
本发明还提供了一种基因工程菌，其含有本发明在第二方面提供的重组表达载体。
优选地，上述基因工程菌的宿主菌为马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株。
更优选地，上述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株来源于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为cgmccno.10621的马克斯克鲁维酵母菌，通过同源重组敲除ura3基因获得。
本发明在第四方面提供了本发明在第一方面提供的马克斯克鲁维酵母启动子的应用，马克斯克鲁维酵母启动子用于提高外源蛋白的表达。
优选地，外源蛋白为阿魏酸酯酶。
本发明在第五方面提供了本发明在第一方面提供的马克斯克鲁维酵母启动子的制备方法，制备方法包括以下步骤：
步骤1、以马克斯克鲁维酵母菌fim-1的基因组为模板，利用核苷酸序列如seqidno.1所示的引物inu-f1和核苷酸序列如seqidno.2所示的引物inu-r1pcr扩增菊粉酶基因；
步骤2、在反应体系中添加taq酶，对步骤1中的pcr扩增产物进行加a，获得目的片段；
步骤3、回收步骤2中的目的片段，与pmd18-t载体进行连接，得到含有菊粉酶基因启动子的质粒pmd18-t-inu。
优选地，上述马克斯克鲁维酵母菌fim-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.10621。
本发明在第六方面提供了本发明在第二方面提供的重组表达载体的制备方法，制备方法包括以下步骤：
步骤1、以质粒pmd18-t-inu为模板，利用核苷酸序列如seqidno.4所示的引物inuδ-f1和核苷酸序列如seqidno.5所示的引物inuδ-r1将菊粉酶基因的79-1668bp的序列去除，同时在菊粉酶基因的78bp之后和终止密码子之间引入多克隆位点，得到质粒pmd18-t-p2-sp-mcs-tinu；
步骤2、以质粒pmd18-t-p2-sp-mcs-tinu为模板，利用核苷酸序列如seqidno.6所示的引物inu-f2和核苷酸序列如seqidno.7所示的引物inu-r2扩增p2-sp-mcs-tinu片段；
步骤3、以pukd载体为模板，利用核苷酸序列如seqidno.8所示的引物pukd-f1和核苷酸序列如seqidno.9所示的引物pukd-r1将pks和kd序列之间的ecori位点去除，得到质粒pukdδe；
步骤4、利用ecori对质粒pukdδe进行酶切，回收酶切产物；
步骤5、将步骤2中的p2-sp-mcs-tinu片段与步骤4中的酶切产物连接，得到载体pukdn132-p2。
优选地，步骤1中，质粒pmd18-t-inu根据上述马克斯克鲁维酵母启动子的制备方法进行制备。
优选地，步骤1中，多克隆位点至少包括smai、spei和noti的位点。
优选地，p2-sp-mcs-tinu片段包含菊粉酶基因启动子从起始密码子上游1136bp开始到起始密码子上游1bp的序列、菊粉酶基因的1-78bp含有编码信号肽的序列、多克隆位点和菊粉酶基因终止子842bp。
本发明在第七方面提供了阿魏酸酯酶基因重组表达载体的制备方法，制备方法包括以下步骤：
步骤1、利用spei和noti对质粒pukdn112-este进行酶切，回收含有阿魏酸酯酶基因的酶切产物；
步骤2、利用spei和noti对质粒pukdn132-p2进行酶切，回收酶切产物；
步骤3、将步骤1中的酶切产物与步骤2中的酶切产物进行连接，得到质粒pukdn132-p2-este。
优选地，步骤1中的质粒pukdn112-este根据专利申请号为201711086961.9的文献制备得到。
优选地，步骤2中的质粒pukdn132-p2根据上述重组表达载体的制备方法进行制备。
本发明在第八方面提供了含有上述重组表达载体的基因工程菌的制备方法，制备方法包括以下步骤：
步骤1、将来源于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为cgmccno.10621的马克斯克鲁维酵母菌，通过同源重组敲除ura3基因，并利用含有5-氟乳清酸的ypd筛选获得尿嘧啶缺陷的宿主菌fim-1ura3δ；
步骤2、采用醋酸锂转化法将重组表达载体转入宿主菌fim-1ura3δ；
步骤3、将转化后的产物涂布于sd平板，恒温培养直至克隆形成。
优选地，上述步骤2中，重组表达载体为pukdn132-p2-este。
本发明提供的马克斯克鲁维酵母启动子以及利用该启动子构建的重组载体，实现了对外源蛋白的高效表达，很大程度上促进了km表达系统的发展，在食用、饲用和药用蛋白领域将具有广泛的应用。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1示出了本发明较优实施例中含有菊粉酶基因启动子的重组表达载体pukdn132-p2的示意图；
图2示出了本发明较优实施例中描述的p2启动子与其他长度的菊粉酶基因启动子的比较；p1中带有“a”字样的区域表示位于起始密码子上游1170bp到上游1137bp的富含a的区域，p2中的条状区域表示潜在的zn(ii)2cys6转录因子的结合位点；
图3示出了本发明较优实施例中描述的p2启动子与其他长度的菊粉酶基因启动子驱动的阿魏酸酯酶的表达活性的比较；柱状表示平均值±s.d(n＝4)。
具体实施方式
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
实施例1、马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因启动子的扩增
按照酵母基因组dna提取试剂盒(solarbio，d1900)说明书的方法，抽提马克斯克鲁维酵母菌fim-1的基因组。fim1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.10621(保藏单位代码：cgmcc，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年3月13日，检测结果：存活，分类命名：马克斯克鲁维酵母kluyveromycesmarxianus)。
以fim-1的基因组为模板，利用引物inu-f1(序列如seqidno.1所示)和inu-r1(序列如seqidno.2所示)扩增菊粉酶基因，包括菊粉酶基因启动子(起始于起始密码子上游1136bp)菊粉酶基因(1671bp)和菊粉酶基因终止子(842bp)。pcr的过程参照phantasuperfidelitydnapolymerase的产品说明进行(vazyme,货号p505-d1/d2/d3)。pcr完成后，在反应体系添加1μltaq酶(takara,r001q)，72℃反应20min，对pcr产物进行加a。通过琼脂糖电泳分析pcr扩增产物，获得了3649bp的目的片段。按照sanprep柱式dna胶回收试剂盒(生工，货号b518131-0050)的说明书操作，对pcr产物进行回收。将pcr产物与pmd18-t载体(takara,6011)进行连接，连接方法参见产品说明书。获得的质粒被命名为pmd18-t-inu。该质粒上含有菊粉酶基因启动子，从菊粉酶基因起始密码子上游1136bp开始，到起始密码子上游1bp结束，该启动子被简称为p2(序列如seqidno.3所示)。
实施例2、含有马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因启动子的重组表达载体的构建
按照quikchangeiisite-directedmutagenesiskit(agilent,200523)说明书的方法，以pmd18-t-inu为模板，利用引物inuδ-f1(序列如seqidno.4所示)和inuδ-r1(序列如seqidno.5所示)将菊粉酶基因的79-1668bp的序列去除，同时在菊粉酶基因的78bp之后和终止密码子(tga)之间引入多克隆位点。该多克隆位点包括了smai,spei和noti的位点。获得的质粒被命名为pmd18-t-p2-sp-mcs-tinu。
以pmd18-t-p2-sp-mcs-tinu为模板，利用引物inu-f2(序列如seqidno.6所示)和inu-r2(序列如seqidno.7所示)扩增p2-sp-mcs-tinu片段。该片段含有菊粉酶基因的启动子(从起始密码子上游1136bp开始，到起始密码子上游1bp)，菊粉酶基因的1-78bp(含有编码信号肽的序列)，多克隆位点和菊粉酶终止子(842bp)。pcr反应采用phantasuperfidelitydnapolymerase。通过琼脂糖电泳分析pcr扩增产物，获得了2150bp的p2-sp-mcs-tinu片段。利用sanprep柱式dna胶回收试剂盒对p2-sp-mcs-tinu片段进行回收。
按照quikchangeiisite-directedmutagenesiskit的使用说明，以pukd载体(applmicrobiolbiotechnol(2003)62:387-391)为模板，利用引物pukd-f1(序列seqidno.8所示)和pukd-r1(序列seqidno.9所示)将pks序列(大肠杆菌复制序列和氨苄抗性基因)和kd序列(酵母自主复制序列)之间的ecori位点去除。获得质粒为pukdδe。利用ecori对pukdδe进行酶切，利用sanprep柱式dna胶回收试剂盒对酶切产物进行回收。
利用gibsonassembly无痕连接系统(neb公司，货号e2611s/l)，将p2-sp-mcs-tinu片段与pukdδe的ecori酶切产物连接。获得的载体为pukdn132-p2，如图1所示，pukdn132-p2的序列如seqidno.10所示。
实施例3、利用马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因启动子实现阿魏酸酯酶的分泌表达
利用spei和noti对实验室保存的pukdn112-este(专利申请号201711086961.9)进行酶切。利用sanprep柱式dna胶回收试剂盒对754bp的酶切产物回收。该片段含有阿魏酸酯酶基因este的编码序列。
利用spei和noti对pukdn132-p2进行酶切，利用sanprep柱式dna胶回收试剂盒对酶切产物回收。按照dnaligationkitver.2.1(takara,6022)说明书操作，将pukdn132-p2和este的酶切产物进行连接。获得的质粒命名为pukdn132-p2-este。
本发明采用的酵母表达宿主菌株来源于马克斯克鲁维酵母菌fim-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.10621(保藏单位代码：cgmcc，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年3月13日，检测结果：存活，分类命名：马克斯克鲁维酵母kluyveromycesmarxianus)。通过同源重组的方法敲除ura3基因，并利用含有5-氟乳清酸(1.5g/l)的ypd筛选获得尿嘧啶缺陷的表达宿主菌，被命名为马克斯克鲁维酵母fim-1ura3δ。采用醋酸锂转化法(worldjournalofmicrobiology&biotechnology16:653-654,2000)，将pukdn132-p2-este转入fim-1ura3δ中。将转化后的产物涂布于sd平板(0.67％无氨基酸酵母氮源、2％葡萄糖、2％琼脂)，将平板放置30℃恒温培养箱培养，培养2-4天直至克隆形成。克隆被命名为fim-1-este。
挑选4个不同的fim1-este的克隆，接种于装有50ml的yd培养基(2％酵母抽提物，4％葡萄糖)中，30℃、220rpm培养72h后收集上清，进行阿魏酸酯酶的酶活测定。测定方法和酶活定义参照专利进行(专利申请号201711086961.9)。4个克隆的平均酶活为4.4u/ml，说明利用马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因启动子可以实现阿魏酸酯酶的分泌表达。
实施例4、本发明的马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因启动子与其他长度的马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因启动子的表达能力的比较
此前用于外源蛋白表达的菊粉酶基因启动子主要包括：从起始密码子上游1216bp起始的启动子(专利申请号201711086961.9，简称为p1启动子)，从起始密码子上游1053bp起始的启动子(femsyeastres.2017sep1；17(6).doi:10.1093/femsyr/fox062，简称为p3启动子)，从起始密码子上游737bp起始的启动子(applmicrobiolbiotechnol.1993nov；40(2-3):309-17.简称为p4启动子)，从起始密码子上游353bp起始的启动子(femsyeastres.2017sep1；17(6).doi:10.1093/femsyr/fox062，简称为p5启动子)。
本发明的p2启动子从起始密码子上游1136bp起始。p2启动子与上述所有启动子的长度不同。与p1启动子相比，p2启动子去除了polya序列。与p3启动子相比，增加了一个潜在的zn(ii)2cys6转录因子的结合位点。p1～p5启动子的比较参见图2。
为了比较p1～p5启动子的表达能力，本实施例采用与实施例1和实施例2类似的方法，将p1、p3、p4、p5启动子构建成重组载体。这些重组载体除了菊粉酶基因启动子的长度不同以外，其他序列与pukdn132-p2完全一致，被分别命名为pukdn132-p1、pukdn132-p3、pukdn132-p4和pukdn132-p5。
本实施例采用与和实施例3类似的方法，将阿魏酸酯酶基因转入上述载体中，获得pukdn132-p1-este,pukdn132-p3-este,pukdn132-p4-este和pukdn132-p5-este。将这些载体转入fim-1ura3δ中，对转化子进行培养，吸取上清进行阿魏酸酯酶的酶活测定，并与pukdn132-este(含有本发明描述的p2启动子)的转化子培养液上清中的酶活进行比较。结果如图3所示，本发明描述的p2启动子驱动表达的阿魏酸酯酶的活性显著高于其他启动子的活性，表明本发明描述的菊粉酶基因启动子在表达外源蛋白上具有先进性。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110>复旦大学
<120>一种马克斯克鲁维酵母启动子及其制备方法与应用
<130>2018
<160>10
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>28
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<400>1
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