本发明涉及植物分子生物学领域及基因组dna制备的技术领域，尤其涉及一种新疆洋葱野生近缘种花基因组dna的提取方法。
背景技术：
洋葱野生近缘种按照apgiv划分属于石蒜科（amaryllidaceae）葱属（alliuml.）多年生草本植物。洋葱野生近缘种为实葶葱（alliumgalanthumkar.&kiri.），俗称雪片莲洋葱（snowdroponion）、雪滴莲洋葱，原产地亚洲，国外主要分布于哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、蒙古和俄罗斯；国内仅分布于新疆北部的阿尔泰、布尔津、塔城、博乐及玛纳斯等海拔500~1500m的砾质山坡、峭壁与河谷等地带。新疆洋葱野生近缘种实葶葱是具有食用、药用及观赏价值的植物资源，基于分子生物学的研究认为，实葶葱不仅是洋葱的野生近缘种，而且与大葱（a.fistulosuml.）、阿勒泰葱（a.altaicumpall.）、薤白（a.chinenseg.don）以及北葱（a.schoenprasuml.）的亲缘关系也较近，实葶葱研究为揭示野生近缘种物种演化和系统关系显得尤为重要。实葶葱不仅是研究亲缘关系、种质创新的亲本材料，而且其经济价值开发利用也具有广泛应用前景。
基于分子水平的新疆野生葱属植物亲缘关系研究中，以往主要以鲜嫩叶片为材料提取基因组dna，然而新疆特殊环境下的葱属植物有些野生种类存在叶片数量少，且容易枯萎，给取样带来困难，有些种类不同程度存在叶片表皮角质层厚现象，导致叶片研磨过程耗时费力，其次，叶片中的硫化物、糖醇、黄酮类以及较高含量的纤维素要求操作过程中多次除杂，影响了dna纯度和浓度。
新疆野生葱属植物基因组dna的提取还有以成熟种子为材料（专利号20160461767.3），这种方法是针对新疆大蒜野生近缘种种质资源地理分布特征、生活史特征以及叶片生长特点，采用了种子基因组dna的提取技术，保证野外材料安全获得、准确识别。因此，根据新疆野生葱属植物特点构建适宜的dna提取技术方法十分必要。
洋葱野生近缘种实葶葱的叶片营养成分全面、营养价值高，维生素、类胡萝卜素、可溶性糖、纤维素、蛋白质含量显著高于其它葱蒜类蔬菜，以叶片为材料提取dna需要多次除杂，提取过程耗时费力。而实葶葱的花一般于6月中旬进入始花期，6月下旬进入盛花期，7月中旬花期结束。花葶近60cm高，伞形花序呈球形，着生于花葶顶端，每1花序有白色小花150~400朵，最多可达620朵，小花十分密集。这些花部特征为花基因组dna提取提供了充足的材料和取样时间。根据该野生资源不同开花物候阶段，以花为材料进行取样，具有鲜嫩、取样准确、量大、时间充足、成本低、操作简便、研磨省力、快速高效的优势。到目前为止，还没有针对洋葱野生近缘种实葶葱花基因组dna提取方法的相关报道。
技术实现要素：
为了解决上述存在的技术问题，结合材料年生活史和形态特征，本发明提出了一种新疆洋葱野生近缘种花基因组dna的提取方法。
本发明的一种新疆洋葱野生近缘种花基因组dna的提取方法，需通过以下步骤实现：
（1）6月中旬~7月中旬野外原生境下标记健康、完整的洋葱野生近缘种成株，以花为材料，依次在开花始期，植株上花序出现50%的花蕾时采集花蕾；在开花盛期，植株上花序的50%小花完全盛开时采集花药散落前的小花；在开花末期，植株上花序小于10%小花仍在盛开时采集花药完全散落后的小花；将采集的花分别迅速放入装有硅胶的采集袋中，室温下干燥。
优选地，所述原生境是指洋葱野生近缘种的野外分布的生长地。洋葱野生近缘种是实葶葱。
（2）称取0.2g已干燥花器官，加入约30ml液氮迅速研磨至粉末，转入离心管中。
（3）向离心管中加入750μl65℃预热的sds提取缓冲液，加入2%体积的预冷的β-巯基乙醇，快速涡旋混匀；将离心管置于65℃水浴锅中，保温30min~40min，每隔5~8min，轻轻混匀。所述sds提取缓冲液为：sds2.0g、pvp1g，1mtris10ml、0.5medta4ml、5mnacl28ml、β-巯基乙醇2ml。
优选地，所述的65℃水浴锅中保温30min~40min。作为最佳方案，花蕾、花药散落前的花及花药完全散落后的花水浴时间分别为30min、30min和40min。
（4）水浴后将离心管取出，冷却至室温后4℃，12000r/min，离心10min。
（5）取750μl上清液，加入1/3体积的预冷的5mol/lkac溶液，0℃条件下冰浴30min，冰浴后4℃，12000r/min，离心10min。所述5mol/lkac溶液为：无水kac40.5g，ph值为8.0。
（6）取600μl上清液，加入700μl预冷的氯仿/异戊醇溶液，再加入1/3体积的naac溶液混匀，轻柔倒管5~8min，4℃，12000r/min，离心10min。所述氯仿/异戊醇溶液为：氯仿/异戊醇的体积比为24:1。
优选地，所述的naac溶液为5mol/lnaac溶液。
（7）再次重复步骤（6）。
（8）吸取400μl上清液至另一新离心管，加入2倍体积的预冷的无水乙醇和1/2体积的naac溶液，上下颠倒混匀，至出现白色絮状物，然后放入-20℃冰箱中保存30min。
优选地，所述的所述的预冷的无水乙醇为-20℃预冷的无水乙醇，naac溶液为3mol/lnaac溶液。
（9）将步骤（8）所述离心管4℃，12000r/min，离心10min，弃上清液，得到沉淀物；用4℃预冷的70%酒精清洗沉淀物2次（浸泡约5min）和-20℃预冷的无水乙醇清洗沉淀物1次（浸泡约5min），放入-20℃冰箱中保存5min。
（10）将步骤（9）所述离心管从冰箱取出，4℃，12000r/min，离心3min；弃上清液，室温下自然风干10min。
（11）风干后加入预冷的35μlddh2o，4℃，12000r/min，离心2min，将沉淀物完全溶解后可得到dna原液，置于-20℃冰箱中保存备用。
本发明与现有野生葱属植物基因组dna其他提取方法对比，具有以下优势：
（1）取样方式多，该方法在洋葱野生近缘种不同开花物候阶段均可以取样，取样时间长达一个月左右、取样时间充足、取样量大。
（2）野外条件下花比叶片和种子具有更强的种的特异性，更易识别，取样准确。
（3）针对洋葱野生近缘种花形态和物质成分含量特征，优选出花蕾和花药散落前的小花水浴时间为30min，花药完全散落后的小花的水浴时间为40min；以加氯仿/异戊醇和5mol/lnaac溶液及采用-20℃预冷的无水乙醇加3mol/lnaac溶液，分别作为去除沉淀物中的蛋白质等杂质和沉淀dna的最佳处理方案，可以从新疆洋葱野生近缘种不同时期的花中获得高纯度、完整的基因组dna，实现pcr扩增。
本发明有益效果是：本发明获得了一种适合于新疆洋葱野生近缘种花基因组dna的提取方法，提取过程操作简便易掌握，研磨省工省力，快速高效，具有一定的应用前景。
附图说明
图1是原生境下采集实葶葱不同时期花的图。
图2是原生境下采集实葶葱叶片的图。
图3是用本方法提取的实葶葱不同时期花基因组dna的电泳图谱。
图4是用本方法提取的实葶葱新鲜叶片基因组dna的电泳图谱。
图5是本方法提取的实葶葱不同时期花基因组dna进行pcr扩增的电泳图谱。
图6是本方法提取的实葶葱新鲜叶片基因组dna进行pcr扩增的电泳图谱。
其中，图1中不同时期的花图片上字母依次为：a花蕾、b花药散落前的小花、c花药完全散落后的小花。图3中基因组dna电泳图序号依次为：1~2花蕾、3~4花药散落前的小花、5~6花药完全散落后的小花。图5中pcr扩增条带序号依次为：1~10花蕾、11~20花药散落前的小花、21~30花药完全散落后的小花。
具体实施方式
实施例1一种新疆洋葱野生近缘种（实葶葱）花蕾基因组dna的提取方法，包括以下步骤：
（1）称取0.2g已干燥的花蕾，加入约30ml液氮迅速研磨至粉末，转入离心管中。
（2）向离心管中加入750μl65℃预热的sds提取缓冲液，加入2%体积的预冷的β-巯基乙醇，快速涡旋混匀。将离心管置于65℃水浴锅中，保温30min，每隔5~8分钟，轻轻混匀。所述sds提取缓冲液为：sds2.0g、pvp1g，1mtris10ml、0.5medta4ml、5mnacl28ml、β-巯基乙醇2ml。
（3）水浴后将离心管取出，冷却至室温后4℃，12000r/min，离心10min。
（4）取750μl上清液，加入1/3体积的预冷的5mol/lkac溶液，0℃条件下冰浴30min，冰浴后4℃，12000r/min，离心10min。所述5mol/lkac溶液为：无水kac40.5g，ph值为8.0。
（5）取600μl上清液，加入700μl预冷的氯仿/异戊醇溶液，再加入1/3体积5mol/lnaac溶液混匀，轻柔倒管5~8min，4℃，12000r/min，离心10min。所述氯仿/异戊醇溶液为：氯仿/异戊醇的体积比为24:1，5mol/lnaac溶液为：无水naac68g，ph值为8.0。
（6）再次重复步骤（5）。
（7）吸取400μl上清液至另一新离心管，加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇和1/2体积的3mol/lnaac溶液，上下颠倒混匀，至出现白色絮状物，然后放入-20℃冰箱中保存30min。所述3mol/lnaac溶液为：无水naac40.8g，调ph值至8.0。
（8）将步骤（7）所述的离心管4℃，12000r/min，离心10min，弃上清液，得到沉淀物。用4℃预冷的70%酒精清洗沉淀物2次（浸泡约5min）和-20℃预冷的无水乙醇清洗沉淀物1次（浸泡约5min），放入-20℃冰箱中保存5min。
（9）将步骤（8）所述的离心管从冰箱取出，4℃，12000r/min，离心3min。弃上清液，室温下自然风干10min。
（10）风干后加入预冷的35μlddh2o，4℃，12000r/min，离心2min，将沉淀物完全溶解后可得到dna原液，置于-20℃冰箱中保存备用。
实施例2一种新疆洋葱野生近缘种（实葶葱）花药散落前的小花基因组dna的提取基因方法，除了在将离心管置于65℃水浴锅中，保温30min，其余步骤与实施例1一致。
实施例3一种新疆洋葱野生近缘种（实葶葱）花药完全散落后的小花基因组dna的提取方法，除了在将离心管置于65℃水浴锅中，保温40min，其余步骤与实施例1一致。
实施例4一种新疆洋葱野生近缘种（实葶葱）新鲜叶片基因组dna的提取方法，包括以下步骤：
（1）称取0.2g已干燥的新鲜叶片，加入液氮迅速研磨至粉末，转入离心管中。
（2）向离心管中加入750μl65℃预热的sds提取缓冲液，加入30μl预冷的β-巯基乙醇，快速涡旋混匀。将离心管置于65℃水浴锅中，保温40min，期间轻轻混匀8次。
（3）水浴后将离心管取出，冷却至室温后4℃，12000r/min，离心15min。
（4）取750μl上清液，加入250μl预冷kac溶液，0℃条件下冰浴30min，冰浴后4℃，12000r/min，离心15min。
（5）取600μl上清液，加入750μl预冷的氯仿/异戊醇溶液，再加入200μlnaac溶液混匀，轻柔倒管5~8min，4℃，12000r/min，离心15min。
（6）再次重复步骤（5）。
（7）吸取400μl上清液至另一新离心管，加入800μl-20℃预冷的无水乙醇和200μl3mol/lnaac溶液，上下颠倒混匀，然后放入-20℃冰箱中保存30min。
（8）将步骤（7）所述的离心管4℃，12000r/min，离心15min，弃上清液，得到沉淀物。用4℃预冷的70%酒精清洗沉淀物2次（浸泡约5min）和-20℃预冷的无水乙醇清洗沉淀物1次，浸泡约10min，放入-20℃冰箱中保存5min。
（9）将步骤（8）所述离心管从冰箱取出，4℃，12000r/min，离心5min。弃上清液，室温下自然风干30min。
（10）风干后加入预冷的35μlddh2o，4℃，12000r/min，离心2min，将沉淀物完全溶解后可得到dna原液，然后置于-20℃冰箱中保存备用。
实验例1对实施例1~4提取的基因组dna利用紫外分光光度计检测，具体步骤如下：取5μldna样品原液，加ddh2o稀释至100倍。根据od260/od280值来判断dna的纯度和浓度。od260/od280≈1.8，表明提取的dna较纯；od260/od280﹥1.9，则表明有rna污染、dna降解或dna链断裂；od260/od280﹤1.6，表明样品中含有较多的蛋白质或提取时所用的酚试剂。
实验例2对实施例1~4提取的基因组dna利用琼脂糖凝胶电泳检测，具体步骤如下：
取2μldna样品原液，加2μl溴芬蓝混合后点样，用1%的琼脂糖凝胶（含2μlgelstain）电泳检测样品dna的质量，于120v电压下，电泳25~30min，alphailmagehp凝胶成像系统下观察并拍照。
实验例3对实施例1~4提取的基因组dna样品进行pcr扩增，扩增后进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，经银染后，置于胶片观察灯下观察拍照。
引物组合为固定引物（aatctcaaggacaaaagg）和随机引物（gactgcgtacgaattaac），pcr反应体系为：10×pcrbuffer2μl，模板dna1.5μl，dntps2.0μl，固定引物和随机引物各0.5μl，taq聚合酶0.15μl，加13.35μl的ddh2o补足至20μl总体积。
pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，37℃退火45s，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
实验例4结果分析
表1为紫外分光光度计检测实施例1~4不同时期花及新鲜叶片基因组dna样品的纯度和浓度的比较
经紫外分光光度计检测，不同时期花所提取的基因组dna溶液的纯度在1.762~1.962之间，新鲜叶片所提取的基因组dna溶液的纯度为1.828，不同器官材料均能获得溶液纯度较高的dna，采用花和叶不同器官所获得的基因组dna溶液的浓度在185~265μg/ml之间，基因组dna的产量都较高。由图3和图4可以看出，本方法所得到的基因组dna条带清晰、无拖尾、rna污染现象，说明三个不同时期花和新鲜叶片均能提取出较为完整的基因组dna溶液，且可用于pcr扩增反应。
pcr扩增产物经聚丙烯酰氨凝胶电泳检测图可以看出，实施例1~3所得到花药完全散落前的小花（图5，泳道11~20）所得的pcr产物主条带较为清晰，位点较多，花药散落前的小花（图5，泳道21~30）次之，花蕾（图5，泳道1~10）相对来说较差；实施例4所得到新鲜叶片（图6，泳道1~10）所得的pcr产物主条带清晰，位点较多。
实验例5总结
由本发明的实施例1~3可以看出，以不同开花物候阶段花为材料，经改良sds法提取到的基因组dna的纯度高、杂质少，可用于后期的pcr扩增。与以叶片为材料相比，以花为材料提取基因组dna具有取样时间充足、取样量大、取样准确等特点。提取过程操作简便易掌握，研磨省工省力，快速高效获得高纯度dna。实践中，可以推广运用到其他野生葱属植物的基于花的基因组dna提取中。
以上内容是结合实施例对本发明所作的进一步详细描述，但不能作为本发明的具体实施范围。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，所做的非本质的调整及改进，都应当视为属于本发明的保护范围。