本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种将甘草生物转化富集甘草素的方法。
背景技术：
：甘草(radixglycyrrhizae)是世界上自古至今应用最广泛的药用植物之一。甘草天然野生资源随着药物的开发利用储存下降，人工种植资源丰富，但不同来源甘草质量差异大，发挥药效的天然活性成分含量低，合成困难。三萜皂苷类甘草酸在甘草中含量较丰富，其次是黄酮类甘草甙，但黄酮类在医药中主要活性形式是甙元成分。如何在现有甘草活性成分基础上，利用生物转化和生物催化将生源关系相近或结构类似的同系物转化为高活性药用成分。甘草含有的木质纤维素成分，构成甘草细胞结构屏障和支持功能，影响药用成分的有效提取。不同部位含有不同量的木质素、纤维素、半纤维素，物理结构以及化学结构均不同，影响药用菌的生长，最终影响生物催化和转化。简便迅速地发掘新型高效低毒药物先导化合物或活性组合物，实现甘草深度开发，保护自然资源，实现可持续发展是甘草深度利用的重要方向。甘草药理机制呈现多样性，报道有抗氧化、抗血栓形成、降压、抗炎、保护肝细胞和抗肿瘤。主要有效成分是酚类等中性亲脂成分，是多种黄酮类和类黄酮类物质的混合物，主要有甘草黄酮。walkerd等报道来源于甘草酸的β-glycyhrritinicacid具有导致抗炎的糖皮质激素积累作用。开发甘草药用活性成分是甘草药理深度利用的主要趋势之一。药用真菌应用于中药的研究是近年来的热点领域。庄毅等研究出槐耳黄芪菌质，并首次提出药用菌和中药相互作用的双向固体发酵概念。潘扬等研究20种真菌固体发酵生物碱含量及指纹谱变化。黄达明等研究猴头菌转化egb发酵液提取物抗氧化及抑制非酶糖基化活性，表明提取物自由基清除率、还原力等显著提高。然而，如何利用药用真菌来富集甘草中的甘草素，目前还属于研究的空白。技术实现要素：针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种将甘草生物转化富集甘草素的方法，以利用微生物固体发酵工程技术进行甘草素富集，没有酸解的污染，也省去用酶水解甘草甙的成本，降低了生产成本，为甘草活性成分的提取提供了新的技术途径。为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：本发明提供了一种将甘草生物转化富集甘草素的方法，包括步骤：将甘草粉碎后灭菌，然后加入水，混合均匀，得到固体发酵培养基；其中，甘草的干重和水的体积的比值为1g：(1.0～1.2)ml；在固体发酵培养基中接种诱变的黑曲霉菌种，然后进行固体发酵培养。优选地，固体发酵培养的时间为12～20天，固体发酵培养的温度为26～30℃。优选地，诱变的黑曲霉菌种的诱变方法包括紫外诱变和/或化学诱变。诱变的黑曲霉菌种的诱变方法包括步骤：将活化后的黑曲霉菌种加入无菌水中，然后振荡得到分散的孢子悬液；将孢子悬液中进行紫外照射，得到紫外诱变后的孢子悬液；在紫外诱变后的孢子悬液中加入化学诱变剂，化学诱变预设时间后，加入硫代硫酸钠水溶液；将得到的诱变后孢子悬液涂布于固体平板pda培养基上，26～28℃培养72～80h，长出的菌落为诱变的黑曲霉菌种。需要说明的是，本发明采用的黑曲霉菌种包括第一黑曲霉菌种、第二黑曲霉菌种和第三黑曲霉菌种，第一黑曲霉菌种、第二黑曲霉菌种和第三黑曲霉菌种的活菌比值为(2.0～2.5):1:(0.5～0.8)，都购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心；其中，第一黑曲霉菌种的保藏号为cgmccno:3.17612，第二黑曲霉菌种的保藏号为cgmccno:3.11584，第三黑曲霉菌种的保藏号为cgmccno:3.11598。本发明中，pda培养基的组分包括：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g，加水至1000ml。优选地，分散的孢子悬液中，黑曲霉的浓度为(1～10)×106cfu/ml。优选地，紫外照射的强度为25～28w，紫外灯与孢子悬液的垂直距离为32～35cm，紫外照射的时间为20～25s。优选地，化学诱变剂为硫酸二乙酯水溶液，硫酸二乙酯水溶液的质量百分数为1.1％～1.2％；孢子悬液和化学诱变剂的体积比为100:(1.5～2.0)；化学诱变的时间为20～25min，化学诱变的过程中持续震荡。优选地，硫代硫酸钠水溶液中，硫代硫酸钠的质量百分数为20％～25％。优选地，发酵采用的装置为太空包；太空包的体积为3000～4000cm3。优选地，接种具体包括步骤：挑取平板培养基上的诱变的黑曲霉菌落，接种至固体发酵培养基后混合均匀；诱变的黑曲霉菌落的接种量为0.1％～0.5％。需要说明的是，接种前，优选将平板培养基上长出的所有黑曲霉菌落混合均匀。本发明提供的技术方案，与传统的甘草素提取方式不同，具有显著的创新性，主要体现在以下几点：(1)甘草素在甘草中主要以多种糖甙形式存在，而甘草素是一种具有潜在开发价值的高活性化合物，而现阶段提取途径为酶法或酸水解法；本发明针对甘草素提取的现状，将微生物固体发酵工程技术直接应用于甘草素的富集，具有明显的创新性；微生物固体发酵技术集酶的产生和产物生成为一体，有利于简化下游分离技术和利用药用真菌具有高效降解与转化能力对甘草深度加工利用；本发明提供了新的甘草加工的生物途径；(2)本发明选择真菌作为发酵菌种，在进行甘草素富集的同时产生有益于人体的真菌有效物质，可以很好的产生有效物质的叠加，有利于保健产品的开发，很好的解决了微生物菌株在发酵中应用的问题，相对于使用其他微生物菌株而言具有明显的优势；(3)本发明创新地直接利用甘草固体发酵富集甘草素，没有酸解的污染，也省去用酶水解甘草甙的成本，降低了生产成本，为甘草活性成分的提取提供了新的技术途径；(4)本发明从资源化和生物转化的角度实现甘草的利用，具有显著的社会和环境效益。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。本发明提供一种将甘草生物转化富集甘草素的方法，包括步骤：s1：将甘草粉碎后灭菌，然后加入水，混合均匀，得到固体发酵培养基；其中，甘草的干重和水的体积的比值为1g：(1.0～1.2)ml；s2：将固体发酵培养基置于体积为3000～4000cm3的太空包中，然后接种诱变的黑曲霉菌种，混合均匀，诱变的黑曲霉菌落的接种量为0.1％～0.5％，再26～30℃固体发酵培养12～20天，即将甘草生物转化富集甘草素；其中，诱变的黑曲霉菌种的诱变方法包括步骤：s201：将活化后的黑曲霉菌种加入无菌水中，然后振荡得到分散的孢子悬液；其中，分散的孢子悬液中，黑曲霉的浓度为(1～10)×106cfu/ml；s202：将孢子悬液中进行紫外照射，得到紫外诱变后的孢子悬液；其中，紫外照射的强度为25～28w，紫外灯与孢子悬液的垂直距离为32～35cm，紫外照射的时间为20～25s；s203：在紫外诱变后的孢子悬液中加入质量百分数为1.1％～1.2％的化学诱变剂硫酸二乙酯水溶液，进行化学诱变，持续震荡20～25min后，加入硫代硫酸钠水溶液中止反应；其中，孢子悬液和化学诱变剂的体积比为100:(1.5～2.0)；硫代硫酸钠水溶液中，硫代硫酸钠的质量百分数为20％～25％；s204：将得到的诱变后孢子悬液涂布于固体平板pda培养基上，26～28℃培养72～80h，长出的菌落为诱变的黑曲霉菌种。下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。实施例一本实施例提供一种将甘草生物转化富集甘草素的方法，包括步骤：s1：将甘草粉碎后灭菌，然后加入水，混合均匀，得到固体发酵培养基；其中，甘草的干重和水的体积的比值为1g：1.1ml；s2：将固体发酵培养基置于体积为3500cm3的太空包中，然后接种诱变的黑曲霉菌种，混合均匀，诱变的黑曲霉菌落的接种量为0.3％，再28℃固体发酵培养18天，即将甘草生物转化富集甘草素；其中，诱变的黑曲霉菌种的诱变方法包括步骤：s201：将活化后的黑曲霉菌种加入无菌水中，然后振荡得到分散的孢子悬液；其中，分散的孢子悬液中，三种黑曲霉的总浓度为5×106cfu/ml；黑曲霉菌种采用第一黑曲霉菌种cgmccno:3.17612、第二黑曲霉菌种cgmccno:3.11584和第三黑曲霉菌种cgmccno:3.11598，且第一黑曲霉菌种、第二黑曲霉菌种和第三黑曲霉菌种的活菌比值为2.3:1:0.6；s202：将孢子悬液中进行紫外照射，得到紫外诱变后的孢子悬液；其中，紫外照射的强度为27w，紫外灯与孢子悬液的垂直距离为34cm，紫外照射的时间为23s；s203：在紫外诱变后的孢子悬液中加入质量百分数为1.15％的化学诱变剂硫酸二乙酯水溶液，进行化学诱变，持续震荡22min后，加入硫代硫酸钠水溶液中止反应；其中，孢子悬液和化学诱变剂的体积比为100:1.8；硫代硫酸钠水溶液中，硫代硫酸钠的质量百分数为23％；s204：将得到的诱变后孢子悬液涂布于固体平板pda培养基上，27℃培养76h，长出的菌落为诱变的黑曲霉菌种。实施例二本实施例提供一种将甘草生物转化富集甘草素的方法，包括步骤：s1：将甘草粉碎后灭菌，然后加入水，混合均匀，得到固体发酵培养基；其中，甘草的干重和水的体积的比值为1g：1.0ml；s2：将固体发酵培养基置于体积为3500cm3的太空包中，然后接种诱变的黑曲霉菌种，混合均匀，诱变的黑曲霉菌落的接种量为0.1％，再26℃固体发酵培养12天，即将甘草生物转化富集甘草素；其中，诱变的黑曲霉菌种的诱变方法包括步骤：s201：将活化后的黑曲霉菌种加入无菌水中，然后振荡得到分散的孢子悬液；其中，分散的孢子悬液中，三种黑曲霉的总浓度为1×106cfu/ml；黑曲霉菌种采用第一黑曲霉菌种cgmccno:3.17612、第二黑曲霉菌种cgmccno:3.11584和第三黑曲霉菌种cgmccno:3.11598，且第一黑曲霉菌种、第二黑曲霉菌种和第三黑曲霉菌种的活菌比值为2.0:1:0.5；s202：将孢子悬液中进行紫外照射，得到紫外诱变后的孢子悬液；其中，紫外照射的强度为25w，紫外灯与孢子悬液的垂直距离为32cm，紫外照射的时间为20s；s203：在紫外诱变后的孢子悬液中加入质量百分数为1.1％的化学诱变剂硫酸二乙酯水溶液，进行化学诱变，持续震荡20min后，加入硫代硫酸钠水溶液中止反应；其中，孢子悬液和化学诱变剂的体积比为100:1.5；硫代硫酸钠水溶液中，硫代硫酸钠的质量百分数为20％；s204：将得到的诱变后孢子悬液涂布于固体平板pda培养基上，26℃培养72h，长出的菌落为诱变的黑曲霉菌种。实施例三本实施例提供一种将甘草生物转化富集甘草素的方法，包括步骤：s1：将甘草粉碎后灭菌，然后加入水，混合均匀，得到固体发酵培养基；其中，甘草的干重和水的体积的比值为1g：1.2ml；s2：将固体发酵培养基置于体积为3500cm3的太空包中，然后接种诱变的黑曲霉菌种，混合均匀，诱变的黑曲霉菌落的接种量为0.5％，再30℃固体发酵培养20天，即将甘草生物转化富集甘草素；其中，诱变的黑曲霉菌种的诱变方法包括步骤：s201：将活化后的黑曲霉菌种加入无菌水中，然后振荡得到分散的孢子悬液；其中，分散的孢子悬液中，三种黑曲霉的总浓度为10×106cfu/ml；黑曲霉菌种采用第一黑曲霉菌种cgmccno:3.17612、第二黑曲霉菌种cgmccno:3.11584和第三黑曲霉菌种cgmccno:3.11598，且第一黑曲霉菌种、第二黑曲霉菌种和第三黑曲霉菌种的活菌比值为2.5:1:0.8；s202：将孢子悬液中进行紫外照射，得到紫外诱变后的孢子悬液；其中，紫外照射的强度为28w，紫外灯与孢子悬液的垂直距离为35cm，紫外照射的时间为25s；s203：在紫外诱变后的孢子悬液中加入质量百分数为1.2％的化学诱变剂硫酸二乙酯水溶液，进行化学诱变，持续震荡25min后，加入硫代硫酸钠水溶液中止反应；其中，孢子悬液和化学诱变剂的体积比为100:2.0；硫代硫酸钠水溶液中，硫代硫酸钠的质量百分数为25％；s204：将得到的诱变后孢子悬液涂布于固体平板pda培养基上，28℃培养80h，长出的菌落为诱变的黑曲霉菌种。对比例一本对比例提供一种将甘草生物转化富集甘草素的方法，包括步骤：s1：将甘草粉碎后灭菌，然后加入水，混合均匀，得到固体发酵培养基；其中，甘草的干重和水的体积的比值为1g：2.0ml；s2：将固体发酵培养基置于体积为3500cm3的太空包中，然后接种诱变的黑曲霉菌种，混合均匀，诱变的黑曲霉菌落的接种量为0.3％，再28℃固体发酵培养18天，即将甘草生物转化富集甘草素；其中，诱变的黑曲霉菌种的诱变方法包括步骤：s201：将活化后的黑曲霉菌种加入无菌水中，然后振荡得到分散的孢子悬液；其中，分散的孢子悬液中，三种黑曲霉的总浓度为5×106cfu/ml；黑曲霉菌种采用第一黑曲霉菌种cgmccno:3.17612、第二黑曲霉菌种cgmccno:3.11584和第三黑曲霉菌种cgmccno:3.11598，且第一黑曲霉菌种、第二黑曲霉菌种和第三黑曲霉菌种的活菌比值为2.3:1:0.6；s202：将孢子悬液中进行紫外照射，得到紫外诱变后的孢子悬液；其中，紫外照射的强度为27w，紫外灯与孢子悬液的垂直距离为34cm，紫外照射的时间为23s；s203：在紫外诱变后的孢子悬液中加入质量百分数为1.15％的化学诱变剂硫酸二乙酯水溶液，进行化学诱变，持续震荡22min后，加入硫代硫酸钠水溶液中止反应；其中，孢子悬液和化学诱变剂的体积比为100:1.8；硫代硫酸钠水溶液中，硫代硫酸钠的质量百分数为23％；s204：将得到的诱变后孢子悬液涂布于固体平板pda培养基上，27℃培养76h，长出的菌落为诱变的黑曲霉菌种。对比例二本对比例提供一种将甘草生物转化富集甘草素的方法，包括步骤：s1：将甘草粉碎后灭菌，然后加入水，混合均匀，得到固体发酵培养基；其中，甘草的干重和水的体积的比值为1g：1.1ml；s2：将固体发酵培养基置于体积为3500cm3的太空包中，然后接种诱变的黑曲霉菌种，混合均匀，诱变的黑曲霉菌落的接种量为0.3％，再28℃固体发酵培养18天，即将甘草生物转化富集甘草素；其中，诱变的黑曲霉菌种的诱变方法包括步骤：s201：将活化后的黑曲霉菌种加入无菌水中，然后振荡得到分散的孢子悬液；其中，分散的孢子悬液中，三种黑曲霉的总浓度为5×106cfu/ml；黑曲霉菌种采用第一黑曲霉菌种cgmccno:3.17612、第二黑曲霉菌种cgmccno:3.11584和第三黑曲霉菌种cgmccno:3.11598，且第一黑曲霉菌种、第二黑曲霉菌种和第三黑曲霉菌种的活菌比值为2.3:1:0.6；s202：将孢子悬液中进行紫外照射，得到紫外诱变后的孢子悬液；其中，紫外照射的强度为30w，紫外灯与孢子悬液的垂直距离为34cm，紫外照射的时间为150s；s203：在紫外诱变后的孢子悬液中加入质量百分数为1.15％的化学诱变剂硫酸二乙酯水溶液，进行化学诱变，持续震荡22min后，加入硫代硫酸钠水溶液中止反应；其中，孢子悬液和化学诱变剂的体积比为100:1.8；硫代硫酸钠水溶液中，硫代硫酸钠的质量百分数为23％；s204：将得到的诱变后孢子悬液涂布于固体平板pda培养基上，27℃培养76h，长出的菌落为诱变的黑曲霉菌种。对比例三本对比例提供一种将甘草生物转化富集甘草素的方法，包括步骤：s1：将甘草粉碎后灭菌，然后加入水，混合均匀，得到固体发酵培养基；其中，甘草的干重和水的体积的比值为1g：1.1ml；s2：将固体发酵培养基置于体积为3500cm3的太空包中，然后接种诱变的黑曲霉菌种，混合均匀，诱变的黑曲霉菌落的接种量为0.3％，再28℃固体发酵培养18天，即将甘草生物转化富集甘草素；其中，诱变的黑曲霉菌种的诱变方法包括步骤：s201：将活化后的黑曲霉菌种加入无菌水中，然后振荡得到分散的孢子悬液；其中，分散的孢子悬液中，三种黑曲霉的总浓度为5×106cfu/ml；黑曲霉菌种采用第一黑曲霉菌种cgmccno:3.17612、第二黑曲霉菌种cgmccno:3.11584和第三黑曲霉菌种cgmccno:3.11598，且第一黑曲霉菌种、第二黑曲霉菌种和第三黑曲霉菌种的活菌比值为2.3:1:0.6；s202：将孢子悬液中进行紫外照射，得到紫外诱变后的孢子悬液；其中，紫外照射的强度为27w，紫外灯与孢子悬液的垂直距离为34cm，紫外照射的时间为23s；s203：在紫外诱变后的孢子悬液中加入质量百分数为1.0％的化学诱变剂硫酸二乙酯水溶液，进行化学诱变，持续震荡30min后，加入硫代硫酸钠水溶液中止反应；其中，孢子悬液和化学诱变剂的体积比为100:1.8；硫代硫酸钠水溶液中，硫代硫酸钠的质量百分数为23％；s204：将得到的诱变后孢子悬液涂布于固体平板pda培养基上，27℃培养76h，长出的菌落为诱变的黑曲霉菌种。对比例四本对比例提供一种将甘草生物转化富集甘草素的方法，包括步骤：s1：将甘草粉碎后灭菌，然后加入水，混合均匀，得到固体发酵培养基；其中，甘草的干重和水的体积的比值为1g：1.1ml；s2：将固体发酵培养基置于体积为3500cm3的太空包中，然后接种诱变的黑曲霉菌种，混合均匀，诱变的黑曲霉菌落的接种量为0.3％，再28℃固体发酵培养18天，即将甘草生物转化富集甘草素；其中，诱变的黑曲霉菌种的诱变方法包括步骤：s201：将活化后的黑曲霉菌种加入无菌水中，然后振荡得到分散的孢子悬液；其中，分散的孢子悬液中，两种黑曲霉的总浓度为5×106cfu/ml；黑曲霉菌种采用第一黑曲霉菌种cgmccno:3.17612和第三黑曲霉菌种cgmccno:3.11598，且第一黑曲霉菌种和第三黑曲霉菌种的活菌比值为2.3:0.6；s202：将孢子悬液中进行紫外照射，得到紫外诱变后的孢子悬液；其中，紫外照射的强度为27w，紫外灯与孢子悬液的垂直距离为34cm，紫外照射的时间为23s；s203：在紫外诱变后的孢子悬液中加入质量百分数为1.15％的化学诱变剂硫酸二乙酯水溶液，进行化学诱变，持续震荡22min后，加入硫代硫酸钠水溶液中止反应；其中，孢子悬液和化学诱变剂的体积比为100:1.8；硫代硫酸钠水溶液中，硫代硫酸钠的质量百分数为23％；s204：将得到的诱变后孢子悬液涂布于固体平板pda培养基上，27℃培养76h，长出的菌落为诱变的黑曲霉菌种。对比例五本对比例提供一种将甘草生物转化富集甘草素的方法，包括步骤：s1：将甘草粉碎后灭菌，然后加入水，混合均匀，得到固体发酵培养基；其中，甘草的干重和水的体积的比值为1g：1.1ml；s2：将固体发酵培养基置于体积为3500cm3的太空包中，然后接种诱变的黑曲霉菌种，混合均匀，诱变的黑曲霉菌落的接种量为0.3％，再28℃固体发酵培养18天，即将甘草生物转化富集甘草素；其中，诱变的黑曲霉菌种的诱变方法包括步骤：s201：将活化后的黑曲霉菌种加入无菌水中，然后振荡得到分散的孢子悬液；其中，分散的孢子悬液中，黑曲霉的浓度为5×106cfu/ml；黑曲霉菌种采用第一黑曲霉菌种cgmccno:3.17612；s202：将孢子悬液中进行紫外照射，得到紫外诱变后的孢子悬液；其中，紫外照射的强度为27w，紫外灯与孢子悬液的垂直距离为34cm，紫外照射的时间为23s；s203：在紫外诱变后的孢子悬液中加入质量百分数为1.15％的化学诱变剂硫酸二乙酯水溶液，进行化学诱变，持续震荡22min后，加入硫代硫酸钠水溶液中止反应；其中，孢子悬液和化学诱变剂的体积比为100:1.8；硫代硫酸钠水溶液中，硫代硫酸钠的质量百分数为23％；s204：将得到的诱变后孢子悬液涂布于固体平板pda培养基上，27℃培养76h，长出的菌落为诱变的黑曲霉菌种。采用常规的高效液相色谱法，对本发明实施例一至实施例三、对比例一至对比例五中固体发酵培养结束后得到的发酵混合物进行甘草素含量的测定，并且计算相应的甘草素转化率，得到的结果如下表1所示。表1甘草素的转化率组别甘草素的转化率实施例一92.3％实施例二91.8％实施例三91.9％对比例一75.3％对比例二41.5％对比例三65.7％对比例四64.9％对比例五38.2％采用本发明提供的将甘草生物转化富集甘草素的方法，甘草素的转化率大大提高，具有很好的经济效益。本发明创新地直接利用甘草固体发酵富集甘草素，没有酸解的污染，也省去用酶水解甘草甙的成本，降低了生产成本，为甘草活性成分的提取提供了新的技术途径；本发明从资源化和生物转化的角度实现甘草的利用，具有显著的社会和环境效益。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。当前第1页12