本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法。
背景技术：
细菌纤维素(bacterialcellulose，bc)主要是由醋酸菌属(acetobacter)、土壤杆菌属(agrobacterium)、根瘤菌属(rhizobium)和八叠球菌属(sarcina)等微生物合成的纤维素的统称。与植物纤维素相比，细菌纤维素具有高持水性、高机械强度、良好的生物相容性、生物可降解性以及生物合成的可控性等优点。作为一种新型的纳米生物材料，其广泛应用于食品、化妆品、生物医学材料、医药、造纸及化工等领域。
细菌纤维素的培养方式分为静态培养和动态培养。动态培养方式所得的细菌纤维素多为絮状、团簇状、球形等形状，直接利用价值较低。静态培养时，细菌纤维素成膜状，其表面平整、结构均匀、机械强度高，直接利用价值高。
目前细菌纤维素发酵菌种扩培的方式主要为动态培养，在培养过程中产生球状的细菌纤维素将菌体包裹于纤维素中，只有极少量的菌体处于培养基中，培养基呈澄清状态。由于菌体包裹于纤维素中，不仅阻碍了氧和营养物质的传递，使菌体难以大量增殖，而且产生的大量纤维素不仅会限制发酵设备种类，而且会影响发酵设备的使用，如使用机械搅拌式发酵罐，纤维素则会缠在搅拌桨和传感器等罐体结构上容易造成发酵罐损坏，若使用气升式发酵罐则会有发酵罐难以清洗、发酵罐管道堵塞等问题。使用含有纤维素球的菌种接种不仅使得发酵周期延长，还会造成静置发酵阶段产生的纤维素膜不均匀等问题。因此菌种难以大量扩培一直是阻碍细菌纤维素大规模工业生产的关键。
中国专利cn106191161a公开了一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法，该方法在种子培养基中添加纤维素酶，使得扩培阶段纤维素包裹的菌种被释放出来，从而使种子液中的菌浓提高。但此方法中纤维素酶不易去除，后续接种过程中会将纤维素酶带入发酵培养基，因此纤维素酶的添加量受到严格限制。若添加量过低，纤维素降解效果不理想；添加量过高，后续发酵生成的细菌纤维素会被部分降解，影响纤维素产量、均匀性、聚合度、结晶度等性质。且该方法仅在种子摇瓶中添加纤维素酶，种子罐中并未添加纤维素酶，纤维素降解程度有限。
固定化酶是指用物理或化学方法将酶束缚或限制于一定区域内，能保持其特有的催化特性，并可回收和重复使用的技术。与游离酶相比，固定化酶解决了酶与反应底物和产物难于分开的问题，并且在反应物再利用的可能性方面有着独特的优势，同时，固定化酶可以提高酶的储存性和对温度、ph等物理因素的稳定性。磁性固定化酶最大的优点在于能够借助外部磁场，对酶进行简单、方便地回收和磁性导向，使酶与底物和产物快速分离。cn107746842a公布了一种磁性纤维素微球固定化酶的制备方法。本发明以纤维素为原料,以氯化锂/n,n-二甲基乙酰胺为溶解体系，在纤维素溶液中混入磁性四氧化三铁纳米粒子，制备磁性纤维素微球，再通过聚电解质的离子吸附等作用固定化酶。cn104560940a公布了一种磁性固定化酶的制备方法。本发明的目的是为了解决游离酶对反应环境敏感、无法回收和生产成本高等问题，故将游离酶固定化在纳米级磁性载体pvp-db-171/sio2/fe3o4。本发明的磁性固定化酶的制备方法，按以下步骤进行：一、制备fe3o4磁性微球；二、制备sio2/fe3o4核壳粒子；三、制备磁性载体pvp-db-171/sio2/fe3o4；四、磁性固定化磷脂酶a1；五、测定固定化酶的活性；六、固定化磷脂酶a1的重复利用次数的研究。
技术实现要素：
本发明是针对现有技术的不足而提出的一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法，此方法将磁性固定化纤维素酶应用于细菌纤维素菌种扩培过程，防止扩培过程中纤维素聚集成团包裹菌体，从而使菌体释放并快速增殖；此方法同时可以解除纤维素团对发酵设备种类的限制，使细菌纤维素菌种扩培过程可在各种发酵设备中进行；磁性固定化纤维素酶在菌种扩培结束时通过外加磁场可轻易去除，扩培的菌液不含纤维素团，菌体分散均匀，后续发酵生成的细菌纤维素也更均匀。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法，通过在木葡萄糖酸醋杆菌菌种扩培阶段向发酵罐中添加磁性固定化纤维素酶来实现；扩培结束后，通过外加磁场将磁性固定化纤维素酶去除。
进一步地，所述磁性固定化纤维素酶的载体为磁性纳米粒子，包括但不限于磁性的金属纳米粒子、金属氧化物纳米粒子中的至少一种。
所述金属纳米粒子优选fe、co、ni中的至少一种。
所述金属氧化物纳米粒子优选co3o4、mn3o4、fe2o3、fe3o4中的至少一种。
所述磁性固定化纤维素酶的粒径优选为30～220nm。
所述磁性固定化纤维素酶的添加量优选为发酵液中浓度10～200u/ml；更优选的浓度为50-150u/ml。
在本发明提供的一种实施方案中，菌种扩培阶段的发酵条件优选为：发酵罐温度为30℃，转速为80-180r/min，通气量0.2-0.8vvm，培养时间12h-48h；培养基组成为(g/l)：葡萄糖25，酵母粉7.5，胰蛋白胨10，磷酸氢二钠10，冰乙酸调ph至6.0，115℃灭菌30min。
在本发明提供的一种实施方案中，以磁性纳米粒子为载体制备磁性固定化纤维素酶方法如下：将磁性纳米粒子加入含有8mg/ml碳化二亚胺的去离子水中，超声分散3min；将混合物于4℃冰箱放置30min，然后加入纤维素酶，超声3min；反应体系于4℃冰箱放置24h，每8h超声3分钟；然后用磁铁将固定化酶沉降，用去离子水冲洗沉淀3次，真空冷冻干燥，于4℃保存；磁性纳米粒子与纤维素酶的质量比10-20:1。
在本发明提供的一种实施方案中，磁性纳米粒子为纳米fe3o4的制备方法如下：在氮气氛围下将摩尔比2:1的fe3+与fe2+溶于去离子水，加入0.5％-1.0％(w/w％)peg4000，剧烈搅拌，向体系中逐滴缓慢加入氨水溶液至ph为11，保持剧烈搅拌40-80℃水浴20-40min，超声分散20-60分钟，然后于80℃熟化1h，然后用磁铁沉降，去离子水清洗沉淀至中性，真空干燥。
在本发明提供的另一种实施方案中，磁性纳米粒子为纳米mn3o4的制备方法如下：将mn(ac)2·4h2o按2％(w/v％)的比例溶于无水乙醇，溶液置于聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜，90-150℃反应24h，反应物冷却至室温后离心收集沉淀，用去离子水和无水乙醇清洗数次，真空干燥。
在本发明提供的另一种实施方案中，磁性纳米粒子为纳米fe粒子的制备方法如下：将油酸在搅拌条件下加入辛醚中，100℃时加入fe(co)5使fe(co)5与油酸的摩尔比为1:3，溶液反应90min后冷却至室温。离心收集沉淀，用无水乙醇清洗数次后真空干燥。
有益效果：
本发明在木葡糖酸醋杆菌菌种扩培阶段向发酵罐中添加磁性固定化纤维素酶，可以使菌体从纤维素球中释放出来，有利于菌体快速增殖，同时防止纤维素丝缠绕发酵罐，添加的磁性固定化纤维素酶在扩培结束可利用磁场快速去除。发酵罐中磁性固定化纤维素酶浓度分别为0、10、100、200u/ml时，扩培结束获得的菌体干重分别为0.37g/l、0.73g/l、1.16g/l、1.03g/l。
附图说明
图1、图2为不添加磁性固定化纤维素酶进行菌种扩培后发酵罐上纤维素缠绕情况。
图3、图4为本发明方法添加磁性固定化纤维素酶进行菌种扩培后发酵罐情况。
具体实施方式
下面结合非限定性实施例对本发明做进一步详细说明。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1：
发酵获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法，具体步骤如下：
(1)配制培养基
菌种活化、菌种扩培所用培养基组成为(g/l)：葡萄糖25，酵母粉7.5，胰蛋白胨10，磷酸氢二钠10，冰乙酸调ph至6.0，115℃灭菌30min。
(2)菌种活化
挑取一环斜面菌种接种至摇瓶培养基中，30℃180r/min活化24h。
(3)菌种扩培
将活化后的菌种接种至发酵罐中，发酵罐温度为30℃，转速为80-180r/min，通气量0.2-0.8vvm，培养时间12h-48h。
(4)菌体量测定
从发酵罐中取40ml发酵液于50ml离心管中，离心收集菌体，用生理盐水洗3遍，60℃烘干测定菌体干重。
如图1-2所示，发酵结束后发酵罐中形成纤维素团，搅拌桨、传感器和通气管等罐体设备上有大量纤维素缠绕，经称重得发酵罐中菌体量为0.37g/l。
实施例2：
一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法，通过在木葡萄糖酸醋杆菌菌种扩培阶段向发酵罐中添加磁性固定化纤维素酶来实现，具体步骤如下：
(1)配制培养基
菌种活化、菌种扩培所用培养基组成为(g/l)：葡萄糖25，酵母粉7.5，胰蛋白胨10，磷酸氢二钠10，冰乙酸调ph至6.0，115℃灭菌30min。
(2)制备纳米fe3o4
在氮气氛围下将摩尔比2:1的fe3+与fe2+溶于去离子水，加入1％peg4000，剧烈搅拌，向体系中逐滴缓慢加入0.3mol/l氨水溶液至ph为11，保持剧烈搅拌50℃水浴30min，超声分散30分钟，然后于80℃熟化1h，然后用磁铁沉降，去离子水清洗沉淀数次至中性，60℃真空干燥4h。
(3)制备磁性固定化纤维素酶
将120mg纳米fe3o4加入5ml含有8mg/ml碳化二亚胺的去离子水中，超声分散3min。将混合物于4℃冰箱放置30min，然后加入8mg纤维素酶，超声3min。反应体系于4℃冰箱放置24h，每8h超声3分钟。然后用磁铁将固定化酶沉降，用去离子水冲洗沉淀3次，真空冷冻干燥，于4℃保存。
(4)菌种活化
挑取一环斜面菌种接种至摇瓶培养基中，30℃180r/min活化24h。
(5)菌种扩培
取磁性固定化纤维素酶用去离子水配成溶液，经0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤除菌后加入发酵罐，使发酵液中纤维素酶浓度为10u/ml；接种活化后菌种，发酵罐温度为30℃，转速为80-180r/min，通气量0.2-0.8vvm，培养时间12h-48h。
(6)磁性固定化纤维素酶的去除
扩培结束后，通过外加磁场将磁性固定化纤维素酶去除，磁场强度为0.1t-10t。
(7)菌体量测定
从发酵罐中取40ml发酵液于50ml离心管中，离心收集菌体，用生理盐水洗3遍，60℃烘干测定菌体干重。
发酵结束后发酵罐中无纤维素团形成，但有一些降解不完全的纤维素丝，经称重得发酵罐中菌体量为0.73g/l。
实施例3：
一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法，通过在木葡萄糖酸醋杆菌菌种扩培阶段向发酵罐中添加磁性固定化纤维素酶来实现，具体步骤如下：
(1)配制培养基
菌种活化、菌种扩培所用培养基组成为(g/l)：葡萄糖25，酵母粉7.5，胰蛋白胨10，磷酸氢二钠10，冰乙酸调ph至6.0，115℃灭菌30min。
(2)制备纳米mn3o4
将mn(ac)2·4h2o按2％的比例溶于无水乙醇，溶液置于聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜，120℃反应24h，反应物冷却至室温后离心收集沉淀，用去离子水和无水乙醇清洗数次，真空干燥。
(3)制备磁性固定化纤维素酶
将150mg纳米mn3o4加入10ml含有8mg/ml碳化二亚胺的去离子水中，超声分散3min。将混合物于4℃冰箱放置30min，然后加入10mg纤维素酶，超声3min。反应体系于4℃冰箱放置24h，每8h超声3分钟。然后用磁铁将固定化酶沉降，用去离子水冲洗沉淀3次，真空冷冻干燥，于4℃保存。
(4)菌种活化
挑取一环斜面菌种接种至摇瓶培养基中，30℃180r/min活化24h。
(5)菌种扩培
取磁性固定化纤维素酶用去离子水配成溶液，经0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤除菌后加入发酵罐，使发酵液中纤维素酶浓度为100u/ml；接种活化后菌种，发酵罐温度为30℃，转速为80-180r/min，通气量0.2-0.8vvm，培养时间12h-48h。
(6)磁性固定化纤维素酶的去除
扩培结束后，通过外加磁场将磁性固定化纤维素酶去除，磁场强度为0.1t-10t。
(7)菌体量测定
从发酵罐中取40ml发酵液于50ml离心管中，离心收集菌体，用生理盐水洗3遍，60℃烘干测定菌体干重。
发酵结束后发酵罐中无纤维素团和纤维素丝，经称重得发酵罐中菌体量为1.16g/l。
实施例4：
一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法，通过在木葡萄糖酸醋杆菌菌种扩培阶段向发酵罐中添加磁性固定化纤维素酶来实现，具体步骤如下：
(1)配制培养基
菌种活化、菌种扩培所用培养基组成为(g/l)：葡萄糖25，酵母粉7.5，胰蛋白胨10，磷酸氢二钠10，冰乙酸调ph至6.0，115℃灭菌30min。
(2)制备纳米fe粒子
油酸在搅拌条件下加入辛醚中，100℃时加入fe(co)5使fe(co)5与油酸的摩尔比为1:3，溶液反应90min后冷却至室温。离心收集沉淀，用无水乙醇清洗数次后真空干燥。
(3)制备磁性固定化纤维素酶
将200mg磁性纳米fe粒子加入10ml含有8mg/ml碳化二亚胺的去离子水中，超声分散3min。将混合物于4℃冰箱放置30min，然后加入15mg纤维素酶，超声3min。反应体系于4℃冰箱放置24h，每8h超声3分钟。然后用磁铁将固定化酶沉降，用去离子水冲洗沉淀3次，真空冷冻干燥，于4℃保存。
(4)菌种活化
挑取一环斜面菌种接种至摇瓶培养基中，30℃180r/min活化24h。
(5)菌种扩培
取磁性固定化纤维素酶用去离子水配成溶液，经0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤除菌后加入发酵罐，使发酵液中纤维素酶浓度为200u/ml；接种活化后菌种，发酵罐温度为30℃，转速为80-180r/min，通气量0.2-0.8vvm，培养时间12h-48h。
(6)磁性固定化纤维素酶的去除
扩培结束后，通过外加磁场将磁性固定化纤维素酶去除，磁场强度为0.1t-10t。
(7)菌体量测定
从发酵罐中取40ml发酵液于50ml离心管中，离心收集菌体，用生理盐水洗3遍，60℃烘干测定菌体干重。
发酵结束后发酵罐中无纤维素团和纤维素丝，经称重得发酵罐中菌体量为1.03g/l。