本发明涉及干细胞分离鉴定技术领域，具体地，涉及一种黑叶猴羊膜干细胞鉴定方法及其应用。
背景技术
干细胞(stemcells,sc)具有多能性和可再生性，是再生组织和器官的潜能性细胞，可以广泛地应用于细胞替代治疗、组织工程医学、生殖医学和药物筛选等多个领域。羊膜是羊膜动物胎盘内层的结构，羊膜腔提供胚胎生长发育的环境。2005年miki等研究发现羊膜干细胞和胚胎干细胞非常相似，不仅表达胚胎干细胞表面抗原，而且还具有全能性。羊膜表面的上皮细胞层起源于外胚层细胞，因此人的羊膜上皮细胞更接近于人胚胎干细胞。羊膜上皮细胞除了表达人胚胎干细胞标志性抗原外，其分化能力也与人胚胎干细胞接近。羊膜干细胞具有低免疫原性和不形成畸胎瘤的特点，因而它在未来的再生医学中比胚胎干细胞更有优势。羊膜干细胞分离简单、容易、廉价，因此，羊膜干细胞也成了兽医学领域再生医学和细胞替代疗法的最重要也是最有前途的细胞来源。
到目前为止，已经成功分离获得动物羊膜干细胞的有绵羊羊膜和羊水干细胞、猪羊水干细胞、马羊水干细胞、水牛羊水干细胞、牛羊膜和羊水干细胞等。如果可以成功分离获得与灵长类更接近动物的羊膜干细胞或者羊水干细胞，对现代兽医学领域或者现代医学领域的细胞来源具有重要意义。
技术实现要素：
针对现有技术的上述不足，本发明提供一种黑叶猴羊膜干细胞分离鉴定方法，以解决上述的现有技术的不足。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种黑叶猴羊膜干细胞分离鉴定方法，包括以下步骤：
s1.物理机械分离；
s2.消化分离；
s3.过滤收集；
s4.传代培养。
优选地，所述物理机械分离步骤s1还包括以下步骤：
(1)在4℃无菌环境下，使用镊子将羊膜上皮层从绒毛膜上机械玻璃下来，置于生理盐水中洗涤3-5次，每次10-30s；生理盐水经过高压灭菌且含有0.2mg/ml异帕米星；
(2)在4℃无菌环境下，使用无菌的接种针剔除羊膜层上残留的血管或者脂肪；
(3)使用含有0.1mg/ml异帕米星的生理盐水洗涤3次，在75％的酒精中浸泡2s，然后用pbs反复清洗；
(4)最后将羊膜剪成大约10cm*2小块，置于无菌条件下冷冻保存备用。
优选地，所述消化分离步骤s2还包括以下步骤:
(1)首次消化，在灭菌的500ml三角瓶中，按每10cm2的羊膜中加入10ml0.2％trypsin-edta或者tryple或者两者的混合液；充分混匀后置于37℃的恒温摇床中进行消化分离；其中1-10min期间，摇床转速为160rpm；11-30min，摇床转速为130rpm；
(2)再次消化，经过首次消化的羊膜转入新的无菌的500ml三角瓶中，按每10cm2的羊膜加入10ml0.1％trypsin-edta或者tryple或者两者的混合液；充分混匀后置于30℃的恒温摇床中进行消化分离；其中1-15min，摇床转速为110rpm；15-30min，摇床转速为80rpm；
优选地，所述过滤收集步骤s3还包括以下步骤：
(1)将消化液收集到50ml的离心管中，使用220μm细胞筛过滤，收集滤清液；
(2)滤清液离心，1-5min1000rpm，然后弃最上面的五分之一滤液；5-10min2000rpm；弃上清；
(3)羊膜干细胞培养液重悬细胞沉淀，既可获得黑叶猴羊膜干细胞。
优选地，所述传代培养步骤s4还包括以下步骤：
(1)将单细胞悬液接种2.5×106个细胞到75cm2培养瓶中，置于38.5℃、5.0％co2、95％饱和湿度的二氧化碳培养箱内培养，24h换液一次，每天观察细胞生长繁殖状况，记录细胞生长情况；
(2)当细胞生长到约90％汇合时，先吸去培养瓶中的培养液，再用0.25％trypsin-edta消化贴壁细胞10min后，用含10％fbs的dmem终止消化；液体1500rpm离心5min，收集细胞沉淀；
(3)部分细胞用于传代培养，培养到第3代后，进行干细胞特性鉴定，或冷冻保存。
通过以上所述的方法分离获得的干细胞在制备细胞替代品中的应用。
以上分离获得的干细胞，冷冻保存和细胞复苏包括以下步骤：
细胞培养结束后，离心后收集细胞沉淀，选择活力旺盛的细胞用10％dmso+90％fbs的细胞冷冻液重悬，转移到1ml冷冻管中，置于异丙醇冷冻盒，-80℃条件下冷冻保存24h，次日转入液氮长期保存。
细胞复苏：冻存管从液氮罐中取出后，室温放置1-2秒，迅速放入37℃温水中，2min左右认真观察发现管内溶液恰好完全溶解后，立即取出，用75％酒精棉球擦拭冻存管口及外壁灭菌后，然后移入准备好的4℃解冻液管中，混匀后1500rpm离心5min，细胞用d-pbs清洗3次，弃去上清液，再加入5ml培养液，制成细胞悬液，移入细胞计数板后，计数活细胞，计算细胞复苏率。细胞置于37℃、5％co2、饱和湿度的co2培养箱内培养。
相对于现有技术，本发明的有益效果：
通过本发明的方法获得的羊膜干细胞，通过trypsin和tryple处理，实验结果显示trypsin和tryple都可以从羊膜上皮层消化分离出羊膜上皮细胞。trypsin消化所获得的细胞比tryple消化所获得的细胞数要多，但是trypsin消化分离的死细胞数量也比tryple消化分离的死细胞也多。
在细胞培养过程中发现，trypsin消化的细胞体外培养首次倍增时间为1.42d比tryple消化的细胞体外培养首次倍增时间1.05d显著延长，但是在传代培养两代以后，trypsin和tryple分离获得的羊膜上皮细胞倍增时间都在1.20d左右，没有明显差异。这说明在羊膜上皮层消化实验中虽然trypsin的消化能力较强，但也会对细胞造成一定的损伤，影响细胞后来的扩增。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种黑叶猴羊膜干细胞分离鉴定方法，包括以下步骤：
s1.物理机械分离；
s2.消化分离；
s3.过滤收集；
s4.传代培养。
优选地，所述物理机械分离步骤s1还包括以下步骤：
(1)在4℃无菌环境下，使用镊子将羊膜上皮层从绒毛膜上机械玻璃下来，置于生理盐水中洗涤3-5次，每次10-30s；生理盐水经过高压灭菌且含有0.2mg/ml异帕米星；
(2)在4℃无菌环境下，使用无菌的接种针剔除羊膜层上残留的血管或者脂肪；
(3)使用含有0.1mg/ml异帕米星的生理盐水洗涤3次，在75％的酒精中浸泡2s，然后用pbs反复清洗；
(4)最后将羊膜剪成大约10cm*2小块，置于无菌条件下冷冻保存备用。
优选地，所述消化分离步骤s2还包括以下步骤:
(1)首次消化，在灭菌的500ml三角瓶中，按每10cm2的羊膜中加入10ml0.2％trypsin-edta或者tryple或者两者的混合液；充分混匀后置于37℃的恒温摇床中进行消化分离；其中第1-10min期间，摇床转速为160rpm；第11-30min，摇床转速为130rpm；
(2)再次消化，经过首次消化的羊膜转入新的无菌的500ml三角瓶中，按每10cm2的羊膜加入10ml0.1％trypsin-edta或者tryple或者两者的混合液；充分混匀后置于30℃的恒温摇床中进行消化分离；其中1-15min，摇床转速为110rpm；15-30min，摇床转速为80rpm；
优选地，所述过滤收集步骤s3还包括以下步骤：
(1)将消化液收集到50ml的离心管中，使用220μm细胞筛过滤，收集滤清液；
(2)滤清液离心，1-5min1000rpm，然后弃最上面的五分之一滤液；5-10min2000rpm；弃上清；
(3)羊膜干细胞培养液重悬细胞沉淀，既可获得黑叶猴羊膜干细胞。
优选地，所述传代培养步骤s4还包括以下步骤：
(1)将单细胞悬液接种2.5×106个细胞到75cm2培养瓶中，置于38.5℃、5.0％co2、95％饱和湿度的二氧化碳培养箱内培养，24h换液一次，每天观察细胞生长繁殖状况，记录细胞生长情况；
(2)当细胞生长到约90％汇合时，先吸去培养瓶中的培养液，再用0.25％trypsin-edta消化贴壁细胞10min后，用含10％fbs的dmem终止消化；液体1500rpm离心5min，收集细胞沉淀；
(3)部分细胞用于传代培养，培养到第3代后，进行干细胞特性鉴定，或冷冻保存。
实施例2黑叶猴羊膜细胞活力的测定
通过实施例1的方法鉴定得到羊膜干细胞，为了考察该方法分离鉴定的羊膜干细胞活性，对其羊膜细胞活力的进行测定。细胞活力是指活细胞所占总细胞的百分比，可以看出在细胞群体中死亡细胞的情况。用来了解分离过程对细胞是否有损伤作用，或了解冻存和复苏的效果。本实验采用台盼蓝法来测定细胞活力，死细胞会着色，活细胞不着色。本实验分别采用trypsin和tryple消化羊膜上皮层分离获得了羊膜上皮细胞。在实验过程中，通过取3组实验所得到的每克羊膜组织消化后获得细胞数求平均值的办法来确定每克羊膜组织消化后获得的细胞数；
通过取3组消化实验所获得的细胞活力求平均值的办法来确定细胞活力。将trypsin-edta或是tryple消化所得的羊膜细胞重悬于已知体积的培养液，吸取1×104个细胞，以1:1与0.4％台盼蓝溶液充分混匀。2分钟内吸取少许悬液置于血球计数板上进行观察。在显微镜下一个视野中分别计数4个大方格内染成淡蓝色的细胞数和未着色的细胞数和细胞总数。数完总细胞数后，在相同区域重复计数，只数染蓝的(死)细胞。计数要在3分钟内完成。
细胞活力(％)＝(细胞总数-死细胞数)/细胞总数*100％
实验结果显示trypsin和tryple都可以从羊膜上皮层消化分离出羊膜上皮细胞。trypsin消化所获得的细胞比tryple消化所获得的细胞数要多，但是trypsin消化分离的死细胞数量也比tryple消化分离的死细胞也多。
实施例3细胞倍增时间测定
羊膜上皮细胞倍增时间的测定细胞群体倍增(cellpopulationdoubling，pd)时间是指细胞在培养条件下生长时其数目倍增所需的时间。细胞群体倍增时间可以用来评价细胞的增殖能力，倍增时间短说明细胞扩增能力强，反之时间长说明细胞增殖能力弱。细胞倍增时间p0代是从接种后计数到细胞生长达到90％汇合度的时间。细胞生长期倍增时间(culturetime，ct)是p0代细胞冷冻后，解冻的p1开始计数。接种9×103个细胞到6孔培养板进行培养，96h后用tryple消化后在显微镜下计数，传代后再计数，共计数3代。细胞倍增曲线(cellmultiplicationcurve，cmc)测定时，每次重复计数3孔，取平均值，用每天观察到的细胞绝对数与起始细胞数的比值可以绘制细胞倍增曲线图。
在细胞培养过程中发现，trypsin消化的细胞体外培养首次倍增时间为1.42d比tryple消化的细胞体外培养首次倍增时间1.05d显著延长，但是在传代培养两代以后，trypsin和tryple分离获得的羊膜上皮细胞倍增时间都在1.20d左右，没有明显差异。这说明在羊膜上皮层消化实验中虽然trypsin的消化能力较强，但也会对细胞造成一定的损伤，影响细胞后来的扩增。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。