本发明公开了一种多肽，更为具体地，本发明公开了一种双特异性多肽。
背景技术：
胰腺癌(pc)是一种最致命的癌症，其5年生存率约为7％，其中一个重要的原因是大多数(超过85％)的患者被诊断为晚期疾病，预后较差。胰腺导管腺癌(pdac)占pc病理类型的绝大多数，其是由胰腺癌前病变逐渐演变为胰腺肿瘤。早期pdac的成功诊断和切除，包括胰腺上皮内瘤变(panin)，可导致4年生存率高达78％。因此，早期诊断pdac可导致更好的预后和改善患者护理。
分子影像学的基本成像原理是将制备好的分子探针引入活体组织细胞中，使标记的分子探针与靶分子相互作用，再利用合适的成像系统检测出分子探针发出的信息，经计算机处理后生成活体组织的分子图像或功能代谢图像，目前主要应用于肿瘤、心血管和神经系统疾病等方面。活体内分子成像最关键的是成像靶点的选择及适宜的成像技术，即高特异性的分子探针和高敏感性的探测技术。活体内的分子成像必须满足以下条件：高特异性、高灵敏度、生物学屏障可通透性、生物信号可放大性。
近年来，分子影像的出现为胰腺癌的早期诊断找到了新的突破点，给早期诊断pdac，甚至是来自没有明显症状的个体的癌前病变提供了机会。此外，分子成像结合当前成像系统与结合亲和力，可以针对在症状出现前几年出现的疾病特异性分子生物标志物。因此，对于具有pdac早期诊断能力、监测治疗和精准手术实时指导的分子显像剂是非常有临床前景的。目前用于分子影像的技术主要包括核医学成像(pet、spect)、磁共振成像(magneticresonanceimaging，mri)、光学成像以及超声成像等。
在分子影像技术的应用中选择与肿瘤相关性高的靶点是保证诊断特异性的关键所在。既往研究报道的胰腺癌相关的传统高表达靶向胰腺癌的细胞膜表面受体、细胞因子有表皮生长因子受体(egfr)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(upar)、癌胚抗原细胞粘附分子(ceacam)，血管内皮生长因子受体(vegfr)，以及最新胰腺癌机制研究发现的胰腺癌靶点，新型生物标记物网格蛋白plectin-1等。
pdac的特点之一是其存在一种致密的纤维质基质、低血管和低灌注的肿瘤血管，缺乏实体瘤的高通透性和滞留效应(enhancedpermeabilityandretentioneffect)，即epr效应，并且肿瘤内的间质流体压力增加，使大多数纳米颗粒的输送不起作用。最近对过去10年文献的分析表明，被递送到致密的pdac中的纳米颗粒剂量不超过0.4％，远低于所有类型癌症的0.7％(中值)。基于小分子多肽具有的优良生物相容性，以及考虑到体内的长期安全性和临床转化前景，小分子多肽影像示踪剂可能更适合于pdac诊断。在各种成像方式中，磁共振成像(mri)被广泛应用于能够提供高软组织对比度的独立成像的诊所。近红外荧光成像(nirf)可以实时显示全身的药代动力学和生物分布，具有高灵敏度和高特异性，在手术导航的应用中，nirf分子探针具有高度特异性。但nirf分子探针空间分辨率低，组织穿透能力差。
plectin1是一种传统的支架细胞骨架蛋白，其几乎存在于所有哺乳动物组织和细胞类型中，尤其是在抗机械压力大的组织中含量丰富。正常生理状态下，plectin1通常仅在细胞质中表达，而在细胞膜上不表达。但是如果组织发生癌变，plectin1的细胞定位发生变化，可同时存在于细胞质和细胞膜上。在鼠和人类的pdac细胞中发现plectin1的存在。由于plectin1在胰腺癌上皮细胞表面有特异的异常定位，其引起了研发人员相当大的兴趣。2008年，利用基因小鼠pdac模型以及噬菌体展示库技术筛选出一段功能性短肽含有7个氨基酸(ktllptp)的靶向肽ptp，可以特异性靶向胰腺癌。经蛋白组学分析，靶向肽ptp是通过与胰腺癌发生时误定位在细胞膜表面上的plectin-1特异性结合实现靶向作用的。
然而，胰腺癌在遗传上是非常复杂的，肿瘤的质量是由患者的63个基因改变和12个核心信号通路的异常引起的，在不同癌症患者的肿瘤生物标志物表达中存在异质性。因此，有效的靶向可能需要同时使用组合方案来攻击多个目标。
整合素是一种参与肿瘤发生和肿瘤进展的细胞粘附分子，也是检测pdac的有效靶标或生物标志物。整合素β4(itgb4)作为整合蛋白家族之一，已经证明其在pdac中plectin定位发生变化扮演不可缺少的角色。此外，在pdac增长、入侵和迁移的过程中plectin和整合素β4直接相互协同作用，扮演同样重要的角色。大多数整合素最常见的配体识别位点为rgd短肽序列(arg-gly-asp)。rgd短肽介导整合素与ecm组分的黏附，β亚基则通过胞内段与细胞骨架相连，形成ecm-整合素-细胞骨架跨膜复合体。细胞外信号通过该复合体传导至细胞骨架蛋白，诱导细胞骨架重构，引起细胞变形和移动，影响细胞的生存、生长、增殖、分化、侵袭、迁移等生物学行为。
本发明的目的就是提供一种能够克服现有技术存在的不足，针对胰腺癌肿瘤细胞具有双特异性的双特异性小分子探针，进而提供其在分子影像技术中的应。更具体地说，本发明就是要利用分子影像mri和近红外荧光双模态成像方法，准确地发现早期微小胰腺癌；并且力求通过双靶点靶向效果叠加克服胰腺癌的高度异质性，改善单一靶点靶向能力有限的特点，提高检出早期微小胰腺癌的敏感度，以期达到mri及荧光双模态检出微小胰腺癌灶的目标。
技术实现要素：
基于上述发明目的，发明人通过对传统胰腺癌靶点蛋白、亲和性载体的优选的多方面的考虑，将plectin-1和整合素β4作为协同双特异性靶点加以深入研究。基于研究结果，本发明首先提供了一种靶向胰腺癌肿瘤细胞的双特异性多肽分子探针，所述分子探针的结构式如式(i)所示：
其中，x、y为可选择的氨基酸，x选自赖氨酸、半胱氨酸、天门冬氨酸，y选自苯丙氨酸或酪氨酸，其中a位点氨基酸残基和/或b位点氨基酸残基标记一种用于分子影像的显像分子，c位点氨基酸残基标记另一种用于分子影像的显像分子。
在一个优选的实施方案中，所述x为赖氨酸，所述y为苯丙氨酸。
在一个优选的实施方案中，所述a位点氨基酸残基和b位点氨基酸残基均标记dota@gd(iii)，c位点氨基酸残基标记cy7，所述分子探针的结构式如式(ii)所示：
优选地，cy7与所述多肽以1:1的摩尔比相连。
其次，本发明还提供了上述的分子探针在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
在一个优选的实施方案中，所述探针被制备为注射剂。
最后，本发明还提供了制备上述探针的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)合成分子探针的主肽链lys-thr-leu-leu-pro-thr-pro-lys-lys-lys；
(2)将主肽链上第8位的lys去保护，以此为起点合成副肽链arg-gly-asp-phe；
(3)将步骤(2)获得的肽链与cyanine7单琥珀酸酯偶联；
(4)将步骤(3)获得的肽链与dota(tbu)3-酯共轭；
(5)将步骤(4)获得的肽链与钆化合物鳌合；
(6)收获步骤(5)获得的产物。
在一个优选的实施方案中，步骤(3)所述的偶联所使用的偶联剂为3:10的hatu:diea(n-四甲基脲六氟磷酸酯:n,n-二异丙基乙胺)，所述肽链与cyanine7单琥珀酸酯的反应比例为重量比3:1。
在另一个优选的实施方案中，，步骤(4)所述的共轭是由受三个tbu保护的dota-nhs酯以一个活化的羧基与水合肼去保护的主肽链中第9位和第10位的赖氨酸共轭。
在又一个优选的实施方案中，，步骤(5)所述的钆化合物为gd氯化六水合物，所述肽链与钆化合物鳌合的重量比为4:1。
本发明将ptp和rgd联合使用，提供一种双特异性多肽，提高了胰腺癌检出的特异性。其中，ptp靶向在胰腺癌导管上皮细胞表面过度表达的蛋白plectin；rgd作为广泛靶向整合素家族的配体肽，不但可以靶向整合素3这种肿瘤新生血管高表达的蛋白，也可以靶向与plectin表达相互作用的整合素4。这样的双特异靶向性不但提高了ptp和rgd联合后，靶向胰腺癌的特异性(plectin1和整合素4)，而且，通过同时靶向胰腺癌导管上皮细胞和胰腺癌间质内的新生血管，提高了检出恶性组织的敏感度。
本发明利用多肽固相化学合成方法，制备标记dota@gd和cy7的双特异性靶向肽[dota@gd(iii)]2/cy7-ptp/rgd，分别将两种肽(ptp/rgd)标记为plectin/integrin靶向，用于mri/nirf双模成像和手术导航。通过双特异性靶向肽提高与胰腺癌肿瘤组织的结合能力，以及mri表现的高灵敏度、高特异性和实时nirf成像，达到肿瘤靶向mri/荧光双模态成像目的，能够进行小鼠的全身肿瘤定位。
更具体地，本发明通过小分子环型鳌合钆剂(dota@gd)代替原有的纳米材料设计。力求通过大分子成像组件的设计，提高胰腺癌mri分子成像的敏感度。
本发明提供了双特异性双肽dota@gd/cy7的mri/nirf双模剂，并评估了双特异性探针的特性，体内体外毒性，细胞水平上对胰腺癌的结合靶点。通过共焦成像技术证明了双特异性靶向的高结合亲和性，并对胰腺癌小鼠模型的分子成像和光学指导进行了验证。分子成像的双肽dota@gd/cy7在pdac肿瘤和长期周期中提供了显著的t1加权信号。双肽dota@gd/cy7成功应用于nirf图像引导切除肿瘤病变。用cfl显像“体内组织病理学”和“体外荧光染色”验证双肽与pdac的结合机制。通过实验，双特异性小分子探针成功地提高了荧光和磁共振成像的信号强度，增强了pdac的特异性。综上所述，双肽dota@gd/cy7是一种很有前景的药物，其可以直接攻击特异性表达plectin-1和itgb4的恶性肿瘤，特别是pdac。
附图说明
图1a.双特异性分子探针高效液相色谱分析图；
图1b.双特异性分子探针质谱分析图；
图2a.双特异性分子探针与游离cy7紫外吸收光谱分析图；
图2b.双特异性分子探针荧光强度和紫外吸收时间曲线图；
图2c.双特异性分子探针荧光强度与游离cy7浓度变化曲线图；
图2d.双特异分子探针与不同浓度gd(iii)结合后t1弛豫率变化曲线图；
图3.双特异分子探针对人胰腺癌细胞plectin-1和itgb4表达量的检测
图4.标记fitc的双肽对pc细胞的亲和力检测结果图谱；
图5.双肽和单肽对pc细胞的亲和力比较的细胞荧光图谱；
图6.双特异分子探针在pc肿瘤内的靶向分布机制图谱
图7.双特异分子探针在体内光学代谢分布以及mri成像、gd定量图谱；
图8.双特异分子探针nir引导下手术导航及组织学评价图谱
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1制备实施例
1.主链肽合成(l1)
通过标准的固相多肽合成法合成主要的肽配体(l1)，并将受fmoc(9-芴甲氧羰基)保护的氨基酸用2-氯三氯乙烯树脂(15ml/g，摇床均匀摇30min，在一个隔离柱中溶解于dcm)合成。fmoc-lys(dde)-oh(0.53g,1.0mmol)在dmf(13ml)中溶解，在树脂上与悬浮液搅拌60分钟，用dcm清洗树脂，用甲醇进一步搅拌30min，以消除树脂中残留的氯化物。fmoc保护端在dmf中被洗脱了25％的piperidine，三次。这一过程从c端到n端重复了如下:fmoc-lys(dde)-oh,fmoc-lys(alloc)-oh,fmoc-pro-oh,fmoc-thr(tbu)-oh,fmoc-leu-oh,fmoc-leu-oh,fmoc-thr(tbu)-oh,fmoc-lys(boc)-oh。对树脂的试验成功固定了每一种氨基酸。在每个反应周期之后，对树脂进行彻底清洗，以进行后续处理。
合成后的主链肽的氨基酸序列为：
boc-lys(boc)-thr(tbu)-leu-leu-pro-thr(tbu)-pro-lys(alloc)-
lys(dde)-lys(dde)-resin。
2.侧链肽合成(l2)
合成了主要的肽配体(l1)即主肽链后，用钯(pd)和三苯基膦(pph3)消除l1上第8位的lys(alloc)上的烯丙基保护(pph3)，从而暴露了结合位点。此后，fmoc标准的固相多肽合成在以下序列中重复进行:
fmoc-arg(pbf)-oh,fmoc-gly-oh,fmoc-asp(otbu)-oh,fmoc-phe-oh
合成后的主链和副链的氨基酸序列为：
boc-lys(boc)-thr(tbu)-leu-leu-pro-thr(tbu)-pro-lys
【arg(pbf)-gly-asp(otbu)-phe】-lys(dde)-lys(dde)-resin
3.多肽配体和cyanine7单琥珀酸酯(cy7-nhs)偶联(l3)
用标准固相肽化学合成肽配体，如上所述。在偶联剂(hatu:diea,3:10)的作用下，在树脂中加入了cyanine7单胞苷酸酯(5mg)，并结合在树脂上的肽配体的侧链上(15mg)。
4.合成[dota(tbu)3-酯]和l3共轭(l4)
[dota(tbu)3-酯]是通过多步骤合成制备的，该程序以大环多胺盐酸盐(cyclenhydrochloricsalt)开始。三个tbu保护基与dota-nhs酯连接以保持一个活化的羧基与l4配体上由水合肼去保护的赖氨酸反应(dde-deprotectedlys)。
l4配体合成后，使用铊(iii)三氟醋酸盐(1.03克,2.5mmol)在dmf(10毫升)0℃的环境下反应2h将位于肽复合物上的所有保护基团全部去除，并使用dmf彻底清洗。将肽复合物是从树脂中切出来的。过滤后的溶液与冷乙醚(100ml)混合。通过离心分离得到粗产品，并被清洗获得l4(16.45mg,34.27％)，使用ms定性[m/z[m+h]+):2934.56(obsd.)，2933.18(calcd.)]。
5.l4与钆化合物鳌合制备(l5)
配体l5(20.4mg,6.4umol)溶解于脱矿质水(5ml)。0.25％nh4oh加入水溶液中ph值调整为6.4-6.9。随后,5.0mg的gd氯化六水合物(13.45μmol)添加在1.0毫升的水(20.4mg的配体l5与5.0mg的gd氯化六水合物的重量比约为4:1)。该混合物在室温下搅拌过夜。混合溶液用透析袋(分子切断，1000da)纯化，然后在黑暗中浓缩和冻干。通过ms(m/z[m+h]+):3676.97(obsd.)，3676.58(calcd.)]获得了一种粗品(13.94mg,28.46％)。最后以蓝色冻干粉(22.18mg，收率95.3％)，从而获得高纯度的双靶向探针。
6.体外表征
采用固相反应合成双肽dota@gd/cy7(abbr，[dota@gd(iii)]2/cy7-ptp/rgd)。分析高效液相色谱法(图1a)和质谱法(图1b)均证实了其成功的合成。首次合成无螯合gd(iii)的合成产物，证实分子量为2933.18，纯度为99.33％。然后，将gd(iii)按1:3的摩尔比例螯合到dota中。与gd(iii)结合后的最终产物是分子量为3676.94，合成材料纯度为95.38％。另外，dota@gd(iii)也是通过类似的方法合成的。
利用紫外可见分光光度计(uv-2450,shimadzu,japan)分析双特异性分子探针与游离cy7的吸收光谱。由cy7nhs酯标记的双特异性探针在748nm处产生了特征峰，类似于紫外吸收光谱分析的游离cy7的吸收波形(图2a)。双特异性探针的紫外吸收在与cy7结合后的变化可以忽略，这意味着cy7在固相合成中以1:1的摩尔比的条件，在lysin的侧链上与lysin的侧链相连是有效且稳定的。
利用荧光光谱法(f-7000；日立)检测双特异性分子探针48h荧光激发和发射光谱以及紫外线吸光度的变化，以评估双特异探针在含有等量的胎牛血清(fbs)和磷酸盐缓冲盐水(pbs)的混合溶液中的血清稳定性。如图2b所示，50％fbs/pbs混合物的荧光强度和紫外吸收仅在48小时内略有下降，显示双特异探针具有较好的血清稳定性。
如图2c所示，对双特异分子探针的荧光强度变化与不同的cy7浓度发生变化的相关性进行评价。结果显示，荧光强度与游离cy7浓度呈正相关。随着cy7浓度的增加，双特异性探针的荧光强度增强，但当cy7浓度达到20.4ug/ml时，其荧光强度降低，这意味着荧光聚集猝灭效果由双肽dota@gd/cy7组成，类似于freecy7。
采用电感耦合等离子体光发射光谱仪(icp-oes，江苏天光仪器有限公司)测量gd(iii)含量。探测器的弛豫时间(t1)是用7tmr(brukerbiospec70/20，德国)扫描仪测量的(中国国家纳米科学技术中心)。
图2d显示了双特异分子探针与不同浓度gd(iii)结合后的t1弛豫率变化(7.0-tmri)。实验结果表明，在室温下，双肽dota@gd/cy7每分子的t1弛缓率为6.88mm-1s-1，而dota@gd/cy7的t1弛缓率为3.57mm-1s-1。这意味着双特异性探针具有比dota@gd更显著的t1弛豫率。这一结果可能与多肽复杂、复杂的空间结构有关，影响了周围水分子的核角旋进频率。因此，对双肽dota@gd/cy7的体外表征结果表明，探针荧光性能和紫外特性未受共轭特异性靶向元素的影响，与dota@gd相比，其t1弛豫能力得到了极大的改善。
7.双特异性分子探针的生物安全性评价
对于生物医学应用而言，探针毒性试验是一个重要的前提条件。因此需要先对双特异性多肽分子探针dota@gd/cy7及其游离单体对正常和pc细胞的细胞毒性进行评价。将panc1(pc细胞,itgb4和plectin-1双过度),t3m4(pc细胞,温和表达)和hdpe6-c7(正常人类胰腺导管细胞,很少表达),与双特异性多肽分子探针dota@gd/cy7dota@gd和cy7(浓度是0,30、60、90、120、150ug/ml)孵化48h，进行mtt比色(细胞增殖和细胞毒性试验设备)测试。从panc1和t3m4细胞中可以观察到，在探针浓度高达90ug/ml的情况下，在体外和体内实验中，显示出了显著的细胞毒性。在hpde6-c7细胞中，即使在浓度高达150ug/ml的情况下，也没有明显的细胞毒性。所有细胞株在测试浓度下保持86％的存活率。另外，在体内注射双特异性多肽dota@gd/cy7(浓度为60ug/ml)的健康小鼠进行体内毒性实验。图6所示的组织病理学证实了体内的毒性，表明在主要器官中，包括肝、脾、肾、胰腺和肌肉中，并无明显的急性炎症(24小时静脉注射后)和慢性炎症反应(30天内注射后)。体外和体内的探针毒性实验结果表明，双特异性多肽dota@gd/cy7在测试剂量上是稳定和安全的。
实施例2.双特异性分子探针对人胰腺癌细胞中plectin-1和itgb4的检测
1.westernblotting检测
通过westernblotting检测plectin-1和itgb4的表达水平。六个胰腺癌细胞收获指数阶段和细胞溶解1×pbs，1％诺乃清洁剂p40，2μg/ml抑肽酶，50μg/毫升phenylmethylsulfonyl氟化物(pmsf)。细胞溶解产物离心机在4℃12000×g30分钟。从上层清液中提取总蛋白，然后使用皮尔斯bca量化分析工具。利用半干吸水系统(biorad)将十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳sds-page(10％的溶解凝胶)和电吸液涂在聚二氟乙烯(pvdf)膜上，分离出每个细胞系的蛋白质。膜被1×pbst缓冲液孵育30分钟，使抗体抗原特异性结合及anti-mouse或anti-rabbit二级抗体结合辣根过氧化物酶。使用las4000(gehealthcarelifesciences)检测到化学发光信号。
对人类胰腺癌细胞aspc1、bxpc3、panc1、sw1990、capan2和t3m4系中的plectin1和itgb4的相对表达进行评价。actin(肌肉蛋白)和gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为westernblotting相对丰度的表达对照。在这些胰腺癌细胞系中，plectin-1的表达非常高。而itgb4在大多数胰腺癌细胞系中被过度表达。如图3所示，在panc1细胞中，plectin-1和itgb4的双重过表达，因此在体外和体内实验中选择使用panc1细胞作为阳性细胞。从理论上讲,这也意味着双特异性多肽dota@gd/cy7(ptp/rgd)能够与体外或者体内的panc1肿瘤细胞生长模型高度结合。
2.双特异性分子探针检测
人胰腺癌细胞(panc1)从atcc购买，正常的人胰管上皮细胞系(hpde6-c7)从cobioer有限公司购买，用d-荧光素通过稳定的转染标记。在加入10u/毫升青霉素、链霉素10μg/毫升、和10％的fbs的dmem培养基中培养panc1、hpde6-c7细胞。在补充了10u/毫升青霉素、链霉素10μg/毫升、和15％的牛血清蛋白的rpmi1640培养基中培养bxpc3、capan2、sw1990、t3m4细胞。在完整的培养基中和5％二氧化碳培养箱在37℃和95％湿度(heracell,德国)条件下培养所有细胞。细胞状态和计数使用countessc10227(invitrogen)进行评估。上述所有细胞株均满足细胞活性的要求。细胞增殖和细胞毒性评估使用mts试验(美国wipromega)。将panc1、t3m4hpde6-c7细胞接种于96-孔板，密度为每孔104细胞/100μl培养基培养24h。此后，使用含有6种不同浓度探针(0-200μg/ml)的等体积新鲜培养基进行培养基置换，培养24h后使用pbs洗细胞三次，然后将100毫升培养基和mts(20μl)混合添加到每个孔内。利用synergyht微板阅读器(biotek,usa)测量490nm的吸光度，评估细胞存活率。
panc1和hpde6-c7细胞被铺置在四个6孔板内，每孔密度104个细胞，在培养基中孵化24小时。此后，使用包含六种浓度(0-2.0μg/ml)的fitc-标记的双特异性肽的新鲜培养基进行培养基置换，孵化4h。使用pbs三次洗涤后，用edta消化细胞后离心机100g×3分钟。使用bdaccuric6评价样本，使用flowjo7.6软件分析流式细胞仪数据。
采用共聚焦显微镜和流式细胞仪测定panc1细胞和hpde6-c7细胞与双特异性肽(ptp和rgd)在体外的亲和力。首先，105个细胞被接种到共聚焦小皿(d35-10-1-n，35毫米盘)在37℃二氧化碳孵化器中孵育24小时，然后用多聚甲醛固定。在pbs冲洗三次后，细胞在黑暗中与alexflour488标记的ptp和alexflour647标记的rgd(肽/染料摩尔比，1/1.5)在室温下进行4小时的培养。此后，细胞细胞核以dapi标记5分钟。基于封闭的目的，细胞被预孵育，1毫升(20μg/ml)抗-plectin-1单抗，抗-integrin-4单抗阻断4小时。利用图像imagej软件对靶向的共定位靶点进行分析，并绘制了彩色图像。第二，上述方法用于panc1和hpde6-c7细胞。用50nmfitc标记的双特异性肽对细胞进行固定和孵育4小时，为了阻断试验，抗plectin-1单抗，抗itgb4单抗，或两种抗体均与panc1细胞孵育2h,hpde6-c7细胞作为阴性对照，直接与fitc标记的双特异性肽一起孵育。oillenpe荧光共焦显微镜(peultraview)用于细胞成像，imagej2x软件确定荧光强度。
在明确体外和体内双特异性探针的安全性后，通过荧光显微镜和流式细胞术对探针与细胞靶点亲和力进行评价。首先评价单靶向肽与panc1细胞过表达靶点的亲和力。af647(alexafluor647)标记的rgd和af488(alexafluor488)标记的ptp与panc1细胞共同培养，用imagej定量分析平均荧光强度。与用plectin-1/itgb4单克隆抗体预先培养4小时的阻断对照相比，af647标记的rgd和af488标记的ptp均显示细胞核外具有更强的荧光强度，两者的荧光强度具有显著性差异。在af647标记的rgd和af488标记的ptp组中，通过单阻断可以观察到有意义的荧光差异，这在双阻断组中更明显。因此，单靶向肽对panc1细胞具有良好的结合亲和力。进一步联合应用两种单肽，发现结合到panc1细胞上的单肽更多，荧光强度更强。结果显示，单肽(ptp/rgd)可以很好地同时共定位于panc1细胞中。
其次，为了测试标记fitc的双靶向肽对pc细胞的高亲和力，在panc1细胞(plectin-1/itgb4过表达)和hpde6-c7细胞(很少表达)中进行荧光显微成像和流式细胞术定性和定量评价双靶向肽与靶点的结合。实验分组为标记fitc的双靶向肽与panc1细胞(阳性细胞)孵育，hpde6-c7细胞(阴性细胞)与双特异性探针孵育为阴性对照，游离的fitc均作为非特异性对照。如图4a和4b所示，用标记fitc的双靶向肽与panc1细胞孵育显示出较强的荧光强度，表明标记fitc的双靶向肽对panc1细胞比对hpde6-c7细胞具有更高的目标亲和力。
流式细胞术的结果与共焦成像结果相一致。图4c和4d显示，随着双肽标记物浓度的增加，可见荧光变化明显，探头的荧光强度显著增加。在图4e中，panc1细胞的平均荧光强度明显高于hpde6-c7细胞。用荧光流式细胞仪测定了双靶向肽对panc1细胞和hpde6-c7细胞的亲和力。然而，在hpde6-c7细胞或freefitc组中均未观察到荧光强度的明显变化。在图4f和g显示流式细胞术的定量,fitc浓度增加,双肽标记fitc的荧光信号强度可达到9.125×104(近饱和的2.0ug/毫升fitc)。然而,panc1细胞与游离的fitc孵化的荧光信号强度不超过2×104。而hpde6-c7细胞，因为缺乏ptp和rgd肽的结合位点，其fitc标记的双肽的荧光强度相对较低，不超过1.2×104。因此，共聚焦成像和流式细胞术证明，双特异性探针可以有效地与体外panc1细胞结合，这取决于panc1细胞中plectin-1和itgb4的过表达。也就是说，双特异性探针，有效地瞄准了plectin-1和itgb4，导致了更有效的对panc1细胞和的结合亲和力。
最后，本发明对双靶向肽和单肽靶向进行了比较试验，验证了双靶向肽的协同效应。如图5a所示，标记fitc的双靶向肽与多个阻断对照(在细胞染色前，用抗plectin-1、抗itgb4或两种抗体的饱和剂量将panc1细胞靶点有效阻断)相比，对panc1细胞的免疫荧光染色明显增强。因此，ptp和rgd结合后对pdac的靶向效果有明显的增强和放大，两者的组合设计产生了显著的协同效应。
综上所述，共焦影像学和流式细胞仪数据显示，与多个阻断对照相比，双肽(ptp/rgd)被标记fitc时，其荧光强度明显增强。这些结果表明，双特异性ptp/rgd多肽具有靶向性和特异性高的靶细胞的能力。在体外实验中，双特异性ptp/rgd多肽显示出高度的亲和性和特异性。
实施例3.双特异性分子探针用于动物肿瘤模型nirf和mri成像
1.动物模型的建立
动物实验程序经中国医学科学院肿瘤医院动物伦理委员会批准[ncc2016a002]。在整个研究过程中，确保严格遵守动物护理和使用规程。该肿瘤模型是自北京维通利华实验室动物技术有限公司(中国)购买的6周的雌性balb/c裸鼠建立的。以过表达plectin-1和itgb4蛋白的panc1细胞建立皮下和原位肿瘤模型，以评估双特异性探针的特异性。通过大量植入和细胞注射方法，将panc1细胞植入balb/c裸鼠体内。共有106个细胞被注入左腋窝的皮肤皱褶，以形成皮下肿瘤模型。此外，当皮下肿瘤直径为10mm时，肿瘤肿块被剥离并切成1mm3块。用无菌盐水冲洗三次后，在正常胰腺组织的表面上均匀地嵌入新鲜横切的肿瘤肿块与组织密封胶。与细胞植入相比，肿瘤块嵌入方法可以减少胰腺的可检测渗漏，并缩短肿瘤周期。对肿瘤生长进行监测，约3周后获得一个明显的肿瘤和直径6-8毫米的体内原位肿瘤。
2.体内荧光成像和生物分布
利用小型动物光学分子成像系统(ivisimagingspectrumsystem,usa)监测荧光成像和生物学分布。为了揭示双特异性探针在体内靶向肿瘤和主要代谢器官内潜在的和动态生物学分布，24只荷panc1肿瘤小鼠被分为4组(每组6只)。靶向探针和游离染料通过尾静脉注射。对于阻断组，两小时前经鼠尾静脉注射小鼠抗人plectin-1和itgb4单克隆抗体以阻断其特异性结合位点。
在注射后48小时内进行荧光分子成像(fmi)。在小鼠左侧卧位获得皮下图像，以评估肿瘤的代谢。相关区域(roi)分析用于测定肿瘤内的探针选择性的积累，将肿瘤以及包括脑、肺、肝、脾、胰、肾、肠等在内的主要器官(包括)解剖以评价荧光信号强度。切除肿瘤并用oct凝胶固定进行病理分析。冻结部分(20μm厚)暴露在白光和近红外光谱与徕卡cm1950机(800nm)。然后，用自动倒置荧光显微镜观察冷冻切片，确定nir波段。
3.纤维共焦荧光显微镜成像
麻醉后，对原位荷瘤胰腺癌小鼠尾静脉注射100μl非特异性fitc(浓度,1毫克/毫升)，以对胰腺肿瘤和正常胰腺组织血管造影进行形态分析。此后，其他荷瘤小鼠相继注射af488标记的rgd和af647标记的ptp。腹部正中线2厘米切口。注射后3小时，胰腺肿瘤和腹膜区充分暴露。使用纤维双频共焦荧光显微镜系统(fcfm)s1500型
4.体内nirf成像
通过非侵入性nirf和mri成像技术，探讨双肽dota@gd/cy7的肿瘤靶向性特征，及在体内的双特异性靶向和生物学分布。用双肽dota@gd/cy7(150ul/mouse,400ug/ml探针)静脉注射小鼠皮下肿瘤。用荧光成像技术观察双肽dota@gd/cy7在小鼠体内的生物分布。
注射双肽dota@gd/cy7的小鼠nirf成像，分组为双特异探针组，plectin-1mab阻断组，itgb4mab阻断组和游离cy7组。在注射后30分钟，可见双特异探针组肿瘤区域和tbr(肿瘤背景比)明显改变。肿瘤的荧光强度在4h后逐渐升高，tbr达到9.46，达到最大值，表明双特异探针持续累积到肿瘤区域。在24小时后肿瘤内的荧光信号仍保持较高的强度，但游离cy7组的荧光信号在尾静脉注射后的8小时就无法获得,这表明双特异性探针与游离染料相比，在pc肿瘤内有更好的滞留时间和更高的滞留能力。plectin-1和itgb4单独阻断与游离cy7相比，保持较强的荧光强度和较长周期，但与双特异目标探针相比，荧光低，时间短。这提示双特异性探针亲和力比单靶点和游离cy7更突出。
对于高效的分子成像，良好的tbr和长循环时间是必要的。良好的tbr不仅依赖于高肿瘤，也依赖于低背景，这正是靶向探针为pdac选择小分子探针的原因。在代谢特性方面，小分子探针具有无可比拟的优势。它不仅利用了简单的渗透性，而且利用了epr效应，并以小分子量和粒径尺寸为基础，便于排泄。易渗透性和epr效应均有助于高探针浓度和肿瘤部位良好的荧光强度。另一方面，由于小分子大小和靶向肽没有免疫原性，小分子探针可以很容易地脱离res(网状内皮系统)监测，使肝脏和脾脏对背景噪声的吸收减少，并增加了肾排泄功能相关的摄取。
5.体内mri成像及gd定量
使用7.0t磁共振扫描仪进行mri成像。在小鼠尾静脉注射0.03mmgd/kg(100ul)的双特异性gd/cy7-ptp/rgd，然后用1ml肝磷化盐水，以减少尾静脉的探针残留。9只小鼠一组用于每一种药物。作为对照，与dota@gd组执行相同的步骤。使用小鼠身体体积线圈(bodyvolumecoil)获得t1加权图像。胰腺肿瘤(每组n＝3)的小鼠在代谢最高或终点时均处以安乐死。解剖肿瘤及肝、脾、肾、肌肉等主要肿瘤外器官。组织样本均以浓硝酸(1.0ml,70％，emd,gibbstown,nj,usa)均质化和消化。样品液化为4d，溶液以每分钟15,000rpm离心8分钟，上清液用去离子水稀释(1:5)。用icp-oes法测定了上清液中gd浓度。确定gd含量。
根据我们的设计，双肽dota@gd/cy7有望改善体内肿瘤荧光和磁共振成像。肿瘤区域gd(iii)浓度的增加是mri分子成像成功的关键。小分子探针采用mr模块，充分利用了简单的渗透性和epr效应，更有效地提高了肿瘤位点的gd(iii)浓度，而不是仅仅依赖于epr效应。它对高密度恶性肿瘤非常重要，尤其是在胰腺癌中，极度低灌注，主要是低血管和高度间质压力。然而，靶向组件和nifr模块扩大了探针分子量，降低了每个探针的gd(iii)浓度。因此，在克服这一弊端，我们提高gd的装载率，改善了双特异分子探针的t1驰豫效果，设计是双dotas装载双gd(iii)s。接下来，在活体磁共振成像中，在不同时间点注射双肽dota@gd/cy7，以演示靶向探针性能，dota@gd作为对照组。
如图6a所示，分两组经尾静脉注射，双特异性分子探针和dota@gd，在注射后2,4,8,12,24小时，分别采集小鼠的t1加权图像，观察探针在不同时间点在肿瘤内的代谢特点。
如图6b所示，清楚地证明了在小鼠肿瘤中，t1加权信号在小鼠肿瘤中逐渐发生变化，并以双肽dota@gd/cy7处理，作为对照，用双肽dota@gd/cy7治疗，与仅为探针代谢提供二维信息的荧光成像相比，mri成像可以为探针分布带来更有价值的细节。t1加权信号逐渐从灌注良好的周边到未灌注的胰腺肿瘤中心区域。显著地，由目标探针积累引起的更亮的t1加权信号和长时间的滞留，逐渐增强至12h，但是dota@gd的t1加权信号在注射4小时后下降。为了对目标探针进行必要的代谢，在图6c中分析了肿瘤部位gd(iii)保留的定量。在不同时间间隔注射的小鼠体内，从小鼠体内采集肿瘤组织，用溶解液进行溶解。用icp-oes法稀释和测量均质裂解液，定量测定肿瘤组织中gd(iii)的浓度。注射后4h，从肿瘤中可以发现更高的gd(iii)浓度，包括肝脏、脾脏和肾脏等与上述体内荧光结果一致。然而，在24小时注射后的肾脏中出现了优于肿瘤的gd(iii)摄取，说明肾排泄是小分子的主要代谢途径。在不同的时间内，在图7中确定了绝对t1和信噪比(信噪比)。绝对t1代表r1(t1-1,ms)弛豫。双特异靶探针的r1弛豫明显大于dota@gd，双特异靶探针的snr也明显增强和延长。这是由于双特异性分子探针具有更长的血液循环时间和更好的肿瘤渗透能力，使得肿瘤内的gd(iii)浓度更高，滞留时间更长，从而使核磁t1模态的信号强度更高优于小分子dota@gd。这一结论与荧光模态相一致。
实施例4.双靶向肽探针nir引导下手术导航及组织学评价
取肿瘤平均直径超过5mm的皮下、原位移植瘤裸鼠，经鼠尾静脉注射双靶向探针(1mm，200ul)，代谢2h后，在近红外荧光显微镜的引导下进行手术切除。激光照射激发，利用800nm荧光波段通道采集探针荧光信号。肿瘤组织的荧光信号较强，可完整切除肿瘤组织。切除下来的肿瘤组织用4％多聚甲醛固定后行he染色。
首先建立panc1细胞原位胰腺肿瘤的小鼠模型。在手术前，进行生物荧光成像/断层成像(bli/blt)，以定位肿瘤，评估肿瘤的侵袭性。原位胰腺癌肿瘤切除后,双特异性gd(iii)/cy7-ptprgd注射4h。按照30μg/g的剂量通过腹腔灌注对小鼠进行2％戊巴比妥钠麻醉，并固定在操作平台上。nirf-荧光成像导引系统经手术切除肿瘤。在首次切除后，检查残余肿瘤的存在。切除标本固定在4％多聚甲醛和石蜡包埋，进行病理分析。
用双肽dota@gd/cy7进行荧光和磁共振成像，并在小鼠体内进行了nirf引导，并在小鼠身上进行了肿瘤原位生长的胰岛移植。在正常胰腺的尾端植入了27天的panc1-luc细胞后，对原位异种移植模型的bli(生物荧光成像)表现出显著的荧光强度和体积。而blt(生物荧光层析成像)在左侧腹部区域的三维范围内进一步精确地定位原位异种移植(如图8a所示)。在nirf成像的指导下，肿瘤成功并完全切除，如图8b和c所示，切除后的肿瘤组织进行组织学分析。he(hematoxylin-eosin)对解剖肿瘤的染色结果进一步证实，图8da的切除边缘为阴性。肿瘤部分的石蜡切片被用于观察pnca(增殖细胞核抗原)的ihcimmumohistochemical)染色的肿瘤异质性。核染色显示为中、暗褐色，这意味着在胰腺肿瘤的特征下，切除的结节为panc1细胞，异质性较高，如图8dc所示。通过倒置荧光显微镜，将切除肿瘤的另一部分的冷冻切片切成20片。nirf成像显示，在图8de中，大多数双靶向肽阳性区均表达了人类plectin-1和itgb4，在整个肿瘤区域发现了强烈的nir信号，表明双肽dota@gd/cy7具有有效追踪pdac异种移植瘤的能力。
光学成像在深层组织和图像重建和量化方面有一定的局限性，可以很容易地和明显地适应术中指导。用双肽dota@gd/cy7进行了良好的术中指导，验证了其临床转化的价值。高特异性的nirf探针可以改善术中可疑病变的术中定位和评估，并为切除边缘提供快速评估，以避免肿瘤残留和复发。icg指导手术的相似方法已经成功地在临床中发现和切除了乳腺癌的slns。