本发明属于生物工程
技术领域：
，具体涉及一种抗ct83蛋白单克隆抗体及杂交瘤细胞株。
背景技术：
：肿瘤/睾丸抗原(cancer/testisantigen,cta)是一类肿瘤抗原，只表达于正常睾丸、胎盘组织以及肿瘤组织中，有高度的组织限制性。它们与肿瘤的发生、发展以及肿瘤的转移等密切相关。大部分肿瘤-睾丸抗原都具有免疫原性，可诱发机体产生细胞免疫和体液免疫，从而发挥抗肿瘤作用。正因为cta在正常的体细胞中低表达，而在多种肿瘤组织中过表达，使其成为靶向免疫治疗的热点，其中又以mage-a家族和ny-eso-1的研究最为突出，它们过表达可诱导强大的t细胞反应，成为潜在的免疫治疗靶点。而另外一种新的肿瘤睾丸抗原ct83最近也成为潜在的靶标。ct83又名kk-lc1，cxorf61，最先是从同种异体的肺癌细胞株来源的cdna文库中筛选出来的，属于ctas，后证实其编码基因位于xq22，可编码合成113个氨基酸。目前对ct83蛋白的研究甚少，其结构和功能尚未阐明，而且没有特异性检测的单克隆抗体。技术实现要素：本发明针对现有技术中没有特异性检测新的肿瘤睾丸抗原ct83蛋白这一潜在靶标的单克隆抗体的问题，提供一种可被广泛应用，可检测肿瘤组织中ct83蛋白的单克隆抗体及杂交瘤细胞株，该单克隆抗体可直接用于肿瘤细胞和血清中ct83蛋白的检测，有助于肿瘤免疫逃逸机制等的研究。本发明通过分析获得人ct83蛋白的主要抗原表位区，克隆该区段基因；将克隆的基因插入表达载体，构建重组表达载体；用重组表达载体转化感受态大肠杆菌，诱导表达，纯化获得高纯度的ct83重组蛋白；用该重组蛋白免疫balb/c小鼠，取其脾淋巴细胞与小鼠sp2/0骨髓瘤细胞融合，建立杂交瘤细胞系，从中筛选出产生抗ct83蛋白单克隆抗体最稳定的杂交瘤细胞株，其所产生的抗体即为所需的单克隆抗体。该单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，制备方法简单高效；可通过westernblot、免疫组织化学染色技术直接用于肿瘤细胞中ct83蛋白含量的检测，也可用于制备elisa检测试剂盒等。本发明的第一个目的是提供一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为cctccno:c201834。优选，所述的杂交瘤细胞株是采用seqidno.1所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原免疫balb/c小鼠制备得到的。本发明的第二个目的是提供一种由保藏编号为cctccno:c201834的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。优选，所述的单克隆抗体是对seqidno.1所示的蛋白能特异性结合的单克隆抗体。本发明的第三个目的是提供所述的单克隆抗体在制备检测ct83蛋白含量试剂盒中的应用。优选，所述的单克隆抗体在制备检测肿瘤组织中ct83蛋白中的应用。优选，所述的ct83蛋白的第21-113号氨基酸序列如seqidno.1所示。本发明利用大肠杆菌表达系统成功表达了人ct83蛋白的主要抗原表位区的基因，并且得到了高纯度的表达蛋白，进而用于单克隆抗体的制备，并得到了一组特异性更强，亲和力更高的抗人ct83蛋白单克隆抗体。该抗体可直接用于肿瘤细胞和血清中ct83蛋白的检测。本发明的杂交瘤细胞株10605a于2018年2月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为cctccno:c201834，分类命名为杂交瘤细胞株10605a。附图说明图1为ct83蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性分析结果，方框中显示的是选用合成的蛋白序列。图2为pet28a-ct83蛋白小量诱导表达sds-page电泳图，marker为分子量标记，a为未经诱导总菌体裂解液，b为经iptg诱导总菌体裂解液。图3为pet28a-ct83诱导表达后菌液裂解上清和沉淀的sds-page电泳图，marker为分子量标记，a为未经诱导的总菌体裂解液，b为经iptg诱导的总菌体裂解液，c为经iptg诱导的菌液裂解上清，d为经iptg诱导的菌液裂解沉淀。图4为ct83重组蛋白经纯化后的sds-page电泳图，marker为分子量标记，a为超声沉淀用尿素溶解液、b为流穿、c为ntau-10洗脱液、d为ntau-20洗脱液、e为ntau-50洗脱液、f为ntau-200洗脱液、g为ntau-500洗脱液洗脱收集的蛋白。图5为ct83蛋白定量电泳图，marker为分子量标记，a为1μgbsa标准品，b为2μgbsa标准品，c为4μgbsa标准品，d为1μlct83蛋白，e为2μlct83蛋白。图6为4只小鼠第5次免疫后血清效价检测。图7为单克隆抗体纯度检测的sds-page电泳图。图8为免疫印迹检测肿瘤细胞中ct83的表达情况。图9为免疫组织化学检测肿瘤组织中ct83的表达情况（400×）。具体实施方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。实施例1：重组人ct83蛋白的制备与纯化1、基因克隆在ncbi中查找人ct83蛋白氨基酸序列，利用dnastar软件分析ct83蛋白的免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明人ct83蛋白21-113号氨基酸序列抗原性、亲水性及表面可及性较强，见图1，人ct83蛋白21-113号氨基酸的具体序列如seqidno.1所示。利用基因合成技术合成编码此段蛋白的目的基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。设计该基因pcr引物序列如下：上游引物：5’-ctggatcctatcgtcgttttcagcgtaac-3’;下游引物：5’-gcctcgagttaggtacttttacgatgcg-3’。以合成的目的基因为模板，pcr扩增该基因。将原核表达载体pet28a和扩增的目的基因片段分别用bamhi和xhoi双酶切，利用t4dna连接酶连接酶切片段，获得重组表达载体pet28a-ct83，转化e.colidh5α，挑选阳性克隆提取质粒dna，进行酶切与测序鉴定。序列完全正确的克隆即可采用。2、蛋白小量诱导表达取出e.colistrainbl21（de3）感受态菌室温放置半融状态，加入5μl测序正确的pet28a-ct83重组质粒，轻搅至混匀，冰浴30min；42℃热休克45-50s，冰浴2min；加入500μl无抗lb液体培养基，37℃摇床培养30min；取菌液100μl涂平板，37℃倒置培养12-16h。挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/ml抗生素（卡那霉素）的3mllb培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜；次日按1:100接种于含50μg/ml抗生素（卡那霉素）的30mllb培养液中，37℃220rpm摇振至菌体od600为0.6-0.8；取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入iptg至终浓度为0.5mm，37℃220rpm振摇4h，诱导蛋白表达；取出1ml培养物，12000g室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；进行15%sds-page分析，见图2。如图2中所示，ct83重组蛋白于14kd附近有一条诱导带。3、蛋白大量诱导表达与纯化挑取单菌落于10mllb培养基（含50μg/ml卡那霉素）中，37℃250rpm，过夜；转接1%过夜菌于1000mllb培养基（含50μg/ml卡那霉素），37℃250rpm3h，然后加入0.5mmiptg20℃诱导12h；收集菌液，4℃，5000g，离心15min收集沉淀，-70℃保存。每200ml菌液离心所得沉淀以10ml破菌缓冲液充分重悬，同时加入蛋白酶抑制剂及pmsf至终浓度1mm；超声破碎细菌（300w,10s超声，15s间隔，30次）；将细菌破碎液以10000rpm，10min，4℃离心，离心后分别收集沉淀和上清。用等同于上清体积的超声破碎液重悬沉淀；分别取10μl上清和沉淀重悬液用于sds-page检测，以确定是包涵体还是上清表达。其余置于-70℃保存。取3ml镍nta琼脂糖凝胶ff预装柱，用10倍体积ntau缓冲液平衡；将沉淀用尿素溶解，离心取溶解上清，上样于预先平衡好的nta纯化柱，收集流穿液；样品上样完成后，使用ntau-0缓冲液洗柱10个柱体积；顺序使用不同咪唑浓度的ntau-x缓冲液(ntau-10,20,50,200,500mm)各洗柱1个柱体积，分管收集洗脱液；使用平衡缓冲液洗柱10个柱体积，灌满10-20%乙醇，4℃保存；分步收集不同组分并电泳检测，最终将含目的蛋白的组分混合在一起，蛋白定量电泳确定目的蛋白浓度。蛋白超声破碎电泳图见图3，结果显示，目的蛋白的表达在包涵体沉淀内。蛋白纯化电泳图见图4，ct83蛋白在变性条件下与nta柱结合效果较好，在50-500mm咪唑处可洗脱获得目的蛋白。蛋白定量电泳图见图5，由图中所示，ct83蛋白浓度约为1.0mg/ml，可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。实施例2：杂交瘤细胞系的建立1、免疫将实施例1中纯化的蛋白用弗氏完全佐剂（sigma公司）乳化，按每只小鼠60μg蛋白的量，皮下注射初次免疫4只spf级balb/c雌性小鼠，编号为：1,2,3,4。初次免疫过后分别于第14天，第28天，第42天，第56天进行加强免疫，蛋白用弗氏非完全佐剂（sigma）乳化免疫剂量为每次30μg/只。最后一次免疫过后第9天进行眼眶取血，收集小鼠血清，将小鼠血清从200开始2倍梯度稀释，空白对照为pbs，阴性对照为阴性血清200倍稀释。用间接elisa方法进行血清效价测定，效价为大于最大od/2的最小od读数所对应的稀释度。选取血清效价最高的小鼠于融合前3天进行冲击免疫，剂量为50μg。4只小鼠第5次免疫后血清效价检测见图6。免疫小鼠用的抗原为ct83重组蛋白。2、细胞融合将超免3天后的小鼠脊椎脱臼处死后摘取脾脏，冲洗研磨出脾细胞，将小鼠骨髓瘤细胞sp2/0与脾细胞用peg1500（sigma公司）作为融合剂进行细胞融合，再加入制备好的胸腺细胞于半固体培养基（含hat）中进行筛选培养。3、挑克隆培养10天后，挑10板*93个细胞单克隆，培养于96孔细胞培养板中（提前用胸腺细胞铺板，100μl/孔）。4、间接elisa筛选阳性杂交瘤细胞4天后用ct83蛋白包板，采用间接elisa方法对细胞上清液进行效价测定。将筛选出的阳性细胞株再次采用间接elisa方法，筛选出阳性细胞株。实施例3：细胞株建立与腹水诱生法制备单克隆抗体1、细胞株建立经第一次间接elisa实验筛选，得到14株阳性杂交瘤细胞株。将14株阳性的细胞株，采用间接elisa实验做第二次筛选，得到3株阳性杂交瘤细胞株。选取其中一株扩大培养，命名为杂交瘤细胞株10605a，分别用于液氮冻存和单克隆抗体腹水的制备。此杂交瘤细胞株10605a于2018年2月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名为杂交瘤细胞株10605a，其保藏编号为cctccno:c201834。2、腹水制备用生理盐水悬浮处于对数生长期的杂交瘤细胞，调整细胞密度为5×105个/ml。将悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠；7天后开始收集腹水，取出的腹水5000rpm离心10min；小心吸出中间的腹水收集于离心管中，-20℃保存。3、单克隆抗体的纯化用偶联缓冲液以1:3稀释腹水，12000rpm4℃离心10min，用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤，过proteina亲和层析柱，洗脱液进行洗脱，收集于ep管中。sds-page胶鉴定纯度。以iptg诱导表达的ct83蛋白为电泳样品，进行sds-page电泳，按常规方法将凝胶蛋白带转移到pvdf膜（millipore公司）上。将膜置于含5%脱脂奶粉的tbst封闭液中封闭30min。加入单克隆抗体4℃过夜。用tbst洗膜后，加入1:5000稀释的羊抗鼠二抗（碧云天）室温孵育1h。再次tbst洗膜，加入化学发光液（millipore公司），在可见荧光成像系统(azurec400)中进行化学发光图像数据的采集。单克隆抗体纯化后的浓度为1.5mg/ml。单克隆抗体纯化的sds-page电泳图见图7，分子量为15kd。实施例4：单克隆抗体的鉴定1、单克隆抗体亚类鉴定采用southernbiotech公司sbaclonotypingsystem-hrp试剂盒（iga、igg1、igg2a、igg2b、igg3、igm、λ、κ）对阳性细胞株产生的单克隆抗体进行鉴定，方法为间接elisa法，实验步骤按照说明书进行。结果显示本发明单克隆抗体为igg1型鼠源单克隆抗体。2、亲和常数测定用包被液稀释ct83重组蛋白，终浓度为2μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜，pbst洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，pbst洗涤3次。纯化的单克隆抗体从1:200开始2倍梯度稀释，最后1孔为空白对照，37℃孵育1h，pbst洗3次。加入稀释20000倍的二抗，100μl/孔，37℃孵育1h，pbst洗涤3次。每孔加入100μl显色液，5min后加50μl硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定每孔的od值，如表1所示，画出od值对应抗体稀释倍数的曲线，找出上平台1/2od值所对应的抗体稀释倍数a，然后利用下列公式计算出亲和常数为2.8×109。该计算公式为：亲和常数≈150000×a/抗体浓度。表1od值结果抗体稀释倍数200400800160032006400128002560051200102400204800空白od值1.051.0481.0010.990.8860.7990.6690.5420.4370.2770.1880.094实施例5：单克隆抗体用于检测1、免疫印迹技术检测单克隆抗体的特异性提取人结肠癌细胞株rko和sw1116、肺癌细胞株nci-h1299、肝癌细胞株huh-7、宫颈癌细胞株hela、乳腺癌细胞株mcf-7和mda-mb-231、鼻咽癌细胞株hne-1和cne-2、人胚胎肾细胞293t细胞中的总蛋白，加入计算量的上样缓冲液后，将上述蛋白质样品经sds-page电泳后于250mv，1.5h条件下电转移至pvdf膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭1h后，tbst洗涤3次。用纯化的单克隆抗体作为一抗，按1:1000稀释后，4℃震荡孵育过夜，tbst洗涤3次后。用1:2000稀释的羊抗小鼠igg-hrp作为二抗，室温孵育1h，tbst洗涤3次后，加入适量发光液于pvdf膜上，置于azurec400成像系统中进行发光检测。结果如图8所示。免疫印迹结果显示以上肿瘤细胞均表达ct83蛋白，而293t细胞并不表达ct83蛋白。2、免疫组织化学技术检测单克隆抗体的特异性①将人肺癌、鼻咽癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤、尿路上皮癌、子宫内皮样腺癌组织石蜡切片浸泡于二甲苯中，微波炉加热5min；再次将石蜡切片浸泡入二甲苯中，微波炉加热5min；再分别浸泡于无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇溶液中5min两次；然后用自来水进行冲洗。②将切片至3%h2o2溶液中室温孵育10min，用pbst洗涤3次。将切片浸泡至柠檬酸盐缓冲液中，高压修复10min后，用pbst洗涤3次。将切片浸泡至5%bsa溶液中封闭20min。将切片上液体甩掉，用免疫组化笔将切片上的组织画圈后，滴加50μl一抗（已经纯化的抗ct83蛋白单克隆抗体1:200稀释）于组织上，于4℃孵育过夜。用pbst洗涤切片3次后，再在组织处加igg-hrp二抗，于室温孵育1h后，pbst洗涤3次。滴加dab显色液于组织上，显色时间5min左右。将切片用流水冲洗后，用苏木素复染1min；再次用流水冲洗后，用1%盐酸酒精分化，用流水冲洗；再次浸泡于75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇溶液中5分钟两次，于二甲苯溶液中浸泡5min两次后，用中性树胶封片。显微镜下观察染色结果并拍摄图像。如图9所示，免疫组织化学检测了人肺癌、鼻咽癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤、尿路上皮癌、子宫内皮样腺癌共9中组织，结果显示ct83蛋白着色主要定位于肿瘤细胞的细胞膜和细胞浆中。虽然上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>广东医科大学<120>一种抗ct83蛋白单克隆抗体及杂交瘤细胞株<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>93<212>prt<213>人(homosapiens)<400>1tyrargargpheglnargasnthrglyglumetserserasnserthr151015alaleualaleuvalargproserserserglyleuileasnserasn202530thraspasnasnleualavaltyraspleuserargaspileleuasn354045asnpheprohisserilealaargglnlysargileleuvalasnleu505560sermetvalgluasnlysleuvalgluleugluhisthrleuleuser65707580lysglypheargglyalaserprohisarglysserthr8590<210>2<211>279<212>dna<213>人(homosapiens)<400>2tatcgtcgttttcagcgtaacaccggcgaaatgagcagtaatagtaccgcactggcactg60gttcgtccgagtagcagcggtctgattaatagcaacaccgataacaacctggccgtttac120gatctgagccgcgatattctgaacaacttcccgcatagcattgcgcgtcaaaaacgcatt180ctggtcaacctgagcatggtcgagaacaaactggtcgaactggaacataccctgctgagt240aaaggttttcgcggcgcttctccgcatcgtaaaagtacc279当前第1页12