本发明涉及水稻基因工程技术领域，尤其涉及mir396e和mir396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用。
背景技术：
microrna(mirna)是一类20–24个核苷酸长度的非编码单链小rna分子，它通过碱基配对结合靶基因的mirna，从而引起mrna的降解或翻译抑制。mirna在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用。
mir396(microrna396)是植物体内的一类保守mirna，它通过其靶基因grfs(growuhregulauingfacuors)参与细胞增殖和分化的协调，在植物生长发育过程中发挥着重要的调节作用。grfs是植物特有的一类转录因子，参与众多的细胞分裂和器官发育过程。在拟南芥、水稻和番茄中，过表达mir396导致严重矮小的植株形态。
近年的研究显示mir396调控花和果实的大小，从而使mir396显示出巨大的应用价值。在番茄中采用suum(shoruuandemuargeumimic)技术干扰mir396的表达，可以显著增大花器官和果实。籽粒大小和穗型是影响稻谷产量的关键因素。mir396/grf遗传模块调控水稻的籽粒大小和每穗粒数。水稻种子粒型控制qul(quanuiuauiveuraiulocus)基因gs2/gl2编码grf4，gs2/gl2序列上的一个稀有变异(uc→aa)破坏了mir396在grf4mrna上的结合位点，致使grf4表达量增加；grf4表达的增加促进油菜素内酯(brassinosueroid，br)响应基因的表达从而使籽粒变大。mir396还通过grf6调控水稻穗型。过表达mir396b导致植株形体矮小、稻穗缩短、穗二次分枝缺失以及颖花数目严重减少；过表达mir396类似物(mim396)或grf6增加稻穗二次枝梗和颖花数目，从而增加每穗粒数，提高产量。mir396/grf遗传模块同时负调控穗型和粒型，因此通过控制mir396/grf遗传模块的表达可能同时增加千粒重和每穗粒数，打破产量三要素(分蘖数、每穗粒数和千粒重)之间的矛盾关系。
此外，申请公布号为cn103387981a、cn103387984a和cn103387983a的发明专利申请依次公开了microrna396d或其编码基因在调控水稻开颖、株高以及叶夹角中的应用，指出microrna396d的超表达株系与未转入该基因的水稻相比表现出明显的开颖变大、降低株高和叶夹角变大的表型。
水稻株型也是水稻产量的关键因素。在过去的30年间，研究者已从分子遗传学的角度对株型进行了大量的研究，鉴定出了几个调控株型，并被应用于生产的基因，如sd1、ipa1、dep1和osdrawf4等。其中sd1又被称为绿色革命基因，它通过适当降低株高，提高了水稻的收获指数和抗倒伏性，从而大幅度提高了水稻产量。ipa1又被称为理想株型基因，它可以通过降低水稻分蘖数、增大穗型、增加千粒重而提高产量。dep1被称为直立穗基因，它能使稻穗变密、枝梗数增加、每穗籽粒数增多，从而实现增产。osdrawf4减小叶夹角，有利于密植，从而促进产量的提高。之前的株型研究主要集中在株高、分蘖数、穗型和叶夹角。叶片和叶鞘的长度也是株型形成的重要因素，但对其研究较少，还未见从分子遗传学角度对其进行研究的报道。
技术实现要素：
本发明提供了mir396e和mir396f在调控水稻株型、穗型和粒重的新用途。
具体内容如下：
本发明提供了mir396e和mir396f在调控水稻株型中的应用，所述mir396e的核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.2所示；所述mir396f的核苷酸序列如seqidno.3或seqidno.4所示。
其中，mir396e是指microrna396e；mir396f是指microrna396f。seqidno.1所示核苷酸序列为mirna396e的成熟序列，seqidno.2所示核苷酸序列为mirna396e的前体序列；seqidno.3所示核苷酸序列为mir396f的成熟序列，seqidno.4所示核苷酸序列为mir396f前体序列。
本发明提供了mir396e和mir396f的编码基因在调控水稻株型中的应用，所述mir396e的编码基因的核苷酸序列如seqidno.5所示；所述mir396f的编码基因的核苷酸序列如seqidno.6所示。
进一步地，，所述调控水稻株型的模式为mir396e和mir396f突变后增加叶片和叶鞘的长度，缩短最上部三个茎节的长度。尤其是缩短穗茎节的长度。
经实验发现，将mir396e编码基因和mir396f编码基因突变后获得的mir396ef双突变体在幼苗期时，与野生型植株幼苗相比，具有更大的鲜重，更长的叶片、叶鞘和苗长；在抽穗期时，与野生型植株相比，所有的叶片、叶鞘和稻穗的长度也明显增加。
本发明还提供了mir396e和mir396f在调控水稻穗型和粒重中的应用，所述mir396e的核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.2所示；所述mir396f的核苷酸序列如seqidno.3或seqidno.4所示。
本发明还提供了mir396e编码基因和mir396f编码基因在调控水稻穗型和粒重中的应用，所述mir396e的编码基因的核苷酸序列如seqidno.5所示；所述mir396f的编码基因的核苷酸序列如seqidno.6所示。
进一步地，所述调控水稻穗型为负调控水稻的主穗一次分枝数和穗长。
进一步地，所述调控水稻粒重为负调控水稻种子的粒长、粒宽和厚度以及千粒重。
经实验发现，将mir396e编码基因和mir396f编码基因突变后获得的mir396ef双突变体种子粒型增大，粒长、粒宽和粒厚均比野生型植株的种子大；并且mir396ef双突变体主穗的一次分枝也比野生型植株的更多。
此外，为进一步研究mir396e和mir396f调控水稻株型和粒重的机理；本发明观测了mir396ef双突变体和野生型植株的颖壳细胞、叶细胞、穗茎节细胞，结果表明：与野生型植株相比，mir396ef双突变体具有更大的种子颖壳细胞，更长的叶片和叶鞘细胞，但穗茎节细胞的伸长却受到抑制。
本发明检测了mir396ef双突变体幼苗中ga和mva的含量以及ga受体基因、ga失活基因、ga合成的关键基因的表达量，结果表明：mir396ef双突变体通过ga通路促进叶片和叶鞘的伸长；而ga通路的激活是通过增加mva的含量来实现的。
crispr/cas9技术是最近几年兴起的一种基因编辑技术。2013年首次发表以后，该技术迅速被广泛应用于动植物的基因编辑。在该技术体系中，cas9核酸酶在短的sgrna(singleguiderna)引导下，去切割与sgrna识别区互补的dna序列；在一个细胞中表达多个sgrna可同时对多个基因进行编辑。
本发明还提供了一种调控水稻株型、穗型和粒重的方法，包括：
(1)构建至少同时靶向mir396e编码基因和mir396f编码基因的crispr/cas9载体；
(2)采用crispr/cas9技术将水稻基因组中mir396e编码基因和mir396f编码基因进行定点突变，获得mir396e编码基因和mir396f编码基因均沉默的水稻突变体植株。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首次发现和公开了mir396e和mir396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的作用。
(2)本发明还对mir396e和mir396f调控水稻株型的机理进行了探究，发现mir396ef双突变体通过ga通路促进叶片和叶鞘的伸长；而ga通路的激活则通过增加mva的含量来实现。
附图说明
图1为实施例1中mir396基因的编辑情况；
其中，a为mir396d、mir396g和mir396h的寄生结构图，箭头表示基因的方向；黑色实心框表示编码区，灰色实心框表示uur区；b为mir396多基因编辑策略；c为mir396基因编辑的靶位点选择，下划线表示cas9的靶位点，框内字体部分对应于成熟mir396序列。
图2为在水稻mir396突变体幼苗期的表型观察与分析结果；
其中，a为幼苗期，野生型(xs134)与移码突变的mir396h/grf1和非移码突变的mir396h/grf1的表型对比；b为成熟期，野生型(xs134)与mir396h/grf1移码突变体的表型对比，标尺，10cm；c为幼苗期，野生型与mir396ef的表型对比；d为幼苗期，野生型与mir396ef的苗长；e为幼苗期，野生型与mir396ef的鲜重；f为幼苗期，野生型与mir396ef第三叶的叶鞘长度；g为幼苗期，野生型与mir396ef第三叶的叶片长度；h为幼苗期，野生型、mir396ef和mir396abef的表型对比，标尺为10cm。***表示与野生型对比的p值小于0.001。
图3为突变体mir396ef和野生型xs134的叶片、叶鞘、茎节和穗长度的检测结果；
其中，a为野生型、mir396ef和mir396aef的株型对比结果；b为野生型和mir396ef主分蘖对比结果；c为野生型和mir396ef主分蘖节间长度对比结果；d为野生型和mir396ef旗叶鞘和叶片对比结果；e为成熟期，野生型和mir396ef各叶片长度；f为成熟期，野生型和mir396ef各叶鞘长度；g为野生型和mir396ef各节间和穗的长度；h为野生型和mir396ef主分蘖穗茎到旗叶枕的距离；i为野生型和mir396ef旗叶宽，标尺为10cm；***，与野生型对比的p值小于0.001；**，与野生型对比的p值小于0.01。
图4为突变体mir396ef和野生型xs134的种子粒型和穗型的检测结果；
其中，a为野生型和mir396ef的种子对比；标尺为2cm；b为野生型和mir396ef种子粒长；c为野生型和mir396ef的种子粒宽；d为野生型和mir396ef的种子粒厚；e为野生型、mir396ab、mir396c、mir396ef、和mir396abef种子的千粒重；f为野生型和mir396ef的主穗对比；标尺为10cm；g为野生型和mir396ef主穗一次分枝数；h为野生型和mir396ef主穗二次分枝数；i为野生型和mir396ef主穗小花数；j为野生型和mir396ef单株分蘖数；h为野生型和mir396ef单株产量对比(2017年海南测试)。***，与野生型对比差异的p值小于0.001；*，与野生型对比差异的p值小于0.05。
图5为突变体mir396ef和野生型xs134的颖壳细胞、叶细胞和穗茎节细胞的检测结果；
其中，a为旗叶片上表皮细胞；标尺为20μm；b为旗叶片上表皮细胞长度；c为旗叶片上表皮细胞宽度；d为旗叶鞘外表皮细胞长度；e为旗叶鞘外表皮细胞宽度；f为旗叶鞘外表皮细胞；标尺为20μm。g为旗叶叶片维管束处的纵切；标尺为50μm。h为叶维管束细胞的长度；i为旗叶细胞的横切面细胞对比；标尺为100μm。j为穗茎节纵切面细胞对比；k为穗茎节细胞长度；l为野生型和mir396ef的颖壳对比；断续线表示图5b的横切位置；标尺为0.5cm；m为野生型和mir396ef的颖壳横切面的细胞对比；标尺为100，μm；n为颖壳表皮细胞的电子扫描显微镜观测照片；标尺为100μm。o为颖壳外表皮细胞长度；p为颖壳外表皮细胞宽度；标尺为100μm。***，与野生型对比的p值小于0.001。
图6为mir396e促进幼苗生长和叶伸长的机理研究结果；
其中，a为ga相关基因在野生型和mir396ef(两个独立的株系)幼苗间的相对表达量；b为不同ga在野生型和mir396ef幼苗中的含量水平；#，未检测到；c为在野生型和mir396ef幼苗间含量差异最大的20种代谢物质；fc为代谢物含量在mir396ef和野生型间的比值，即mir396ef/xs134；d为tps基因在野生型和mir396ef间的相对表达量；e为aba和cks在野生型和mir396ef中的含量水平。20天幼苗的地上部分被用来进行该部分实验。
图7为野生型和mir396ef穗茎节中sd37的相对表达量和ga含量；
其中，a.为sd37在野生型和mir396ef穗茎节间的相对表达量；b为穗茎节中的ga含量；#，未检测到。
图8为mir396ef影响株型的机理模式图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。下文所述的幼苗是指水稻秧苗。小写字母和数字的组合(如mir396ef)表示的是编码基因经crispr/cas9编辑后获得的突变株，例如：mir396ef是指经特异性靶向mir396e和mir396f基因的crispr/cas9载体编辑后获得的mir396ef突变株；大、小写字母和数字组合(如mir396e)表示的是mir396e的编码基因。下列实施例中xs134是指野生型，mir396h/grf1是指mir396h基因发生突变的突变体(mir396h基因位于grf1基因的外显子上，所以突变会同时引起mir396h和grf1的突变，因此mir396h突变体被记为mir396h/grf1)。
实施例1水稻mir396基因家族的系统突变
在水稻基因组中有8个mir396的表达基因(表达基因序列见mirbase数据库，huup://www.mirbase.org/)。通过序列分析，发现这8个基因中，mir396a、mir396b、mir396c、mir396e和mir396f位于基因间区域，而mir396d、mir396h和mir396g寄生于其靶基因的编码区内(图1a)。
针对此种情况，我们构建了一个特异靶向mir396a、mir396b、mir396c、mir396e和mir396f的多基因编辑crispr/cas9载体(图1b；图1c显示了cas9的靶位点)。在该载体中，cas9由玉米ubiquitin启动子介导表达；四个sgrna分别由osu3-1、osu6-1、osu3-2、osu6-2启动子介导表达(启动子序列见序列seqidno.7到序列seqidno.10)，四个sgrna表达盒在载体上串联排列(图1b)。为特异性地靶向水稻mir396基因，我们合成了特异识别靶基因的引物，其包含20bp的目标识别序列和4-5bp的标签序列。引物退火后形成带黏性末端的双链dna(20bp双链区)。该双链dna与启动子及下游序列在t4连接酶作用下无缝连接，从而构建sgrna表达盒。串联排列的sgrna表达盒先被构建于puc19中间载体，然后被亚克隆于带cas9表达盒的pcambia1300骨架。
另外，我们还构建了7个单sgrna表达的载体，其中一个载体靶向mir396e和mir396f，其他6个载体靶向单基因(图1c显示了cas9的靶位点)。
通过农杆菌介导的转化方法，我们将载体转化进了粳稻品种秀水134(xs134)。秀水134是中国东南地区大面积推广的优良粳稻品种。通过这些载体，共获得了199个突变株系，其中包含mir396a、mir396b、mir396c、mir396d、mir396g、mir396h、mir396ab、mir396ef、mir396aef、mir396abef、和mir396aceff等突变体。mir396ab和mir396acef各有两个独立的株系，其他的突变体都含有至少5个株系，其中mir396ef有70个株系。
实施例2
1、mir396ef双突变株促进水稻幼苗生长
在连续三季的大田观测中，mir396a、mir396b、mir396ab、mir396c、mir396d和mir396g未呈现与野生型(xs134)明显差异的表型。mir396h/grf1的移码突变株系表现出矮小的生长表型，而非移码突变株系的表型与野生型(xs134)相似(图2a和2b)。
幼苗期，mir396ef表现出比野生型更壮的表型(图2c)，具有比野生型更大的鲜重，更长的叶片、叶鞘和苗长(图2d-2g)。幼苗期mir396aef、mir396abef和mir396acef的表型与mir396ef类似(图2h)。
2、mir396ef双突变株促进叶片、叶鞘、穗子的伸长，但抑制茎节的伸长
抽穗期后，mir396ef表现出一种奇特的株型，即群体水平上，突变体穗子比野生型明显低，但旗叶比野生型微高(图3a)。
为仔细鉴定mir396ef株型，我们测量了抽穗期后的叶片、叶鞘、茎节和穗子的长度。发现与野生型相比，mir396ef所有的叶片和叶鞘的长度明显增加(图3b、3d、3e和3f)，而叶宽无明显变化(图3i)。mir396ef稻穗的长度也明显增加，但上部的茎节特别是穗茎节的长度明显缩短(图3g)。叶鞘长度明显增加，但茎节的缩短导致严重的包穗现象，主分蘖稻穗大约有8厘米被叶鞘半包裹(图3d和3h)。mir396aef、mir396abef和mir396acef的株型与mir396ef相似(图3a)。
3、mir396ef双突变株增加稻谷千粒重，增大穗型
mir396ef的种子粒型增大，粒长、粒宽和粒厚均比野生型大(图4a–4d)。与野生型相比，mir396ef的千粒重增加约40％(图4e)。mir396ef的穗型增大(图4f)。细致的穗型分析显示，mir396ef主穗的一次分枝增多，但二次分枝和小花的数目与野生型一致(图4g–4i)。因此增大的穗型主要被mir396ef用于容纳更大的种子而非更多的种子。
mir396aef、mir396abef和mir396acef具有与mir396ef相近的千粒重(图4e)和穗型。实际上，在整个生育期，mir396aef、mir396abef和mir396acef与mir396ef在株型和种子粒型上无明显差异，这表型表明在mir396基因中，mir396e和mir396f是调控生长发育的主要基因。
mir396ef与野生型的分蘖数无明显差异(图4j)。2017年在海南陵水的产量测试显示mir396ef能使单株产量提高14％–17％(图4k)。但杭州的产量测试未发现产量的提高。仔细观察发现稻穗下部被叶鞘包裹的部位结实率较低，种子灌浆较差，说明包穗严重影响了产量潜力的发挥。
实施例3mir396ef增大颖壳细胞，促进叶细胞伸长，但抑制穗茎节细胞伸长
为进一步鉴定叶片和叶鞘伸长的原因，我们还观察了抽穗期水稻叶片和叶鞘的表皮细胞。表皮细胞观测采用以下方法：将新鲜的叶片和叶鞘于开水中煮10分钟，然后于95％的酒精中煮60–90分钟，直至叶片和叶鞘完全褪色；然后置于96℃的85％乳酸中，浸泡8分钟；冷却后，用刀片将组织刮薄，然后可在光学显微镜下直接观察表皮细胞。
表皮细胞观测发现：mir396ef的旗叶片和旗叶鞘的表皮细胞增长，但细胞宽度没有变化(图5a–5f)。纵切显示mir396ef旗叶片的维管束细胞变长(图5g和5h)。mir396ef旗叶片横切面细胞大小与野生型类似(图5i)。
此外，mir396ef种子颖壳横切面的细胞比野生型大(图5l和5m)。扫描电子显微镜观测显示mir396ef颖壳表皮细胞的长度和宽度均比野生型增大(图5n–5p)。茎秆纵向切片显示，mir396ef穗茎节的细胞长度大约只有野生型的58％(图5j和5k)。
结果表明，mir396ef增大种子颖壳细胞，促进叶片和叶鞘细胞伸长，但抑制穗茎节细胞伸长。
实施例4mir396ef通过赤霉素通路促进幼苗生长和叶的伸长
(1)为探索mir396ef促进幼苗生长和叶伸长的机理，我们对幼苗地上部分(由叶片和叶鞘组成)进行了转录组分析。
发现：在两个独立的mir396ef株系中，ga受体基因和ga失活基因的表达显著上升(ratio≥2or≤0.5)(图6a)，这些基因包含2个ga受体基因(gid1l2和gid1l3)和6个ga失活基因(ga2-oxidases，包括ga2ox1、ga2ox3、ga2ox6、ga2ox7、ga2ox8和ga2ox9)。
随后，我们检测了幼苗地上部分的ga含量，发现在mir396ef中，生物活性gas包括ga3、ga4和ga7的含量大大增加(ga3，0.2385ng/gvs5.1792ng/g；ga4，0ng/gvs4.3289ng/g；ga7，0.0935ng/gvs4.4438ng/g)，活性ga前体ga24呈现更大程度的水平上升(0ng/gvs23.7807ng/g)(图6b)。促进细胞和器官伸长是ga最显著的作用之一，因此这些结果表明mir396ef通过ga通路促进叶片和叶鞘的伸长。
(2)为探索ga含量增加的原因，我们对ga合成的关键基因，包括ga20oxs、ga3oxs、cps1、ks1、kao和ko2，进行了表达分析。水稻中有4个ga20oxs(ga20ox1、ga20ox2、ga20ox3和ga20ox4)和2个ga3oxs(ga3ox1和ga3ox2)，这两类基因编码的酶催化ga合成的后期步骤。
表达分析结果显示：在mir396ef中，4个ga20oxs的表达未呈现明显的上调，甚至呈现整体的下调(图6a)；ga3ox1在幼苗中不表达，ga3ox2的表达在野生型和mir396ef间未有显著变化(图6a)。
催化ga合成早期步骤的酶由单基因编码，这些基因包括cps1、ks1、kao和ko2。表达分析结果显示，这四个基因的表达在野生型和mir396ef间的变化不明显(图6a)。因此ga合成类基因的表达变化不是ga水平上升的原因。
(3)为了探索mir396ef中ga水平上升的原因，我们进一步对幼苗的地上部分进行了代谢组分析。结果显示：在mir396ef中，ga合成前体甲羟戊酸(mevalonicacid,mva)的水平增加了大约29000倍(log2fc＝14.83；fc，mir396ef/xs134)(图6c)。表明mir396ef通过增加mva的含量激活ga通路。
在细胞中，mva通过甲羟戊酸途径(mevalonatepathway)转化为异戊二烯焦磷酸(isopentenyldiphosphate,ipp)和二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyldiphosphate,dmapp)。ipp和dmapp是所有萜类物质(terpenoids)包含ga的合成前体。terpenesynthase(ups)家族基因负责多种萜类物质的合成。
与mva含量的显著增加相对应，转录组分析显示19个tps基因的表达显著上升(ratio≥2)，real-timert-pcr验证结果与其一致(图6d)。细胞分裂素(cytokinins，cks)使用amp和ipp作为合成前体。另外，脱落酸(abcisicacid，aba)也可以使用萜类物质作为合成前体。激素含量测定显示aba和三种cks(n6-isopenuenyladenine，ip；urans-zeauin，uz；dihydrozeauin，dz)的水平在mir396ef中仅有稍微的提高，而cis-zeauin(cz)的水平明显下降。以上结果说明：mir396ef双突变体通过ga通路促进叶片和叶鞘的伸长；而ga通路的激活是通过增加mva的含量来实现的。
实施例5mir396ef可能通过sd37影响茎秆伸长
为研究mir396ef影响茎秆伸长的机理，我们对穗茎节进行了激素含量测定、代谢组分析和转录组分析。
激素含量测定显示，活性ga前体ga20的水平有明显的上升(野生型中未检测到，突变体中含量为0.45ng/g)，而ga7、ga19和ga53的水平变化不大(图7b)。在野生型和mir396ef穗茎节中未检测到ga1、ga3、ga4、ga9、ga15和ga24(图7b)。代谢组分析在野生型和mir396ef间未检测到mva水平的显著差异(log2fc＝0.297；fc，mir396ef/xs134)。转录组分析在野生型和mir396ef间检测到453个差异表达基因(differenuialexpressedgenes，degs)(ratio≥2or≤0.5)，其中包含许多脂类代谢、糖代谢和细胞壁合成类基因，这几类基因在mir396ef中表达下降。在下降degs中，我们发现sd37的表达严重下降(图7a)。sd37参与细胞壁的合成，调控茎杆的伸长，sd37突变会导致茎秆变短。前人的转录组分析显示，sd37中许多脂类代谢、糖代谢和细胞壁合成类基因的表达下降。这些结果显示mir396ef可能通过下调sd37表达而非ga通路来影响茎秆伸长。
以上结果说明，mir396ef通过增加mva的含量激活ga通路，进而促进生长和器官伸长；可能通过抑制sd37表达而非ga通路抑制茎秆伸长(图8)。
序列表
<110>浙江农林大学
<120>mir396e和mir396f在调控水稻株型、穗型和粒重中的应用
<160>10
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