本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及抗真菌的发酵半合成药物前体的制备，更具体涉及阿尼芬净前体棘白菌素b母核的制备。
背景技术：
近年来，由于免疫低下患者逐年增多，真菌感染发病率明显升高，尤其是深部真菌感染的发病率和病死率显著增加。棘白菌素类抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物，具有类似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链，能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，从而达到抗真菌的目的。与传统抗真菌药物相比，该类药物具有作用机制独特，毒副作用低，且对一些唑类和两性霉素b耐药的真菌具有很强的抗菌活性，是目前临床治疗深部真菌感染的常用药物。fda已批准上市的这类药物包括卡泊芬净(caspofungin)、米卡芬净(micafungin)和阿尼芬净(anidulafungin)。
阿尼芬净的制备过程包括以下三步：(1)构巢曲霉(aspergilusnidulans)发酵产生棘白菌素b(echinocandinb，ecb)；(2)通过微生物转化——游动放线菌发酵产生的脱酰化酶对棘白菌素b进行催化，使侧链断裂，生成阿尼芬净的前体-棘白菌素b母核(echinocandinbnucleus，ecbn)；(3)在母核的基础上采用化学修饰的方法加入新的侧链——戊氧-三苯羧基。其中前体母核的制备是关键步骤。目前对于ecb母核的制备，化学方法成本较高，微生物转化具有以下优点：反应条件温和、产物单一、高度的化学选择性、区域选择性和对映体选择性、易于纯化、不污染环境且能完成一些化学合成难以进行的反应。
美国专利us7785826b2披露了ecb转化ecbn的工艺。此工艺主要流程包括：将ecb发酵完成以后，离心获得菌丝体，把菌丝体重新悬浮于水中然后加入脱酰酶进行转化，ecb脱酰酶仅利用一次。但该方法操作较为繁琐，工艺转化耗时20～30h，且转化率低，摩尔转化率仅为30％。
cn102618606公开了一种利用放线菌全细胞或发酵液作为催化剂的棘白菌素生物转化方法。该方法在转化体系添加了一种助溶剂，提高底物在转化体系中的溶解度，该助溶剂为β-环糊精或其衍生物，该方法的优点是提高了转化速度和转化率，缺点是全细胞转化，体系中带有大量菌体，酶与底物接触效率不高，后续分离纯化步骤复杂成本较高，没有解决酶在含有机溶剂体系中易失活的问题。
cn103074403公开了一种将ecb转化为ecbn的方法，涉及发酵完成后通过加磷酸盐、超声、离心、旋蒸浓缩，得到棘白菌素b脱酰酶酶液，然后加入ecb底物进行转化。该方法不足之处在于粗酶提取过程繁琐，不利于工业化放大生产；使用旋蒸的方式提取粗酶，由于温度偏高，易造成蛋白质变性，脱酰酶的活力有负面影响。
cn103374593公开了一种在发酵过程中添加棘白菌素b底物转化为棘白菌素b母核的方法，该方法将底物添加到脱酰酶产生菌发酵液中转化，反应体系存在大量微生物，后续分离纯化步骤复杂，成本高。
cn103387975公开了一种固定化环脂肽酰基转移酶的制备方法，所述环脂肽酰基转移酶固定于载体上；所述环脂肽酰基转移酶来源于天然或人工突变体、或者变种及由通过导入外来的环状酰基转移酶基因后转化得到的。利用固定化环脂肽酰基转移酶将ecbn转化为阿尼芬净。通过该方法，虽然转化率较高，但操作复杂，成本较高，固定化过程的化学反应容易导致酶部分失活。
cn105648000公开了一种棘白菌素b微生物酶转化方法，具体涉及棘白菌素b转化为棘白菌素b母核的方法。包括在微生物发酵生成棘白菌素b脱酰酶后提取粗酶，然后通过分批添加粗酶及棘白菌素b的方式进行转化，该方法分批添加粗酶和底物进行转化，没有解决酶暴露在有机溶剂体系中容易失活的问题。
基于对扩大生产，降低成本的需要，在阿尼芬净的生产领域，仍然需要更优的ecbn转化成阿尼芬净的方法。
2000年荷兰delft理工大学的cao等在交联酶和交联酶晶体的基础上提出一种新型的固定化酶技术，交联酶聚体(cross-linkedenzymeaggregates，cleas)。此通过改变性质使酶分子靠近而形成聚集体从溶剂中沉淀出来，之后将聚集体进行交联，形成交联酶聚体。交联酶聚体是酶本身作为载体的固定化酶，单位体积酶浓度高，稳定、可回收、催化活性高，生产成本低，具有潜在的应用前景。
目前报道的交联酶聚体使用的酶包括水解酶、裂合酶、氧化还原酶，目前未见在发酵半合成药物的发酵领域有报道，也未见将此技术应用于脱酰酶的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种全新的棘白菌素b转化为棘白菌素b母核的方法。该方法将交联酶聚体技术应用于棘白菌素b转化为棘白菌素b母核的过程中。
该方法为通过将脱酰酶制备成脱酰酶交联酶聚体，该交联酶聚体将棘白菌素b转化为棘白菌素b母核。通过该方法，可达到85～90％的摩尔转化率，同时简化生产过程，降低了成本。
本发明方法包括以下步骤：
1).发酵能将棘白菌素b脱酰酶表达在胞外的基因工程菌，获得棘白菌素b脱酰酶粗酶；
2).将脱酰酶粗酶制备为脱酰酶交联酶聚体；
3).棘白菌素b与脱酰酶交联酶聚体反应，转化为棘白菌素b母核。
其中，步骤1)中脱酰酶粗酶是由产生菌发酵制得，粗酶产生菌的发酵可使用表达在胞外的基因工程菌株，例如白色链霉菌基因工程菌株(streptomycesalbus)，(参见“efficientbioconversionofechinocandinbtoitsnucleusbyoverexpressionofdeacylasegenesindifferenthoststrains[j].applenvironmicrobiol,2013feb；79(4):1126-33)，采用本领域技术人员熟知的条件进行发酵制备，例如包括但不限于cn102618606中公开的发酵方法。
按照上述方法制备得到的脱酰酶发酵液过滤或离心，向上清液加入硫酸铵进行盐析，通入空气，搅拌后静置，过滤或离心，收集沉淀，得到脱酰酶粗酶。
其中，所述的硫酸铵的用量为发酵上清液的40～80％(w/v)，优选50％；通入空气的每分钟流量相当于加入硫酸铵后料液总体积的10～30％(v/v)，优选20％；搅拌时间为20～60分钟，优选30分钟；搅拌速度为50～150rpm；静置条件为温度4～15℃、时间8～16小时，优选的静置条件为8℃静置12小时。
步骤2)中，脱酰酶交联酶聚体的制备具体方法为：将步骤1)制备得到的脱酰酶粗酶加入磷酸缓冲液后，再加入牛血清白蛋白(bsa)作为交联保护剂，通入空气，搅拌后静置。再向上述反应液中加入交联剂戊二醛，搅拌，以形成脱酰酶交联酶聚体。
其中，所述的磷酸缓冲液含磷酸二氢钾2～2.5g/l，磷酸氢二钠1～1.5g/l，ph用盐酸或氢氧化钠调节为5.5～6.5；优选磷酸二氢钾2.24g/l，磷酸氢二钠1.24g/l，ph为6.0。粗酶的加入量为1～3％，优选粗酶加入量2％。
所述的牛血清白蛋白(bsa)的加入量为1～3g/l，优选2g/l，通入空气的每分钟流量相当于料液体积的10～30％(v/v)，优选20％；搅拌时间为20～60分钟，优选30分钟；搅拌速度为50～150rpm，优选80rpm；静置条件为温度4～15℃、时间0.5～2小时，优选的静置条件为8℃静置1小时。
所述的戊二醛加入量为10～30mmol/l，优选20mmol/l；搅拌温度为28～32℃；搅拌速度为50～150rpm，优选100rpm；搅拌时间1～3小时，优选2小时。
步骤3)中，向上述步骤2)得到的反应液中加入棘白菌素b，搅拌，使棘白菌素转化为棘白菌素b母核，监测转化体系中棘白菌素b和棘白菌素b母核的浓度，当棘白菌素b浓度不再减少，棘白菌素b母核浓度不再增加时，结束转化。
其中，所述的棘白菌素b溶于二甲亚砜，得到质量浓度为10％的棘白菌素b溶液，使得棘白菌素b的加入量为5～20g/l，优选20g/l，搅拌温度为28～32℃，搅拌速度为50～150rpm，优选150rpm，转化时间为12～48小时，结束转化的指标为hplc检测反应体系中棘白菌素b浓度不再减少，棘白菌素b母核浓度不再增加。
本发明通过添加牛血清白蛋白(bsa)作为交联保护剂，同时控制空气的流量和搅拌速度、时间，形成粒径大小合适的酶聚体，既避免了交联酶聚体粒径过大使得内部的酶分子不能很好地和底物接触，又避免了酶分子过多暴露在有机溶剂体系中导致失活。本发明脱酰酶交联后酶活更高。本发明成本低廉，操作简便，大幅提高转化速度和酶的稳定性，降低分离纯化的成本。
具体实施例
在下面将对本发明进行详细描述。然而，本发明可能具体体现为许多不同的形式，而且它不应该被局限于此处所描述的实施例中，提供这些实施例中的目的是使所披露内容更完整与全面。所用试剂和原料，除了提供制备方法的除外，其余均为市售。除非另有定义，否则本文中所有科技术语具有的含义与权利要求主题所属技术领域人员通常理解的含义相同。
实施例1产脱酰酶菌株的发酵及粗酶制备
菌种：白色链霉菌(streptomycesalbus)，保藏号：atcc21725；-80℃冷冻管保存；
种子培养基：热炸黄豆饼粉0.5％(w/v，下同)，酵母粉0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，ph约6.8～7.2，30℃培养1～2天；
发酵培养基：热炸黄豆饼粉1％，酵母粉1％，蛋白胨1％，葡萄糖3％，氯化钠0.5％，七水硫酸镁0.2％，磷酸氢二钾0.1％，ph约6.8～7.2，30℃培养2～3天；
将白色链霉菌基因工程菌株接种于种子培养基，30℃培养1～2天，然后按照发酵体积的5％接种于发酵培养基，30℃培养2～3天；
发酵完成后，将发酵液过滤得到上清液，按照上清液体积的50％加入硫酸铵，通入空气，每分钟流量相当于料液体积的20％，同时搅拌30分钟，8℃静置12小时，过滤收集沉淀，得到粗酶。
实施例2脱酰酶交联转化生产棘白菌素b母核
在反应罐内配制磷酸盐缓冲液1000l，含磷酸二氢钾2.24g/l和磷酸氢二钠1.24g/l，用盐酸或氢氧化钠调节ph为6.0。
向磷酸缓冲液中加入20kg粗酶，2kg牛血清白蛋白(bsa)，通入空气，每分钟流量为200l，同时搅拌30分钟，搅拌速度为80rpm，8℃静置1小时。
向反应液中加入戊二醛20mmol/l，30℃搅拌2小时，搅拌速度为100rpm。
向反应液中加入含有20kg棘白菌素b的10％棘白菌素b二甲亚砜溶液，30℃搅拌反应12～48小时，搅拌的速度为150rpm，转化过程中hplc监测转化体系中棘白菌素b和棘白菌素b母核浓度，当棘白菌素浓度不再减少，棘白菌素b母核浓度不再增加时，结束转化。反应液过滤，取滤液hplc定量检测棘白菌素b母核含量，计算摩尔转化率为89.72％。