本发明属于生物医学临床分子检测领域，尤其涉及一种用于braf基因v600e突变检测的引物对、试剂盒及其检测方法。
背景技术：
braf为一种鸟苷酸结合蛋白ras活化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在调节有丝分裂原活化蛋白激酶(mapk)信号通路中发挥重要作用，是最重要的原癌基因之一。mapk信号通路可正常调节细胞生长、分裂和分化,也可因raf家族成员致癌性突变体的形成而引发癌症。其中brafv600突变体的产生显著增强了braf的活性,从而导致癌细胞分裂失控,大约8％的人类肿瘤发生braf突变。braf绝大部分突变形式为brafv600e突变，主要发生于转移性黑色素瘤、结肠癌、肺癌和甲状腺癌中。自2011年首个brafv600e靶向抑制剂批准上市后，有效延长了黑色素瘤患者无进展生存期及总生存期。
液体活检血液检测技术曾被《麻省理工大学科技评论》评选为“2015年十大突破技术”，如今再次变得炙手可热，其通过血液或尿液等对癌症等疾病进行诊断，优势在于可通过非侵入性取样降低活检的危害，能有效延长患者生存期。目前液体活检的主要检测物包括检测血液中游离的循环肿瘤细胞，循环肿瘤dna(ctdna)碎片，循环rna和外泌体等。凭借一管血检测癌症，这是数十年来全球医学界的共同的梦想。液体活检技术试图用各种技术手段从血液里捕捉相关肿瘤信息，从而规避了传统方式需要手术、穿刺取样的局限性。
然而，利用循环游离肿瘤dna来进行早期检测，ctdna中的肿瘤dna的含量非常少,肿瘤dna的浓度常常低于检测极限，常规方法极易出现漏检，得到假阴性结果。因此，如何在brafv600e突变检测中仅留下突变的brafv600edna，使其在pcr过程中突变信号放大，从而减少假阴性结果、提高检测准确性对于本领域而言将是亟需解决的技术问题。
技术实现要素：
本发明提出一种用于braf基因v600e突变检测的引物对、试剂盒及其检测方法，该方法能够在brafv600e突变检测中消除野生型dna，仅留下突变的brafv600edna，从而在pcr过程中突变信号放大，可有效减少假阴性结果、提高检测准确性。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于braf基因v600e突变检测的引物对，包括如seqno.1序列所示的上游引物和如seqno.2序列所示的下游引物。
作为优选，包含如上述技术方案所示的引物对。
作为优选，所述试剂盒包括含有所述引物对的第二试剂盒以及含有与所述引物对配合使用的探针的第一试剂盒，其中，所述探针包括如seqno.3序列所示的正义探针和如seqno.4序列所示的反义探针。
作为优选，所述第一试剂盒还包括pcr反应管、去离子水、dsn缓冲液和未用dsn处理的阴性对照品。
作为优选，所述第二试剂盒还包括pcr反应管、dsn处理后的dna样品和未用dsn处理的阴性dna对照品、phusionhf缓冲液、去离子水、dntp和聚合酶。
本发明还提供了一种利用上述任一项技术方案所述的试剂盒进行braf基因v600e突变检测的方法，包括以下步骤：
将模板dna、正义探针和反义探针加入第一试剂盒中的pcr管中进行pcr反应，具体包括在98℃下反应2min，待模板dna变性后，将温度降至67℃，同时加入1个单位的dsn的缓冲液，混匀后在67℃反应20min后，将温度升高至95℃继续反应20min使dsn失活，得到dsn缓冲液处理后的dna样品；同时，建立不加入1个单位的dsn缓冲液的阴性dna对照品；
将dsn缓冲液处理后的dna样品或阴性dna对照品、引物对、phusionhf缓冲液、去离子水、dntp和聚合酶加入第二试剂盒中的pcr管中进行聚合酶链反应，分别得到聚合酶链产物。
作为优选，利用所述第一试剂盒进行pcr反应时，各反应物具体加入以下体积，共计10μl：
作为优选，利用所述第二试剂盒进行聚合酶链反应时，各反应物具体加入以下体积，共计25μl：
聚合酶链反应的条件为：98℃反应2min,随后以98℃10sec,58℃20sec和72℃10sec循环45次，最后在72℃反应5min。
作为优选，还包括利用pcr纯化试剂盒对所得到的聚合酶链产物分别进行纯化，然后利用桑格序列对其进行分别测序的步骤。
本发明还提供了一种如上述技术方案所述的引物对和所述的试剂盒在braf基因v600e突变检测中对突变信号进行放大中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明所提供的braf基因v600e突变检测试剂盒中通过设计了有针对性的引物对以及与该引物对相匹配的探针，使得样品在经过dsn处理后,可有效消除野生型的dna，仅保留突变的brafv600edna，使其在pcr反应中能够将突变信号进行放大，这样可大大减少假阴性结果,增加检测的准确性，从而对甲状腺癌、结直肠癌、肺癌以及转移性黑色素瘤患者中具有brafv600e突变的患者进行用药指导。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的dsn缓冲液处理后的dna样品和阴性dna对照品在突变频率为5％时的试验结果；
图2为本发明实施例所提供的dsn缓冲液处理后的dna样品和阴性dna对照品在突变频率为1％时的试验结果；
图3为本发明实施例所提供的dsn缓冲液处理后的dna样品和阴性dna对照品在突变频率为0.1％时的试验结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例所提供的用于braf基因v600e突变检测的引物对、试剂盒及其检测方法的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
材料说明：
模板dna:由于brafv600edna从人体中极难获得，因此本发明实施例中所使用的模板dna为catalogid:hd238,brafv600ereferencestandard。
1、引物对：
上游引物：brafv600epcrf:accatccacaaaatggatccag(seqno.1)
下游引物：brafv600epcrr:atttcttcatgaagacctcacag(seqno.2)
2、探针：
正义探针：brafv600eantisense_2probe:cccactccatcgagatttcactgta(seqno.3)
反义探针：brafv600esense_2probe:tttggtctagctacagtgaaatctcg(seqno.4)
3、试剂盒：
第一试剂盒：正义探针、反义探针、pcr反应管、去离子水、dsn缓冲液和未用dsn处理的阴性对照品；
第二试剂盒：上游引物、下游引物、pcr反应管、dsn处理后的dna样品和未用dsn处理的阴性dna对照品、phusionhf缓冲液、去离子水、dntp和聚合酶。
检测方法：
取第一试剂盒，对模板dna进行处理，体系如下：
具体的，将模板dna、正义探针和反义探针加入到pcr管中进行pcr反应，具体为在98℃下反应2min让模板dna变性，将温度降至67℃，此时pcr管仍放置在pcr仪中不取出，加入1个单位的dsn(dsnevrogen,ea001)的缓冲液，混匀后在67℃反应20min后，将温度升高至95℃继续反应20min使dsn失活，得到dsn缓冲液处理后的dna样品。
该步骤非常规pcr反应，正义探针和反义探针会分别结合到相应的模板dna上，通过形成让dsn识别的靶向物来进行分解。其中，去离子水的加入量可根据模板dna的加入量进行调整，例如加入了1μl的模板dna,那就加入6μl去离子水,让最终的反应体系保持在10μl。
同时，建立不加入1个单位的dsn的阴性dna对照品；
将dsn缓冲液处理后的dna样品、引物对、phusionhf缓冲液、去离子水、dntp和聚合酶加入第二试剂盒中的pcr管中进行聚合酶链反应，得到聚合酶链产物；同时，将dsn缓冲液处理后的dna样品替换为阴性dna对照品，制作得到阴性dna对照品的聚合酶链产物。二者反应体系如下：
聚合酶链反应的执行条件为：98℃反应2min,随后以98℃10sec,58℃20sec和72℃10sec循环45次，最后在72℃反应5min。
该步骤中，由于购买的聚合酶包装不同，分为1unit/μl和10unit/μl,因此需要根据加入的聚合酶的体积来调整水的体积,使最终的反应体系在25μl。
纯化方法：
利用qiaquickpcr纯化试剂盒(qiagen，28104)对所得到的两个聚合酶链产物分别进行纯化，然后利用sanger测序对其进行分别在突变频率为5％、1％以及0.1％时进行测序，得到的结果如图1-3所示。
结果分析：
结合图1-3给出的sanger测序结果可知，在突变频率为5％和1％时,阴性dna对照中的框架中的碱基还是野生型的,为a,但是在dsn处理后的dna样品中,野生型的dna则被消除,而突变的碱基信号被放大,因此可看到t。对于在突变频率为0.1％的样品中,框架中的碱基虽为野生型的a没有变成t，但在图3中还是能看到一个突起的红色代表t的峰值，而这个峰值在阴性对照中是完全看不到的。通常情况下，sanger测序当突变频率低于10％时就检测不到了，而高通量测序可以发现的微量突变低至0.1％，但是很难区分是否是假阳性。所以，若将样品先经过dsn处理，尽管在sanger测序中的突变峰值不高，但此时再用高通量测序的方法来检测，则会很容易得出，且不存在假阳性问题。
序列表
<110>青岛普泽麦迪生物技术有限公司
<120>一种用于braf基因v600e突变检测的引物对、试剂盒及其检测方法
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