本发明涉及一种同时检测4种火龙果病毒的rt-pcr方法，属于植物病毒检测领域。
背景技术：
火龙果是近年来国内广泛引种推广的亚热带水果，目前在台湾、海南、广东、广西、云南、四川、福建等省份已经形成一定的种植规模。不过，由于长期采用扦插繁殖的种苗生产方式，病毒从母株直接传播给种苗，从而导致国内火龙果病毒发生严重。目前已知国内有5种马铃薯x病毒属的成员：火龙果x病毒（pitayavirusx）、蟹爪兰x病毒（zygocactusvirusx）、仙人掌x病毒（cactusvirusx）、仙人掌x病毒-ntu（cactusvirusx-ntu）和树栖仙人掌x病毒（schlumbergeravirusx）能够侵染危害火龙果，导致植株茎表面出现系统性斑驳、黄化、褪绿和茎段畸形，植株长势较弱，并且果实小、产量下降等症状，影响果农的经济收益。
这4种病毒均属于马铃薯x病毒，基因组间的序列同源性达70%以上，采用rt-pcr方法进行检测时，需要选择特异性高的扩增引物，并且严重控制退火温度才能有效扩增目标病毒基因片段。目前已经有分别针对这5种病毒进行单独检测的rt-pcr检测方法，能够较好的检测病毒的感染情况，但是每检测一种病毒就要单独配制pcr检测体系、进行特定的pcr扩增程序和采用一次电泳分析，不仅步骤繁琐、效率低，而且试剂和人力成本较高，极大影响这些检测技术的推广。本发明专利提供了一套快速高效，并能够同时检测火龙果x病毒（pitayavirusx）、蟹爪兰x病毒（zygocactusvirusx）、仙人掌x病毒（cactusvirusx）、仙人掌x病毒-ntu（cactusvirusx-ntu）的rt-pcr方法，通过常规rna提取、cdna合成，采用本发明的检测引物混合物在1只pcr管同时进行4种病毒基因片段的二温式pcr扩增，通过低廉的琼脂糖凝胶电泳可以判断1个样品受4种病毒侵染的情况。通过本发明的方法可以缩短检测时间、节约试剂和人力成本，为火龙果病毒的检测、防治提供技术保障。
技术实现要素：
基于常规rt-pcr技术单次实验检测只能判断1种病毒的感染情况，本发明根据4种病毒基因序列的保守性设计4条病毒特异性正向引物和1条通用反向引物，建立了一套能够同时检测4种火龙果病毒的rt-pcr方法，实现节约检测成本和时间的目的。为病毒的快速鉴定、乃至病毒防治提供技术保障。本发明的方案如下：
本发明共采用5条高退火温度的特异性引物，其特征在于5条引物序列如下：cvxntuf：gcaacacccggactatgccatccc；cvxf：ggagtccacccatctttgtccttttc；zyvxf：cttccagacactaactgcagctcagc；pivxf：attcaaaggcaattctgctaccctggga；pivirr：gttggaaccctgtgggaggctac。其中引物cvxnuf对应仙人掌x病毒ntu基因的5393位点；cvxf对应仙人掌x病毒基因的5588nt位点；zyvxf对应蟹爪兰x病毒基因的5909nt位点；pivxf对应火龙果x病毒基因的6138nt位点；pivirr与4种病毒互补。
本发明采用二温式pcr进行基因扩增，其特征在于采用的退火和延伸温度均为68-70℃,时间为1分钟。
如权利要求1所述，本发明使用的混合引物配比，其特征在于根据扩增片段的长度进行调整，4条正向引物间的比例为1:1到1:5之间。通过优化从而保证了cvx和cvxntu2种病毒长片段的有效扩增。
具体实施方式
实施例1：
一种同时检测4种火龙果病毒的rt-pcr方法，包括以下步骤：
1、多重rt-pcr引物的设计合成：
从genbank下载4种病毒的基因序列，通过比对分析，选择仙人掌x病毒ntu基因的5393位点；仙人掌x病毒基因的5588nt位点；蟹爪兰x病毒基因的5909nt位点；火龙果x病毒基因的6138nt位点等4个位点均为病毒特有的保守序列区作为正向引物；选择位于3’utr的设计反向通用引物pivirr，该位点均与4种病毒互补。
2、rna提取和cdna合成：采用常规的实验方式实现rna的提取和cdna的合成。
4、同时检测4种火龙果病毒rt-pcr方法的建立：以反转录得到的cdna作为模板进行pcr反应，总体积为25μl，其中模板1μl，4条正向引物混合物（优化比例混合）和1条反向引物(10μm)各1μl，其它采用常规体系。pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火并延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸5min。扩增产物检测：取6μlpcr产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶成像分析系统观察。通过电泳可以在样品泳道的1300bp、1000bp、700bp和400bp位置得到目标扩增条带。
5、正向引物混合物优化比例：采用不同比例的4条正向引物进行混合，对cdna进行扩增，通过电泳分析表明cvxntuf和cvxf浓度要高于其它2条引物（cvxntuf：cvxf：zyvxf：pivxf=1.8:1.6:1.1:1），可以较好防止pcr扩增片段偏好性，有效扩增1300bp和1000bp的扩增条带。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
1.一种同时检测4种火龙果病毒的方法，其特征在于采用高退火温度的特异性引物混合物扩增4种病毒的特定基因片段；采用二温式pcr进行基因扩增；得到1300bp、1000bp、700bp和400bp大小差异明显的4条扩增条带。
2.如权利要求1所述，本发明共采用5条高退火温度的特异性引物，其特征在于5条引物序列如下：cvxntuf：gcaacacccggactatgccatccc；cvxf：ggagtccacccatctttgtccttttc；zyvxf：cttccagacactaactgcagctcagc；pivxf：attcaaaggcaattctgctaccctggga；pivirr：gttggaaccctgtgggaggctac。
3.如权利1所述，本发明采用的引物cvxntuf对应仙人掌x病毒ntu基因的5393位点；cvxf对应仙人掌x病毒基因的5588nt位点；zyvxf对应蟹爪兰x病毒基因的5909nt位点；pivxf对应火龙果x病毒基因的6138nt位点；pivirr与4种病毒互补。
4.如权利要求1所述，本发明采用二温式pcr进行基因扩增，其特征在于采用的退火和延伸温度合并为一个步骤，设定温度为68-70℃。
5.如权利要求1所述，本发明使用的混合引物配比是为保证长片段的有效扩增，其特征在于根据扩增片段的长度进行调整，比例为1:1到1:5之间。