甘蓝型油菜半矮杆性状位点的分子标记及其应用的制作方法

本发明为植物育种领域，具体涉及油菜半矮杆位点及与半矮杆位点的紧密连锁分子标记bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478及其应用。

背景技术：

植物的株型结构是指植物在空间上的三维结构(reinhardt&kuhlemeier,2002)，株高、分枝高、分枝夹角、叶型等性状对株型结构的建立起着关键的作用(yusenetal.,2018；caietal.,2016)。株高是理想株型育种和作物产量最重要的目标之一，降低株高可以有效地提高作物的抗倒伏能力、耐肥能力、收获指数和经济系数，从而提高作物品质和产量(heddenetal.,2003)。20世纪50至70年代，半矮秆小麦、水稻品种的育成在世界范围内掀起了以矮杆基因利用为主要标志的绿色革命(winkleretal.,1994)。因此，矮杆/半矮杆作物品种选育是作物育种的十分重要的内容。

甘蓝型油菜(brassicanapus)是最重要的油料作物之一。理想的油菜株型结构是指有着半矮杆性状(植株高度为120-140厘米)、较小的分支夹角(<30°)和高密度的向上生长的中等长度的角果(fuetal.,2008)。随着甘蓝型油菜杂交品种的推广和化肥的广泛应用，油菜的平均株高增加了20cm以上，减少了油菜耐肥能力、提高了倒伏风险(foissetetal.,1995)，油菜倒伏问题已经成为制约油菜产量、品质提高和机械化收获的重要因素(barretetal.,1998)。降低株高是克服甘蓝型油菜倒伏问题和提高产量的重要途径。培育矮杆油菜品种，就需要恰当的油菜矮杆种质资源，并且开发相应的分子标记，作为育种手段，提高育种效率。

油菜的株高调控机制比较复杂，大多数是受多基因控制。经过人工ems诱变和自然突变，已获得多个矮杆突变体，并进行了遗传研究。如fossit等(1995)利用ems诱变甘蓝型油菜品种primor获得矮杆突变体bzh，经遗传研究发现，该突变体的矮杆基因受一对加性效应基因控制。“矮源1号”是江苏省农科院从澳大利亚太平洋种子公司引进的一个矮杆品种，该品种在成熟期的株高仅为24cm左右，经遗传研究发现，其矮杆性状受一个显性基因控制(浦惠明等，1995)。梅德圣等(2006)在育种中发现了矮杆突变体99cdam，经遗传研究发现，该突变体的矮杆基因受3对隐性基因控制，并存在细胞质母体效应。向阳等(2016)在甘蓝型油菜品系2301中发现矮杆突变体grc1157，株高在成熟期仅为80cm左右。zeng等(2011)利用ems诱变甘蓝型油菜育种材料t6得到矮杆突变体bnc.dwf，该突变体的株高在成熟期仅为95cm，对外源赤霉素不敏感，经遗传研究发现bnc.dwf的矮化性状受一个显性基因控制。矮杆突变体bndwf1和bndwf1/dcll均由ems诱变甘蓝型油菜纯系nj7982获得，wang等(2016)经遗传研究发现两个新主效位点bndwf1和bndwf/dcl1，均由1对显性基因控制，bndwf1/dcll的株高在成熟期仅为40cm左右，bndwf1的株高在成熟期仅为80cm左右。

尽管学者们也对油菜矮秆性状遗传和育种，作了一些积极的探索，但矮杆/半矮杆油菜育种还没有取得突破，还需要继续开发控制油菜矮杆/半矮杆性状的新主效位点及其分子标记，为油菜矮化育种提供基础。开发油菜矮杆/半矮杆新主效位点的紧密连锁分子标记，可以在油菜苗期筛选矮化基因型，提高选择效率，还可以在分离世代提高选择的准确性。因此，油菜株高的主效位点的紧密连锁的分子标记开发和应用是油菜矮化育种的关键技术。

本发明发现了一个控制甘蓝型油菜半矮杆性状的新主效位点，并且发展了其紧密连锁的分子标记技术。

技术实现要素：

本发明的目的是提供位于甘蓝型油菜a05染色体上控制油菜半矮杆性状的新位点。

本发明的另一目的是提供甘蓝型油菜半矮杆性状新基因位点的分子标记bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478引物对。

本发明的又一个目的是提供甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478或其引物对在检测所述的半矮杆油菜及选育半矮杆油菜品种中的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一个控制油菜半矮杆位点bnud1，所述bnud1位点位于甘蓝型油菜a05染色体上bnaa05:11341200bp-11424391bp。所述的紧密连锁标记bna05sd405位于甘蓝型油菜a05染色体上11371008bp-11371206bp；所述的紧密连锁标记bna05sd425位于甘蓝型油菜a05染色体上11349493bp-11349757bp；所述的紧密连锁标记bna05sd473位于甘蓝型油菜a05染色体上11361654bp-11361868bp；所述的紧密连锁标记bna05sd478位于甘蓝型油菜a05染色体上11419494bp-11419733bp。所述的紧密连锁标记bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示。

本发明所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478，这四个紧密连锁的分子标记的上游引物序列分别为seqa05sd405-f、seqa05sd425-f、seqa05sd473-f和seqa05sd478-f，下游引物序列分别为seqa05sd405-r、seqa05sd425-r、seqa05sd473-r和seqa05sd478-r，其中

seqa05sd405-f的序列如seqidno.5所示；

seqa05sd405-r的序列如seqidno.6所示；

seqa05sd425-f的序列如seqidno.7所示；

seqa05sd425-r的序列如seqidno.8所示；

seqa05sd473-f的序列如seqidno.9所示；

seqa05sd473-r的序列如seqidno.10所示；

seqa05sd478-f的序列如seqidno.11所示；

seqa05sd478-r的序列如seqidno.12所示。

其序列为：

seqa05sd405-f：atgagctgcggttgtgaa(5’-3’)

seqa05sd405-r：cattaggcggtcctgagat(5’-3’)

seqa05sd425-f：ggcaatcctcccacaaga(5’-3’)

seqa05sd425-r：cgcacaaaacttttcaacatt(5’-3’)

seqa05sd473-f：acaccatttattatctttgcac(5’-3’)

seqa05sd473-r：ggaggagcctgagtcttg(5’-3’)

seqa05sd478-f：ttgaaaagtcaacggtttg(5’-3’)

seqa05sd478-r：tttggattcggttagcat(5’-3’)

本发明所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478，在含所述的甘蓝型油菜半矮杆性状位点的品种和种质检测中的应用。

本发明所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478在选育半矮杆油菜品种和种质中的应用。

本发明所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478引物对，这四个紧密连锁的分子标记的上游引物序列分别为seqa05sd405-f、seqa05sd425-f、seqa05sd473-f和seqa05sd478-f，下游引物序列分别为seqa05sd405-r、seqa05sd425-r、seqa05sd473-r和seqa05sd478-r。

seqa05sd405-f的序列如seqidno.5所示；

seqa05sd405-r的序列如seqidno.6所示；

seqa05sd425-f的序列如seqidno.7所示；

seqa05sd425-r的序列如seqidno.8所示；

seqa05sd473-f的序列如seqidno.9所示；

seqa05sd473-r的序列如seqidno.10所示；

seqa05sd478-f的序列如seqidno.11所示；

seqa05sd478-r的序列如seqidno.12所示。

本发明所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478引物对，在含所述的甘蓝型油菜半矮杆性状位点的品种和种质检测中的应用。

本发明所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478引物对在选育半矮杆油菜品种和种质中的应用。

一种利用本发明所述分子标记或引物对检测半矮杆甘蓝型油菜的方法，利用本发明所述的引物对扩增油菜基因组dna，扩增产物在40％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，检测是否获得亲本njau5737的扩增片段。如果获得亲本njau5737的扩增片段，则表明存在本发明所述的半矮杆油菜。

一种利用本发明所述分子标记或引物对选育半矮杆甘蓝型油菜品种的方法，优选用所述bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478引物对扩增油菜基因组dna，扩增产物在40％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，检测是否获得njau5737的扩增片段。如果获得njau5737的扩增片段，则表明存在本发明所述的甘蓝型油菜半矮杆位点，预测该油菜是半矮杆油菜。如果获得亲本zs11的扩增片段，则表明存在本发明所述的甘蓝型油菜高杆位点，预测该油菜是高杆油菜。

本发明甘蓝型油菜半矮杆基因连锁的分子标记是通过下列步骤筛选的：

(1)遗传群体构建：在自交多代的甘蓝型油菜品系中发现一株矮杆突变体njau5737，利用njau5737与常规优良品种中双11杂交，得到杂种f1，f1与中双11回交多代，得到bc5、bc6，bc5连续自交分别得到bc5f2、bc5f3，对f1、bc5、bc6、bc5f2和bc5f3进行表型调查；

(2)甘蓝型油菜bc6、bc5f2和bc5f3群体表型测定：对上述bc6、bc5f2和bc5f3群体中共2193个单株进行表型观察以及农艺性状调查；

(3)snp芯片分析：选择bc5群体中的8个半矮杆单株和回交亲本zs11以及亲本njau5737一起，作snp芯片分析，分析回交得到的半矮杆与轮回亲本zs11之间的遗传差异。结果得到bnud1位点的三个候选区段，分别位于a05、c02、c07染色体上。

(4)根据snp分析得到的三个区段序列设计ssr引物，利用bc6、bc5f2群体，将控制甘蓝型油菜半矮杆性状的bnud1位点定位于a05染色体上，定位区间位于10139922-13976417bp的区段内。

(5)利用油菜a05染色体10139922-13976417bp的ssr信息，设计分子标记，采用joinmap4.0作图软件构建连锁图谱，将bnud1位点精细定位于11341200-11424391bp的区段内；

(6)根据bc5f3群体表型数据和分子标记数据，发现紧密连锁共显性分子标记bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478，而且其遗传带型清晰可见。

有益效果：

本发明在国际上首次鉴定了一个位于甘蓝型油菜a05染色体11341200-11424391bp区域内控制甘蓝型油菜半矮杆位点，同时发现与半矮杆位点紧密连锁的共显性分子标记bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478，这些分子标记在bc5、bc6、bc5f2和bc5f3群体的表现使其在甘蓝型油菜半矮杆育种中具有非常重要的价值。

1、首次鉴定了一个位于甘蓝型油菜a05染色体11341200-11424391bp区域内控制甘蓝型油菜半矮杆位点，同时发现与半矮杆位点紧密连锁的共显性分子标记bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478；

2、在bc5、bc6、bc5f2和bc5f3群体中，甘蓝型油菜半矮杆性状与这四个分子标记呈极显著相关，bc5、bc6、bc5f2和bc5f3单株基因型和表型一致，因此这四个分子标记在今后的半矮杆油菜辅助选择育种中具有巨大的应用前景；

3、本发明能够在甘蓝型油菜中找到纯合半矮杆油菜，对矮杆/半矮杆株型育种有很大帮助。

附图说明

图1：半矮杆油菜表型图。

图2：分子标记bna05sd405对bc5f3部分单株基因分型；其中1为njau5737扩增带型，2为zs11扩增带型，6、9和12为高杆油菜扩增带型，4为纯合半矮杆油菜扩增带型，3、5、7、8、10和11为杂合半矮杆扩增带型。

图3：分子标记bna05sd425对bc5f3部分单株基因分型；其中1为zs11扩增带型，2为njau5737扩增带型，7、8、10、11和12为高杆油菜扩增带型，6和9为纯合半矮杆油菜扩增带型，3、4和5为杂合半矮杆油菜扩增带型。

图4：分子标记bna05sd473对bc5f3部分单株基因分型；其中1为njau5737扩增带型，2为zs11扩增带型，5和9为纯合半矮杆油菜扩增带型，12为高杆油菜扩增带型，3、4、6、7、8、10和11为杂合半矮杆油菜扩增带型。

图5：分子标记bna05sd478对bc5f3部分单株基因分型；其中1为zs11扩增带型，2为njau5737扩增带型，9为纯合半矮杆油菜扩增带型，3、5和12为高杆油菜扩增带型，4、6、7、8、10和11为杂合半矮杆油菜扩增带型。

具体实施方式

下面结合说明书附图对本发明创造作进一步说明。

实施例1

甘蓝型油菜半矮杆位点的获得：

(1)遗传群体构建

利用两个甘蓝型油菜材料“njau5737”与中双11进行杂交，得到杂种f1，f1与zs11回交多代，得到bc5、bc6，bc5连续自交分别得到bc5f2、bc5f3。

(2)甘蓝型油菜bc6、bc5f2和bc5f3群体表型测定：对上述bc6、bc5f2和bc5f3群体中共2193个单株进行表型观察以及农艺性状调查；半矮杆油菜表型图如图1所示。

(3)snp芯片分析：选择bc5群体中的8个半矮杆单株和回交亲本zs11以及亲本njau5737一起，作snp芯片分析，分析回交得到的半矮杆与轮回亲本zs11之间的遗传差异。结果得到bnud1位点的三个候选区段，分别位于a05、c02、c07染色体上。

(4)根据snp分析得到的三个区段序列设计ssr引物，利用bc6、bc5f2群体，将控制甘蓝型油菜半矮杆性状的bnud1位点定位于a05染色体上，定位区间位于10139922-13976417bp的区段内。

(5)利用油菜a05染色体10139922-13976417bp的ssr信息，设计分子标记，采用joinmap4.0作图软件构建连锁图谱，将bnud1位点精细定位于11341200-11424391bp的区段内；

实施例2

甘蓝型油菜半矮杆位点紧密分子标记的获得：

(1)分子标记开发

本研究利用snp和ssr标记将矮秆位点定位在油菜a05染色体的11341200-11424391bp区段内，下载油菜参考基因组序列，利用ssrhunter1.3软件查找ssr位点，在其上下游各增加150bp设计引物，采用primerpremier5.0软件在bnaa05:11341200-11424391bp区域内设计多个分子标记。

(2)bc5f3群体分子标记鉴定

采用ctab法提取bc5f3群体油菜材料叶片的基因组dna，pcr反应体系(10ul)，其中含有0.5uldna模板、上、下游引物(1mmol/l)各0.25ul、5ulmix，和4ulddh2o。pcr反应程序：95℃变性5min；随后进行35个循环的95℃变性30s，tm值退火30s，72℃延伸30s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。pcr扩增产物用40％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。胶片在bio-radvisadoc3.0(bio-rad，usa)成像系统中扫描分析。

(3)结果与分析

在设计的多个分子标记中，bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478分子标记与表型一致性达到99％，认为这四个分子标记与甘蓝型油菜半矮杆位点是紧密连锁。在bc5f2和bc5f3群体中这四个紧密连锁分子标记分别有三种带型，bna05sd405条带大小分别为199bp，181bp和同时拥有两条带，拥有199bp带型的单株是纯合半矮杆单株(121.94±6.56cm)，拥有181bp带型的单株是高杆油菜(168.74±12.14cm)，同时具有199bp与181bp条带的为半矮杆杂合体(147.68±11.84cm)；bna05sd425条带大小分别为265bp，247bp和同时拥有两条带，拥有247bp带型的单株是纯合半矮杆单株(121.94±6.56cm)，拥有265bp带型的单株是高杆油菜(168.74±12.14cm)，同时具有265bp与247bp条带的为半矮杆杂合体(147.68±11.84cm)；bna05sd473条带大小分别为221bp，215bp和同时拥有两条带，拥有215bp带型的单株是纯合半矮杆单株(121.94±6.56cm)，拥有221bp带型的单株是高杆油菜(168.74±12.14cm)，同时具有221bp与215bp条带的为半矮杆杂合体(147.68±11.84cm)；bna05sd478条带大小分别为264bp，240bp和同时拥有两条带，拥有240bp带型的单株是纯合半矮杆单株(121.94±6.56cm)，拥有264bp带型的单株是高杆油菜(168.74±12.14cm)，同时具有264bp与240bp条带的为半矮杆杂合体(147.68±11.84cm)。这四个紧密连锁的分子标记的上游引物序列分别为seqa05sd405-f、seqa05sd425-f、seqa05sd473-f和seqa05sd478-f，下游引物序列分别为seqa05sd405-r、seqa05sd425-r、seqa05sd473-r和seqa05sd478-r。

实施例3

紧密连锁分子标记在半矮杆油菜选择上的应用：

(1)双亲本基因组扩增检测

用于验证半矮杆油菜亲本分别为亲本“njau5737”(bna05sd405等位条带为181bp；bna05sd425等位条带为247bp；bna05sd473等位条带为215bp；bna05sd478等位条带为240bp，株高为121.94±6.56cm)，亲本zs11(bna05sd405等位条带为199bp；bna05sd425等位条带为265bp；bna05sd473等位条带为221bp；bna05sd478等位条带为264bp，株高为168.74±12.14cm)，如图2-5所示。

(2)群体扩增检测及标记分析

用以上两个亲本进行杂交，得到f1代种子种植后长成一个f1代单株，其与zs11进行回交多代，分别得bc5、bc6家系群体，bc5家系群体连续自交两代分别得到bc5f2和bc5f3家系群体。对bc6、bc5f2和bc5f3家系群体单株进行农艺性状测定和表型调查。

采用ctab法分别提取每份bc6、bc5f2和bc5f3单株叶片的基因组dna。pcr反应体系(10ul)，其中含有0.5uldna模板、上、下游引物(1mmol/l)各0.25ul、5ulmix，和4ulddh2o。pcr反应程序：95℃变性5min；随后进行35个循环的95℃变性30s，tm值退火30s，72℃延伸30s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。pcr扩增产物用40％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。胶片在bio-radvisadoc3.0(bio-rad，usa)成像系统中扫描分析。分析bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478在亲本njau5737和zs11的条带类型。

(3)结果与分析

在njau5737和zs11的杂交组合后代bc6、bc5f2和bc5f3因型的检测中，发现bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478分子标记与表型一致性达到99％。结果表明了用bna05sd405、bna05sd425、bna05sd473和bna05sd478分子标记预测油菜高矮杆有较好的预测效果。

序列表

<110>南京农业大学

<120>甘蓝型油菜半矮杆性状位点的分子标记及其应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>308

<212>dna

<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

<400>1

ggtgatgagctgcggttgtgaacttcaagcaatgtgatgaactccaagaggttggtcata60

ctctcttgttatagaagttatagatattagaatatgtcttccattctattttaatttggt120

atcttgtgttctagctttttttcatattgcatatatatactccatcctatcgacgactat180

tgacatctcaggaccgcctaatgcatatgtaagcccaagttcactaatacataccgaaga240

ataaagacaactaacttgggcccaatttcaaatatgcacaaaggtccacctaaatagttg300

agggtatg308

<210>2

<211>309

<212>dna

<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

<400>2

gtcaattgtatatactttgtaaagtcaccatgagggcaatcctcccacaagagagcatat60

atgatcgttgatttgaatatgccatatactacccttcatatcaagtcgagaaccatcgaa120

cttaaaatgattttggcaatcttacaaattatcatcatctttgctctaataccgttttta180

gtttttaagaaaattaagctcatgtccaactatatctttttttttgtcaacatgtccaac240

tatatctattagtgtaaaataattatcagattttatagaatgttgaaaagttttgtgcgt300

aactttagt309

<210>3

<211>309

<212>dna

<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

<400>3

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atctttgcactacaccatctctagtttcttctaaaccaaattaaagaaaaaaagtaaatg120

aaaaagtaaatagaaaagcataacaatttatcttcttctttgtttctcgatttcagattc180

cagattgagtaaatgttttaaaaaaccaaattagatgagaaatccacccatcttttgtct240

ttcaccaagactcaggctcctcctccatcataggacacgtctctcaccgaaaataattat300

cgtggtttt309

<210>4

<211>309

<212>dna

<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

<400>4

gaataggttatcactatgtgtacgtgttttgaaaagtcaacggtttgtattcatttcaac60

tccataatacagcaaaaggtaaagttgtcgaaaaataacactcggatacatgcgtttaag120

ttcggtaggaatgcactagtttgcgttgtagttgttgttggtcacaattatgggtaatta180

ggtgttgtttgcacaaaaaaaaggtgttgcgctcgttttaatatcaaacattttataatt240

caataagcatatgctaaccgaatccaaataaaaatatataaaaagagaaaacgtcctctc300

gtttacaag309

<210>5

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<212>dna

<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

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atgagctgcggttgtgaa18

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cattaggcggtcctgagat19

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<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

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<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

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<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

<400>11

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<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

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