小麦成株期抗条锈病基因相关SNP分子标记及其引物和应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及小麦成株期抗条锈病基因相关snp分子标记及其特异性引物和应用。

背景技术：

小麦作为我国重要的粮食作物，其质量和产量直接关系到国家粮食安全问题。由条型柄锈菌(pucciniastriiformiswestend.f.sp.tritici，pst)可随高空气流远距离传播，由其引起的小麦条锈病是对小麦危害程度最重的典型气传病害之一，具有暴发性强、流行速度快、危害程度重的特点。中国是世界上小麦条锈病发生面积最大且相对独立的小麦条锈病流行区，常年主要发生地有四川、贵州、甘肃、陕西、云南、宁夏、河南、山西等地。一般流行年份可使小麦减产20％～30％，严重时高达50％以上，甚至绝收，严重影响了我国小麦的生产。

我国小麦条锈病抗病育种面临着严峻局面，一方面条锈菌变异速度快、强毒性生理小种流行范围不断扩大且主栽品种或骨干亲本完全丧失抗性；另一方面，目前的主栽品种抗性遗传基础狭隘、可利用的条锈病抗性基因有限。这一现状已经构成小麦抗条锈病育种的瓶颈。我国在小麦条锈病防治方面也采取过许多防治策略，大多采用药剂拌种和抗锈良种相结合的方法。虽然传统的药剂防治可以从一定程度上减轻条锈病的危害，但是大量使用农药不仅增加了生产成本，还会对生态环境和人类健康产生很大的威胁。因此，发掘和鉴定抗条锈病新基因才是育种工作的基础，也是解决条锈病抗性基因丢失这一难题的根本途径。

随着分子生物学和生物技术的快速发展，分子标记技术在育种中的应用越来越广泛。dna分子标记技术具有不受环境和植物生长发育影响的特点，结合传统田间抗病鉴定可在育种早期对植株的抗病性能进行综合分析，快速有效地进行育种选择，从而缩短育种进程，提高育种效率。目前主要在植物育种中应用的有rapd、rflp、aflp、ssr、snp等分子标记技术。snp，即单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism)，是指基因组内单个碱基的插入、转换、颠换、缺失或小片段序列的突变等，能直接反应dna水平遗传的多态性。它的变异来源丰富，分布于整个基因组内，是继第一代分子标记rflp，第二代分子标记ssr后的第三代分子标记，其建立在基因组大量测序或芯片的基础上。

目前snp的检测方法很多，比如：dna芯片检测、dna测序法、变性高效液相色谱法、飞行质谱仪检测等，但大多由于技术繁琐、试验成本高，限制了其在植物育种中的应用。为了更加广泛地检测snp标记，衍生酶切扩增多态性(derivedcleavedamplifiedpolymorphicsequence，dcaps)技术随之兴起，dcaps技术通过特殊的引物，在pcr扩增产物中引入错配碱基，构建限制性内切酶识别位点，从而达到酶切检测snp的目的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供小麦成株期抗条锈病基因相关snp分子标记。

本发明的再一目的在于提供上述分子标记的特异性snp-dcaps引物。

本发明的再一目的在于提供上述分子标记的应用。

本发明的再一目的在于提供鉴定小麦条锈病抗性的方法。

根据本发明具体实施方式的小麦成株期抗条锈病基因相关snp分子标记，所述snp分子标记的核苷酸序列如seqidno.1所示，其中，seqidno.1所示序列的第36位碱基为w，w代表a或g，

seqidno.1:

tatgcagcaatggcacccgctctttaggcaatgcgwccaagagtagctgggactaataatgaatgcactac

根据本发明具体实施方式的小麦成株期抗条锈病基因相关snp分子标记的特异性snp-dcaps引物，所述引物序列如下：

上游引物：5’-cattattagtcccagctactctcgg-3’；

下游引物：5’-ctggacctggcttggttcat-3’。

特异扩增获得琼脂糖凝胶电泳谱带的大小为210bp，定位在小麦5d长臂染色体上，与条锈病抗性基因间的遗传距离为1.35cm。

本发明还提供小麦成株期抗条锈病基因相关snp分子标记的应用，尤其是在小麦辅助育种的应用。

根据本发明具体实施方式的鉴定小麦条锈病抗性的方法，所述方法包括使用小麦成株期抗条锈病基因相关snp分子标记的特异性snp-dcaps引物对待测小麦进行pcr扩增的步骤。

根据本发明具体实施方式的鉴定小麦条锈病抗性的方法，若扩增得到210bp条带，则判断待测小麦为条锈病抗性品种；如未扩增得到210bp条带，则判断待测小麦为条锈病感病品种。

本发明的有益效果：

本发明以酉阳光头麦和avocets为亲本构建的重组自交系群体为遗传作图群体，通过田间小麦成株期条锈病抗性鉴定和snp数据的连锁分析，获得了与小麦成株期抗条锈病基因紧密连锁的snp，该标记与抗性基因遗传距离近，pcr扩增重复性好，稳定性强，可用于小麦抗病育种的分子辅助选择，有利于加快小麦抗病品种的育种进程。

本发明基于此snp开发了snp-dcaps-210bp特异性引物，采用pcr扩增和限制性内切酶酶切，不需要特殊的pcr仪器和特殊的反应试剂，普通实验室均可推广使用。本发明的特异性引物可应用于小麦成株期条锈病抗病品种的辅助选择育种，为克隆小麦抗条锈病基因、基因序列分析以及转抗条锈病基因小麦研究奠定了良好的基础。

附图说明

图1显示snp-dcaps-210bp标记在抗病亲本酉阳光头麦、感病亲本avocets以及它们的ril群体中的pcr扩增结果，其中，l1-l22为ril群体材料编号，m为dnamarker；r为抗病材料表型；s为感病材料表型；“a”为抗病基因型，其酶切产物在210bp处具有特异谱带；“b”为感病基因型，其酶切产物在230bp处具有特异谱带；h为杂合型，其酶切产物具有210bp和230bp两条特异谱带。白色箭头分别表示抗病亲本和感病亲本酶切后在210bp和230bp位置的特征谱带；黑色三角形标注表现为特异分子标记—抗感表型交换；

图2显示snp-dcaps-210bp标记在10份中国地方种质小麦、10份育成品种材料中的pcr扩增结果，其中，箭头表示210bp处的特异扩增条带。

具体实施方式

实施例1获得与小麦成株期抗条锈病基因紧密连锁的snp分子标记

1.1供试材料

植物材料：以四川地方小麦抗病品种酉阳光头麦为母本，感病品种avocets为父本，构建重组自交系作图群体。2018年秋将亲本和ril群体种植于四川农业大学崇州实验基地，用于小麦成株期条锈病抗性表型鉴定。苗期取各株系的叶片，提取dna备用。

条锈病菌混合生理小种：用于ril群体条锈病抗性鉴定的条锈病菌混合生理小种由条中31、32和条中33三个生理小种等量混合组成。

1.2抗性鉴定

田间试验设计：2018年及2019年正季，在四川农业大学崇州实验基地将酉阳光头麦和avocets构建的群体材料单粒播种，设置行长2m，行距20cm，每行播种10粒，每间隔20行设置一行感病对照品种sy95-71，在鉴定圃周围分别种植1行用于条锈病诱发的感病品种sy95-71。

抗性鉴定：当小麦幼苗长至两叶一心时用涂抹法对条锈病诱发感病品种sy95-71进行人工接种。待感病品种sy95-71发病充分后，记录各株系的成株期条锈病抗性。按以下标准进行条锈病抗性鉴定：

免疫(0)：叶片上没有产生任何的症状；

近免疫(0)：叶片上产生小型坏死斑，不产生夏孢子堆；

高抗(1)：叶片上产生坏死斑，坏死斑上零星散生很小的夏孢子堆；

中抗(2)：叶片褪绿或坏死，夏孢子堆中等大小且较少；

中感(3)：叶片连片褪绿，夏孢子堆大型且数量多；

高感(4)：叶片不褪绿，上面着生大量夏孢子堆。

1.3提取基因组dna

采用ctab法提取基因组dna。

用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测dna质量，紫外分光光度计检测dna浓度，并稀释至50ng/μl备用。

1.4获得与小麦成株期抗条锈病基因紧密连锁的snp分子标记

(1)将上述dna测序；

(2)通过分析，得到一个与小麦成株期抗条锈病基因紧密连锁的snp分子标记，其核苷酸序列为：

tatgcagcaatggcacccgctctttaggcaatgcg[a/g]ccaagagtagctgggactaataatgaatgcactac，其中，有一个a/g碱基突变。

实施例2获得与小麦成株期抗条锈病基因连锁的snp-dcaps-210bp分子标记

根据snp分子标记序列，获得与目标序列匹配度100％的小麦dna序列。

利用primer3plus在线软件在snp位点上下游设计引物，共获得4对snp-dcaps引物(突变碱基以下划线标注)，并对其中snp-dcaps-1引物进行了优化，4对引物序列如下：

snp-dcaps-1：上游引物：5’-cattattagtcccagctactctcgg-3’，

下游引物：5’-ctggacctggcttggttcat-3’；

snp-dcaps-2：上游引物：5’-tcgaccgcggattaggtttt-3’，

下游引物：5’-ttacttacacagcaaccaaaggatc-3’；

snp-dcaps-3：上游引物：5’-atcaccagaaacctcaagtgacagc-3’，

下游引物：5’-atcaccagaaacctcaagtgacaac-3’；

snp-dcaps-4：上游引物：5’-acaccttgatgcatggctga-3’，

下游引物：5’-tggttgacatgaagcatgcccatat-3’。

利用引物snp-dcaps-2、snp-dcaps-3和snp-dcaps-4在抗、感病亲本及抗感基因池中进行pcr扩增，并对扩增产物进行酶切及琼脂糖凝胶电泳显示，其酶切产物在抗、感病亲本及抗感基因池均表现出一条相同分子量的酶切产物，说明分子标记snp-dcaps-2、snp-dcaps-3和snp-dcaps-4与抗性基因无连锁关系。

利用优化引物snp-dcaps-1在抗、感病亲本及抗感基因池中进行pcr扩增、酶切和琼脂糖凝胶电泳发现，其酶切产物在抗病亲本和抗病基因池中显示一条分子量为210bp大小的特征谱带，而在感病亲本及感病基因池中缺失该特征谱带，说明利用该引物获得的分子标记snp-dcaps-210bp与抗性基因具有相关性。

分析snp-dcaps-210bp分子标记采用供试材料与抗性鉴定同实施例1，pcr反应反应后，用haeⅲ内切酶进行酶切，酶切产物用2.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离，100v恒定电压下电泳30min后用bio-rad凝胶成像系统进行结果检测和记录，结果如图1所示。

将能被酶切开的210bp处的条带带型(和抗病亲本一致的)赋值为“a”，不能被酶切开的条带带型(和感病亲本一致的)赋值为“b”，两条带型都有的赋值为“h”，条带不清楚或缺失的赋值为“-”。

结果表明，在随机选择的22个ril进行遗传连锁分析发现，在供试的13个抗病株系中(l2、l3、l4、l6、l8、l9、l10、l14、l15、l16、l18、l20和l22)，共有11个株系(l2、l3、l4、l6、l8、l10、l14、l15、l16、l18和l20)表现出一条210bp大小的与抗性亲本酉阳光头麦一致的特征条带；其余2个抗病株系(l9和l22)，其谱带带型则表现为在210bp和230bp同时具有抗病亲本和感病亲本的特征带型，即该带型表现为杂合带型，如图1所示。在供试的9个感病株系中(l1、l5、l7、l11、l12、l13、l17、l19和l21)，共有8个株系(l1、l5、l7、l11、l12、l13、l17和l19)表现出一条230bp大小的与感病亲本avocets一致的特征条带；而另一个感病株系l21则表现为在210bp处与抗病亲本一致的特征谱带，说明该基因在株系l21中发生了重组交换。综上试验结果表明，snp-dcaps-210bp标记与条锈病成株期抗性基因存在连锁关系。

进一步利用该标记对酉阳光头麦/avocets构建的ril群体进行扩增、酶切及琼脂糖分子检测，并将snp标记和条锈病表型进行连锁分析，检测snp位点对表型的关联度和效应值。检测结果显示，本发明的snp-dcaps-210bp标记与小麦成株期条锈病抗性基因连锁紧密，其表型贡献率为38.36％，遗传距离为1.35cm。

实施例3小麦成株期条锈病抗性基因在抗性育种中的应用

3.1供试材料

植物材料：10份中国小麦地方种质(包括新疆稻麦子、玉田稻麦、西藏麦、桑日折达、铁壳麦、五花头、小红芒、小扁穗、金包玉、六棱麦)；10份四川育成品种(包括川麦38、川麦39、川麦41、川麦42、川麦43、绵麦37、绵麦38、绵麦39、绵农7、绵阳26)。2018年正季将上述材料种植于四川农业大学崇州实验基地，用于小麦成株期条锈病抗性鉴定。并于苗期取各材料的叶片备用。

条锈病菌混合生理小种：用于抗性鉴定的条锈病菌混合生理小种由条中31、32和33三个小种等量混合组成。

3.2抗性鉴定

同实施例1。

鉴定结果发现，表现为高抗(1)的有铁壳麦、金包玉、川麦39、绵麦39；表现为中抗(2)的有桑日折达、玉田稻麦、小扁穗、绵麦38、绵农7；表现为中感(3)的有西藏麦、五花头、川麦38、川麦41、川麦42、川麦43；表现为高感(4)的有稻麦子、小红芒、六棱麦、绵麦37、绵阳26。

3.3基因组dna提取

同实施例1。

3.4snp-dcaps-210bp分子标记分析

同实施例2。

结果如图2所示，在抗病亲本、4份中国小麦地方种质(包括桑日折达、铁壳麦、金包玉、六棱麦)能检测到一条210bp的特异带型，而在感病亲本、6份中国小麦地方种质(包括稻麦子、西藏麦、玉田稻麦、五花头、小红芒、小扁穗)和10份与抗病品种酉阳光头麦没有亲缘关系的小麦育成品种(川麦38、川麦39、川麦41、川麦42、川麦43、绵麦37、绵麦38、绵麦39、绵农7、绵阳26)则不能检测到210bp的特异带型。

因此，结合田间表型抗性鉴定结果，从而证实本发明的抗性基因特异分子标记snp-dcaps-210bp可以预测该抗性基因在小麦材料中的存在。

序列表

<110>四川农业大学

<120>小麦成株期抗条锈病基因相关snp分子标记及其引物和应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>71

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>allele

<222>(36)..(36)

<223>w=aorg

<400>1

tatgcagcaatggcacccgctctttaggcaatgcgwccaagagtagctgggactaataat60

gaatgcactac71

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cattattagtcccagctactctcgg25

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ctggacctggcttggttcat20