一种与控制印度南瓜红果皮性状紧密连锁的分子标记、引物及应用的制作方法

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种与控制印度南瓜红果皮性状紧密连锁的分子标记、引物及应用。

背景技术：

分子标记辅助育种是一种快速发展的新技术，通过在分子水平上对个体的遗传组成进行快速准确地分析来实现对基因型的直接选择，从而进行分子育种。

印度南瓜(cucurbitamaximal.)是葫芦科(cucurbitaceae)南瓜属(cucurbita)一年生蔓生的草本植物，起源于墨西哥至中美洲和南美洲一带，在世界范围内广泛种植，也是我国重要的瓜类作物之一。其果肉和籽粒均可食用，且具有栽培容易、产量高、营养价值丰富等优点；果实是南瓜经济性状最重要的部分，南瓜果实属于瓠果，由下位子房发育而成。在南瓜果实上有一个重要品质性状就是果皮颜色，果皮颜色是南瓜重要的商品性状。印度南瓜果皮颜色有着丰富的多样性，有橘红色，橘黄色，深绿色，浅绿色，灰色等不同的颜色。果皮颜色性状主要由类胡萝卜素调控，在果实不断成熟的过程中，叶绿体逐渐转变为有色体,叶绿素不断减少,叶黄素、胡萝卜素等类胡萝卜素大量生成并积累在有色体中,使得南瓜果皮表现为以叶黄素为主的橘红色或橘黄色。而鲜明的颜色是南瓜重要的商品性状之一，因此，对南瓜橘红果皮性状的利用，选育出有橘红果皮性状的印度南瓜果实具有广阔的应用前景和巨大的经济价值。

传统育种方法在印度橘红果皮果实选育过程中存在育种周期长等问题。用与目的性状紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择在南瓜遗传育种中是十分有效的方法，可以有效拓宽这一性状的应用，推动品质育种进程。因此，开发印度南瓜橘红果皮性状紧密连锁的分子标记，对于提高印度南瓜果实品质，揭示橘红果皮形成的分子机制具有十分重要的意义。

技术实现要素：

为了能够快速，高效鉴定印度南瓜红果皮性状，加速红果皮南瓜选育进程，本发明提供了一种与控制印度南瓜红果皮性状紧密连锁的分子标记，所述分子标记为fc-01和fc-02，所述分子标记fc-01由seqidno.1所示的dna片段和seqidno.2所示的dna片段组成；所述分子标记fc-02由seqidno.3所示的dna片段和seqidno.4所示的dna片段组成。

进一步地限定，所述分子标记fc-01中seqidno.1所示的dna片段与印度南瓜红果皮性状基因r连锁，seqidno.2所示的dna片段与印度南瓜非红果皮性状基因r连锁。

进一步地限定，所述分子标记fc-02中seqidno.3所示的dna片段与印度南瓜红果皮性状基因r连锁，seqidno.4所示的dna片段与印度南瓜非红果皮性状基因r连锁。

本发明还提供了扩增上述分子标记的引物，扩增分子标记fc-01的引物序列如seqidno.5和seqidno.6所示；扩增分子标记fc-02的引物序列如seqidno.7和seqidno.8所示。

本发明还提供了上述分子标记在红果皮性状南瓜育种中的应用。

本发明还提供了上述引物在红果皮性状南瓜育种中的应用。

本发明还提供了一种红果皮性状南瓜育种的方法，包括如下步骤：

1)以印度南瓜红果皮品系2013-12为母本，以南瓜灰果皮9-6品系为父本，将所述母本与父本进行杂交，所得f1代与所述父本进行回交，得到后代bc1f1，分别利用本发明所述的分子标记fc-01和分子标记fc-02扫描bc1f1群体，选择经分子标记fc-01扫描后具有44nt、396nt、326nt和722nt核苷酸片段且经分子标记fc-02扫描后具有420nt、421nt和841nt核苷酸片段的植株，与所述父本进行回交，得到后代bc2f1；

2)分别利用分子标记fc-01和分子标记fc-02扫描bc2f1群体，选择经分子标记fc-01扫描后具有44nt、396nt、326nt和722nt核苷酸片段且经分子标记fc-02扫描后具有420nt、421nt和841nt核苷酸片段的植株，再与所述父本进行回交得到回交三代bc3f1；

3)利用分子标记fc-01和分子标记fc-02扫描bc3f1群体，选择经分子标记fc-01扫描后具有44nt、396nt、326nt和722nt核苷酸片段且经分子标记fc-02扫描后具有420nt、421nt和841nt核苷酸片段的植株，进行自交，后代记为bc3f2；

4)利用分子标记fc-01和fc-02扫描bc3f2，选择经分子标记fc-01扫描后具有44nt和722nt核苷酸片段且在标记fc-02具有841nt核苷酸片段的植株，即为改良红果皮自交系。

优选地，步骤1)所述的南瓜灰果皮品系为印度南瓜灰果皮9-6。

本发明中具体使用的亲本印度南瓜红果皮系“2013-12”和印度南瓜灰果皮系“9-6”记载在“morphological,transcriptomicandhormonalcharacterizationoftrimonoeciousandsubandroeciouspumpkin(cucurbitamaxima)suggestsimportantrolesofethyleneinsexexpression”(wangetal.,2019)，公众可通过东北农业大学获得。

有益效果

本发明利用印度南瓜红果皮‘2013-12’与灰果皮‘9-6’杂交获得f1植株，f1植株自交获得1627株f2分离群体，通过表型分析确定了印度南瓜红果皮性状属于单基因控制的显性性状。后分别取f2分离群体每株嫩叶提取基因组dna，结合slaf-seq的方法筛选与印度南瓜红果皮性状基因r紧密连锁的分子标记。利用高密度图谱的分子标记，最终提供的两个与印度南瓜红果皮紧密连锁的分子标记，分别坐落在控制目标性状基因的两侧，两标记遗传距离为64.47kb，便于红果皮的分子标记辅助育种体系的建立。本发明的分子标记可简便、快捷、高通量的应用与育种实践中。

本发明还提供了利用上述分子标记快速培育红果皮性状印度南瓜的应用。利用回交转育的方法，红果皮‘2013-12’作为非轮回亲本，灰果皮‘9-6’为轮回亲本，利用本发明的两个分子标记fc-01和fc-02扫描回交群体，根据pcr扩增产物的酶切条带，快速准确的改良灰果皮‘9-6’的果皮颜色。caps分子标记具有高稳定特征，利用这些分子标记构建高密度遗传图谱和物理图谱，将有助于建立印度南瓜红果皮颜色目标基因筛选的分子标记辅助育种系。

附图说明

图1为caps标记fc-01和fc-02和控制印度南瓜红果皮基因r紧密连锁，每一个叉号代表2个单交换事件；

图2为caps标记fc-01p1，p2，f1，f2群体pcr产物的酶切条带，其中m为d2000marker，条带长度由高到低分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，p1代表红果皮品系‘2013-12’，p2代表灰果皮品系‘9-6’，f1为p1和p2的杂交第一代，f2为f1代自交后代，f2红果皮群体和f2非红果皮群体分别表示在f2群体中随机挑选的10株红果皮和10株非红果皮植株；

图3为caps标记fc-02p1，p2，f1，f2群体pcr产物的酶切条带，其中m为d2000marker，条带长度由高到低分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，p1代表红果皮系‘2013-12’，p2代表灰果皮系‘9-6’，f1为p1和p2的杂交第一代，f2为f1代自交后代，f2红果皮群体和f2非红果皮群体分别表示在f2群体中随机挑选的10株红果皮和10株非红果皮植株。

具体实施方式

下面结合具体实施方法，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明所述的红果皮中“红”，并不代表色彩学上的纯正的红色，在本发明中表示果皮颜色为橘红色或颜色强度介于橘红色与红色之间的红色系。

实施例1.与控制印度南瓜红果皮性状紧密连锁的分子标记的筛选。

1.f2群体的构建

本实例选取印度南瓜高代自交系红果皮‘2013-12’和灰果皮‘9-6’为亲本，构建f2群体，其中亲本非红果皮‘9-6’为灰色果皮印度南瓜。利用这两个亲本配制了杂交组合所获得f1代为红果皮，f1代自交产生f2代分离群体，在田间鉴定1627个f2代个体中的红/灰表型，用卡方分析进行验证，得出印度南瓜红果皮性状为单基因控制的显性性状，通过构建六世代群体进行遗传分析，发现红果皮性状为显性，并将红果皮基因命名为red(r)。

2.红果皮连锁caps标记的筛选

①南瓜基因组dna的提取

用ctab法提取亲本及f2分离群体的叶片总dna。方法为：取两片真叶展开时的叶片在液氮中快速研磨成粉末状，放于2.0ml的离心管中；加入预热的1000μlctab提取缓冲液，65℃水浴1h；取出后冷却至室温，12000r/min4℃离心17min，吸取800μl上清液至新2.0ml的离心管中；加入等体积氯仿异戊醇混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1，混匀后12000r/min4℃离心13min；吸取700μl上清液至新2.0ml的离心管中；继续加入等体积氯仿异戊醇，混匀后12000r/min4℃离心13min；取600μl上清液至新1.5ml的离心管中，加等体积异丙醇，轻轻混匀，-20℃冰箱存放1h；12000r/min4℃离心10min；倒去上清液，用体积分数为70％的乙醇吹打洗涤沉淀两次，干燥后，加入40μlddh2o溶解后，加入10μg/ml的rna酶去除rna，37℃水浴30min；在0.8％琼脂糖凝胶电泳，以50ng/μl的λdna为标准，估计所得dna的浓度，存于-20℃备用。

②分子标记的获得

根据f2代群体田间调查结果随机选取100株红果皮与灰果皮单株，构建slaf文库并开发8406个多态性slaf标签，接着利用snp-index标记关联分析，将南瓜红果皮r基因定位到一个第14号染色体末端关联区域。

分析印度南瓜基因组重测序得到的snp结果并设计caps标记引物。以红果皮亲本、灰果皮亲本和f1dna为模板，分别以seqidno.5所示的上游引物和seqidno.6所示的下游引物(扩增分子标记fc-01)；seqidno.7所示的上游引物和seqidno.8所示的下游引物(扩增分子标记fc-02)进行pcr扩增，随后对pcr产物进行限制性酶酶切，上述引物由华大基因合成。pcr扩增和限制性内切酶体系和程序如下：

表1pcr反应体系

pcr反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸5min；35cycles；72℃终延伸5min；最后4℃保存。

酶切体系：上述所得的pcr产物5μl，3.8μlddh2o，10×buffer1μl，0.2μl限制性核酸内切酶；酶切试验反应条件为：酶切温度37℃，酶切反应时间为3h。其中，分子标记fc-01扩增产物使用alui限制性核酸内切酶(alui酶切位点为agct)进行酶切，分子标记fc-02扩增产物使用asei限制性核酸内切酶(asei酶切位点为attaat)进行酶切。酶切产物使用2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。分子标记fc-01和fc-02在红果皮、非红果皮亲本和f1之间有多态性且条带清晰的标记。

③caps分子标记扫描f2分离群体

利用上述开发的两个caps引物对(分子标记fc-01的引物序列如seqidno.5和seqidno.6所示；分子标记fc-02的引物序列如seqidno.7和seqidno.8所示，均由北京华大合成。)扫描两个亲本及上述f2群体，寻找标记型与性状表现型的差别单株，获得与目标区段的交换单株。

本发明中所述的扫描是指利用上述引物扩增相对应的分子标记，然后对分子标记进行酶切，通过酶切结果进行果皮颜色性状的判定。

所述扫描过程采用的pcr体系、pcr程序和限制性内切酶体系同本实施例步骤②所述。酶切产物通过2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，通过琼脂糖凝胶成像系统观察成像结果。

分子标记fc-01部分扫描结果见图2，红果皮植株均呈现出44nt、722nt或44nt、396nt、326nt和722nt的条带，其中44nt片段过小，在琼脂糖凝胶图中无法显示出来，所以图2中显示的酶切条带大小为396nt和326nt。灰果皮植株呈现出44nt、396nt和326nt的条带，其中44nt片段过小，在琼脂糖凝胶图中无法显示出来，所以图2中显示的酶切条带大小为396nt和326nt。分子标记fc-02部分扫描结果见图3，红果皮植株均呈现出841nt或420nt、421nt和841nt的条带，灰果皮植株呈现出420nt和421nt的条带。

以上2个分子标记经过1627株f2分离群体进行验证，结果表明2个分子标记，fc-01和fc-02可以较好地区分红果皮和非红果皮植株，2个分子标记均与红果皮基因r紧密连锁，且分别坐落于r基因两侧，两标记遗传距离为64.47kb(图1)其中，分子标记fc-01中seqidno.1所示的序列与印度南瓜红果皮基因r连锁，能被限制性内切酶alui酶切成44nt和722nt核苷酸片段，seqidno.2所示的序列与灰果皮基因r连锁，能被限制性内切酶alui酶切成44nt、396nt和326nt核苷酸片段；分子标记fc-02中seqidno.3所示序列与印度南瓜红果皮基因r连锁，不可被限制性内切酶asei酶切；seqidno.4所示序列与灰果皮基因r连锁，可被限制性内切酶asei酶切成420nt和421nt核苷酸片段。

标记fc-1、标记fc-2与r基因各存在14个和10个单交换事件，均与目标区段紧密连锁。caps分子标记具有高稳定特征，利用这些分子标记构建高密度遗传图谱和物理图谱，将有助于建立印度南瓜红果皮颜色目标基因筛选的分子标记辅助育种系。

3.多态性片段测序

以红果皮亲本‘2013-12’和灰果皮亲本‘9-6’基因组dna为模板，分别以seqidno.5所示的上游引物和seqidno.6所示的下游引物(扩增分子标记fc-01)；seqidno.7所示的上游引物和seqidno.8所示的下游引物(扩增分子标记fc-02)进行pcr扩增进行pcr扩增。pcr反应总体系为20μl：10×buffer2μl，dntp2μl，dna模板1.2μl，上下引物各0.8μl，taq酶0.2μl，ddh2o13μl。pcr反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35cycles；72℃终延伸5min；最后4℃保存。

20μlpcr扩增产物中加入biotekesybrgreeni核酸染料5μl，室温静置10分钟使染料与dna结合，2％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目的片段，使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkit分别回收纯化dna片段，具体步骤参照试剂盒说明书，产品编号9762。将纯化片段送由华大基因有限公司测序，测序结果通过dnaman软件分析。其中以红果皮‘2013-12’为模板利用seqidno.5所示的上游引物和seqidno.6所示的下游引物扩增的片段大小为766nt，扩增序列见seqidno.1，包含一个限制性内切酶alui酶切位点。以灰果皮亲本‘9-6’为模板利用seqidno.5所示的上游引物和seqidno.6所示的下游引物扩增的片段大小为766nt，扩增序列见seqidno.2，包含两个限制性内切酶alui酶切位点。以红果皮‘2013-12’为模板利用seqidno.7所示的上游引物和seqidno.8所示的下游引物，扩增的片段大小为841nt，扩增序列见seqidno.3，不包含限制性内切酶asei酶切位点。以灰果皮亲本‘9-6’为模板利用seqidno.7所示的上游引物和seqidno.8所示的下游引物，扩增的片段大小为841nt，扩增序列见seqidno.4，包含一个限制性内切酶asei酶切位点。

实施例2.红果皮印度南瓜的育种方法。

本实施例利用回交转育的方法，以红果皮‘2013-12’作为非轮回亲本，灰果皮‘9-6’为轮回亲本，定向改良灰果皮优良品系‘9-6’“9-6”的果皮颜色性状，具体操作步骤如下：

(1)红果皮‘2013-12’和灰果皮‘9-6’进行杂交，所得f1代与灰果皮‘9-6’进行回交得到后代bc1f1，利用本发明的两个分子标记fc-01和fc-02扫描bc1f1群体，即以bc1f1群体中每个植株dna为模板，分别利用seqidno.5所示的上游引物和seqidno.6所示的下游引物；以及seqidno.7所示的上游引物和seqidno.8所示的下游引物进行pcr扩增，随后对扩增产物进行限制性内切酶酶切。pcr反应体系、pcr反应条件和酶切体系同实施例1中②所述。选择经分子标记fc-01扫描后具有44nt、396nt、326nt和722nt核苷酸片段且经分子标记fc-02扫描后具有420nt、421nt和841nt核苷酸片段的植株，与灰果皮‘9-6’进行回交得到后代bc2f1。

(2)利用本发明的分子标记fc-01和fc-02扫描bc2f1群体，继续选择经标记qc-01具有44nt、396nt、326nt和722nt核苷酸片段且经分子标记fc-02扫描后具有420nt、421nt和841nt核苷酸片段的植株，再与灰果皮‘9-6’进行回交得到回交三代bc3f1。

(3)利用本发明的分子标记fc-01和fc-02扫描bc3f1，继续选择经分子标记fc-01扫描后具有44nt、396nt、326nt和722nt核苷酸片段且经分子标记fc-02扫描后具有420nt、421nt和841nt核苷酸片段的植株,自交得到后代bc3f2。

(4)利用本发明的分子标记fc-01和fc-02扫描bc3f2群体，选择经分子标记fc-01扫描后具有44nt和722nt核苷酸片段且经分子标记fc-02扫描后具有841nt核苷酸片段的植株，即为改良红果皮自交系。定植该自交系并调查从授粉当天起到45d成熟时期果实的果皮颜色。成熟时期果皮颜色为红色，表明改良后的自交系具有红果皮性状，并且其他农艺性状与‘9-6’相似。说明利用本发明的分子标记fc-01和fc-02可对印度南瓜果皮进行快速准确的改良。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

核苷酸序列表

<110>东北农业大学

<120>一种与控制印度南瓜红果皮性状紧密连锁的分子标记、引物及应用

<130>

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>766

<212>dna

<213>分子标记fc-01

<400>1

caacggctatgaatcactgccattttttctttattttgatttagctgtgggatttttgga60

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<210>2

<211>766

<212>dna

<213>分子标记fc-01

<400>2

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ataatacatttatttatttatttattttcaggctttggtattctaa766

<210>3

<211>841

<212>dna

<213>分子标记fc-02

<400>3

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<210>4

<211>841

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<213>分子标记fc-02

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<210>5

<211>20

<212>dna

<213>分子标记fc-01上游引物

<400>5

caacggctatgaatcactgc20

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>分子标记fc-01下游引物

<400>6

tcaattagaataccaaagcctg22

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>分子标记fc-02上游引物

<400>7

tttattcaaagcggtgcg18

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>分子标记fc-02下游引物

<400>8

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