本发明涉及使用生物技术鉴定兔睾丸与其易混品种dna指纹鉴定试剂盒及鉴定方法。
背景技术
兔睾丸属于我国地方习用性中药材，是长春银诺克药业有限公司生产的“参雄温阳胶囊”[国药准字z20026979，执行标准为国家药品监督管理局标准(试行)，药品标准编号ws-11257(zd-1257)-2002]的主要成分。“参雄温阳胶囊”主治补肾壮阳，用于肾阳虚衰所致的阳痿、早泄、遗精、少精、死精等，具有增强体质，提高免疫力等功效。针对我国目前不孕不育年轻化越发严重的状况，参雄温阳胶囊的疗效日益受到重视。作为主要成分兔睾丸的真伪直接影响着参雄温阳胶囊的质量和疗效，因此急需一种能准确、快速、可靠的鉴定兔睾丸真伪的检验试剂和鉴定方法。
目前，鉴定兔睾丸常用的方法包括基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定，但当兔睾丸经加工、炮制后，失去原来的特征，难以鉴定真伪。本发明应用兔睾丸mtdnacytb基因这一特异的分子遗传标记技术，具有种属特异性强、准确性高，重复性好等优点，能从分子水平解决中药宏观鉴定的局限，利于中药鉴定的标准化、规范化和国际化。
线粒体是存在于真核细胞内的具有半自主性的细胞器，是细胞进行呼吸活动、产生能量的重要场所。在线粒体内部存在着线粒体自身的遗传物质--线粒体dna(mitochondrialdnamtdna)，mtdna是一共价闭合的双链环状的遗传物质，具有分子量小、结构简单、易于分离、拷贝数高、突变率高、进化速度快、母性遗传、无组织特异性、高保守性等特点，有利于进行种内和种间的遗传变异和进化研究。mtdna已被作为一种较为理想的分子标记应用于生物遗传多样性和进化分类等方面。
线粒体细胞色素b(cytochromecytb),位于线粒体内膜磷脂双层中，是参与氧化磷酸化合成atp过程电子传递链中的重要物质，是线粒体自身编码的为数不多的功能蛋白。cytb基因进化速度适中，适于分析种间或属间差异，因此，在生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究中,mtdnacytb是一个十分有效的分子遗传学标记，得到广泛应用。本发明利用兔睾丸mtdnacytb基因，设计特异性引物，从分子水平上对兔睾丸及其伪品进行真伪鉴定，为兔睾丸的真伪鉴定提供标准化、规范化的检验方式。
目前国家标准中尚无兔睾丸的法定鉴别方法，国内亦无兔睾丸真伪鉴定的相关文献报告。本发明专利基于选择家兔的mtdnacytb基因特异位点用于兔睾丸真伪的鉴别。从家兔mtdnacytb基因组进行筛选，采用高通量技术分析具有鉴别序列片段作为鉴别点，建立pcr反应体系，因无需对兔睾丸原药成分进行逐一分离，方法可快速、简便，在不失原药材本性的条件下直接判断兔睾丸的真伪。
技术实现要素：
本发明采用生物信息学技术对家兔的mtdna基因组进行分析，利用genbank中的相关信息，根据兔与其他相关动物的mtdna基因组序列的差异，选取cytb基因作为特异性靶基因，应用primer5.0设计软件，设计兔睾丸的特异性引物。利用pcr技术，在一个反应体系中加入一对兔睾丸的特异性引物，针对兔睾丸的dna模板序列,扩增出一段兔睾丸的特异的目的片段。从而可以准确有效的将兔睾丸及其易混品种从dna水平上区分开来。具有简便、快捷、高效的特点。
本发明的目的是在于提供兔睾丸与其易混品种的鉴定试剂盒和鉴定方法，建立一种简便、快速、准确、特异的鉴定技术，提供一种标准化、规范化的检验方式。
本发明的目的是由以下技术方案来实现的：
一种兔睾丸dna指纹鉴定试剂盒，其特征是，它包含：
1.基因组dna提取试剂
①消化液：裂解液200ul，0.5mol/l乙二胺四乙酸二钠(edta)溶液50μl,蛋白酶k溶液(20mg/ml)20μl，rna酶溶液5μl；
②裂解液：1mol/ltris-盐酸溶液(ph值7.5)1ml，0.5mol/ledta溶液2ml，naci0.58g，10％十二烷基磺酸钠(sds)10ml，20mg/ml蛋白酶k溶液1ml；
③漂洗液：5mol/l醋酸钾溶液26μl，lmol/ltris-盐酸溶液(ph值7.5)18μl,0.5mol/ledta溶液(ph值8.0)3μl，无水乙醇480μl，灭菌双蒸水273μl。
2.兔睾丸pcr鉴定试剂
①pcr鉴定反应液：总体系为23μl，含有2×taqpcrmastermix(包括taqdnapoly、dntps、buffer)12.5μl，上游引物、下游引物(12.5μm)各1μl,灭菌双蒸馏水8.5μl。
②阳性dna对照液：经过鉴定的正品兔睾丸提取的dna溶液。
③空白对照液：灭菌双蒸馏水。
一种兔睾丸dna指纹鉴定方法，其特征是，它包含以下步骤：
1.设计并合成兔睾丸线粒体dnacytb基因特异性引物
根据genbank家兔mtdnacytb基因编码序列(序列号：nc_001913.1),经过dnastar7.0软件比对后，采用premier5.0软件设计兔睾丸特异性引物，再利用ncbi中的在线软件primer-blast对设计的引物进行评估。送至上海生物工程股份有限公司合成。扩增产物为326bp，配制成12.5μm的工作液，引物序列如下：
上游引物：5′-atgaccaacattcgtaaactc-3′
下游引物：5′-tcttcattttaataggttata-3′
2.兔睾丸基因组dna的提取：
取待测样品0.05g置1.5ml离心管中，加入消化液275μl，裂解液250μl，充分混匀，在56℃水浴保温1h；加到dna纯化柱中，10000rpm/min离心3min；弃去过滤液，加入漂洗液600μl，10000rpm/min离心1min；弃去过滤液，重复1次；弃去过滤液，再离心2min，将dna纯化柱转移入另一1.5ml离心管中，加入洗脱液100μl，室温放置5-10min后，10000rpm/min离心2min；离心管中即为模板dna溶液，作为供试品-20℃冰箱中备用。(dna提取试剂及各种溶剂均为提取0.05g样本时的加入量，根据实际样本量按比例调整)
3.兔睾丸pcr反应体系及反应程序：
兔睾丸鉴定反应体系：pcr鉴定反应液23μl中加入供试品dna模板溶液2μl；
兔睾丸阳性对照反应体系：pcr鉴定反应液23μl中加入阳性dna对照液2μl；
兔睾丸空白对照反应体系：pcr鉴定反应液23μl中加入空白对照液2μl；
将总体积为25μl的pcr反应管置于pcr反应仪中，按下列程序进行：94℃预变性5min，94℃30s，退火温度59℃30s，72℃30s，25个循环，72℃延伸10min。
4.琼脂糖凝胶检测兔睾丸dna指纹图谱
反应产物使用1.5％琼脂糖凝胶(市场有售，可购买)，加入核酸凝胶染色剂gelred(终浓度0.075μl/ml市场有售，可购买)，以100bpdnamarker(市场有售，可购买)作参照，在水平电泳仪(市场有售，可购买)上电泳，凝胶成像分析系统(市场有售，可购买)观察和分析结果。
5.结果判定
供试品凝胶电泳图谱中，在与阳性对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在300-400bp有一条dna条带为正品兔睾丸，空白对照无条带。参照附图1。
本发明的兔睾丸dna指纹鉴定试剂盒和鉴定方法，在利用兔睾丸mtdnacytb基因具有种属特异性的基础上，发明了同时区别兔睾丸与其易混品种的试剂盒和鉴定方法，具有简便、快速、特异、准确、标准、规范等优点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，实施例仅用于说明本发明并非对本发明的限制。
实施例一对兔睾丸及其伪品样本进行试剂盒检测
1.检测样本前处理
检测样品分鲜品和干品两种，1为兔睾丸阳性对照药材，2-6为兔睾丸鲜品样本(正品)，7-11为兔睾丸干品样本(正品)，12-13为小鼠睾丸鲜品、干品样本(伪品)，14-15为大鼠睾丸鲜品、干品样本(伪品)，均由长春市食品药品检验中心提供并鉴定。每个样本各取1g，鲜品样本于小烧杯中加约10ml冷生理盐水溶液浸泡20min，在平皿中用手术刀去除结缔组织后剪成碎末备用；干品样本直接使用研钵研磨成细粉备用。
2.基因组dna的提取
取待测样品0.05g置1.5ml离心管中，加入消化液275μl，裂解液250μl，充分混匀，在56℃水浴保温1h；加到dna纯化柱中，10000rpm/min离心3min；弃去过滤液，加入漂洗液600μl，10000rpm/min离心1min；弃去过滤液，重复1次；弃去过滤液，再离心2min，将dna纯化柱转移入另一1.5ml离心管中，加入洗脱液100μl，室温放置5-10min后，10000rpm/min离心2min；离心管中即为模板dna溶液，作为供试品-20℃冰箱中备用。
3.兔睾丸pcr引物设计与合成
设计并合成兔睾丸mtdnacytb基因特异性引物，扩增产物为326bp，引物序列如下：
上游引物：5′-atgaccaacattcgtaaactc-3′
下游引物：5′-tcttcattttaataggttata-3′
4.建立pcr反应体系及反应程序
兔睾丸鉴定反应体系：pcr鉴定反应液23μl中加入供试品dna模板溶液2μl；
兔睾丸阳性对照反应体系：pcr鉴定反应液23μl中加入阳性dna对照液2μl；
兔睾丸空白对照反应体系：pcr鉴定反应液23μl中加入空白对照液2μl；
将总体积为25μl的pcr反应管置于pcr反应仪中，按下列程序进行：94℃预变性5min，94℃30s，退火温度59℃30s，72℃30s，25个循环，72℃延伸10min。
5.琼脂糖凝胶检测兔睾丸dna指纹图谱
pcr反应产物使用1.5％琼脂糖凝胶，加入核酸凝胶染色剂gelred(终浓度0.075μl/ml)，以100bpdnamarker作参照，在水平电泳仪上电泳，凝胶成像分析系统观察和分析结果。
6.结果判定
供试品凝胶电泳图谱中，在与阳性对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在300-400bp有一条dna条带为正品兔睾丸。参照附图2。
实施例二对市售兔睾丸及兔睾丸粉样本进行试剂盒检测
1.检测样本前处理
检测样品分兔睾丸正品、市售兔睾丸和市售兔睾丸粉三种，1为兔睾丸阳性对照药材，2-6兔睾丸正品样本(由长春市食品药品检验中心提供并鉴定)，7-11为市售兔睾丸干品样本，12-16为市售兔睾丸粉样本。干品直接使用研钵研磨成细粉备用。
2.基因组dna的提取
取待测样品0.05g置1.5ml离心管中，加入消化液275μl，裂解液250μl，充分混匀，在56℃水浴保温1h；加到dna纯化柱中，10000rpm/min离心3min；弃去过滤液，加入漂洗液600μl，10000rpm/min离心1min；弃去过滤液，重复1次；弃去过滤液，再离心2min，将dna纯化柱转移入另一1.5ml离心管中，加入洗脱液100μl，室温放置5-10min后，10000rpm/min离心2min；离心管中即为模板dna溶液，作为供试品-20℃冰箱中备用。
3.建立pcr反应体系及反应程序
兔睾丸鉴定反应体系：pcr鉴定反应液23μl中加入供试品dna模板溶液2μl；
兔睾丸阳性对照反应体系：pcr鉴定反应液23μl中加入阳性dna对照液2μl；
兔睾丸空白对照反应体系：pcr鉴定反应液23μl中加入空白对照液2μl；
将总体积为25μl的pcr反应管置于pcr反应仪中，按下列程序进行：94℃预变性5min，94℃30s，退火温度59℃30s，72℃30s，25个循环，72℃延伸10min。
4.琼脂糖凝胶检测兔睾丸dna指纹图谱
pcr反应产物使用1.5％琼脂糖凝胶，加入核酸凝胶染色剂gelred(终浓度0.075μl/ml)，以100bpdnamarker作参照，在水平电泳仪上电泳，凝胶成像分析系统观察和分析结果。
5.结果判定
供试品凝胶电泳图谱中，在与阳性对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在300-400bp有一条dna条带为正品兔睾丸。参照附图3。
附图说明
图1为兔睾丸样本及其伪品的dna指纹鉴定试剂盒检测结果示意图，其中：m为100bpdnamarker；1为兔睾丸阳性对照药材，扩增出326bp；2-3为兔睾丸(正品)，扩增出326bp；4为小鼠睾丸(伪品)，5为大鼠睾丸(伪品)，6为狗睾丸(伪品)，7为水貂睾丸(伪品)，8为羊睾丸(伪品)，9为猪睾丸(伪品)，10为牛睾丸(伪品)，均不出现扩增产物；11为空白对照，不出现扩增产物。
图2为实施例一对兔睾丸样本及其伪品的dna指纹鉴定试剂盒检测结果示意图，其中：m为100bpdnamarker；1为兔睾丸阳性对照药材，扩增出326bp；2-6为兔睾丸鲜品样本(正品)，扩增出236bp；7-11为兔睾丸干品样本(正品)，扩增出236bp；12-13为小鼠睾丸鲜品、干品样本(伪品)，14-15为大鼠睾丸鲜品、干品样本(伪品)，均不出现扩增产物；16空白对照，不出现扩增产物。
图3为实施例二对市售样本兔睾丸及兔睾丸粉的dna指纹鉴定试剂盒检测结果示意图，其中：m为100bpdnamarker；1为兔睾丸阳性对照药材，扩增出326bp；2-6为兔睾丸正品样本，扩增出236bp；7为市售兔睾丸，不出现扩增产物(伪品)，8-11为市售兔睾丸，扩增出326bp(正品)；12-13为市售兔睾丸粉，扩增出326bp(正品)，14为市售兔睾丸粉，不出现扩增产物(伪品)，15为市售兔睾丸粉，扩增出326bp(正品)；16为空白对照，不出现扩增产物。