一种果蔬安全性的评估方法与流程

本发明涉及果蔬评估
技术领域：
，具体涉及一种果蔬安全性的评估方法。
背景技术：
近些年来，国外不断的在发生由于大肠杆菌而引起的食物中毒的事件。大肠杆菌对于食品的污染，尤其是对于鲜切蔬菜的污染逐渐成为人们所关注的话题之一。虽然我国尚未出现过类似这样大规模的大肠杆菌感染事件，但是我们仍然要防患于未然。随着我国人民生活水平的提高，我国人民的饮食习惯也逐渐趋于欧美化，人民越来越倾向于购买一些方便快捷的食品。例如我们在家中吃的凉菜；在快餐店里吃的蔬菜沙拉等等。但果蔬被污染后存在食物中毒的风险，果蔬的安全性存在潜在的问题。目前并没有研究报道过一种评估果蔬的安全性的方法，食物中毒的隐患不能够得到有效预防和解决。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种果蔬安全性的评估方法。本发明提供的评估方法能够实现不同果蔬安全性的评估，更直观、更快速的评估果蔬对于致病菌的安全性，从而降低食物中毒的风险。本发明提供了一种果蔬安全性的评估方法，包括以下步骤：1)构建含有毒素基因和gfp基因的融合蛋白表达载体，转化入大肠杆菌中，得到表达毒素-gfp融合蛋白的大肠杆菌；2)将步骤1)得到的表达毒素-gfp融合蛋白的大肠杆菌进行培养，得到菌液，将菌液梯度稀释后接种于果蔬中，4～37℃贮藏24～72h，进行安全性评估；所述果蔬包括果蔬汁或果蔬块；当所述果蔬为果蔬汁时，所述安全性评估为：直接对贮藏后果蔬汁的光度值进行检测，检出数值越高，代表果蔬被致病菌侵染的风险高；当所述果蔬为果蔬块时，所述安全性评估为：将贮藏后的果蔬块与去离子水混合，将混合后得到的液体接种在lb固体培养基上，36±1℃培养12～24h，观测培养基上发出绿色荧光的菌落比例越高，代表果蔬被致病菌侵染的风险高。优选的是，步骤1)所述毒素基因包括stx2、fimy、inlb、shet1、ciab、trh2或trh。优选的是，步骤1)用于构建含有毒素基因和gfp基因的融合蛋白克隆载体的空载体包括pmd19-t，表达载体的空载体包括pbv220。优选的是，步骤1)所述表达载体的构建方法包括酶切连接法。优选的是，步骤2)中，当所述果蔬为果蔬汁时，所述接种为将菌液梯度稀释后，以10～100cfu/ml的接种量接入果蔬汁；当所述果蔬为果蔬块时，所述接种为将果蔬块在梯度稀释为100～1000cfu/ml的菌液中浸泡10s后取出。优选的是，步骤2)所述果蔬块的表面积相同。本发明提供了一种果蔬安全性的评估方法。本发明提供的评估方法通过构建含有毒素基因和gfp基因的融合蛋白表达载体的大肠杆菌菌株，并将菌液接种于果蔬中，随后对果蔬进行安全性评估，所述安全性评估的结果能够代表不同种类果蔬感染致病菌的风险，结合本发明得到的安全性评估结果，进行保存条件和贮藏时间的调整，能够避免食源性疾病，降低食物中毒的风险。附图说明图1为本发明实施例1提供的果蔬评估方法技术路线图。具体实施方式本发明提供了一种果蔬安全性的评估方法，包括以下步骤：1)构建含有毒素基因和gfp基因的融合蛋白表达载体，转化入大肠杆菌中，得到表达毒素-gfp融合蛋白的大肠杆菌；2)将步骤1)得到的表达毒素-gfp融合蛋白的大肠杆菌进行培养，得到菌液，将菌液梯度稀释后接种于果蔬中，4～37℃贮藏24～72h，进行安全性评估；所述果蔬包括果蔬汁或果蔬块；当所述果蔬为果蔬汁时，所述安全性评估为：直接对贮藏后果蔬汁的光度值进行检测，检出数值越高，代表果蔬被致病菌侵染的风险高；当所述果蔬为果蔬块时，所述安全性评估为：将贮藏后的果蔬块与去离子水混合，将混合后得到的液体接种在lb固体培养基上，36±1℃培养12～24h，观测培养基上发出绿色荧光的菌落比例越高，代表果蔬被致病菌侵染的风险高。本发明所述果蔬安全性的评估方法用于评估果蔬的安全性，优选评估果蔬在致病微生物侵染情况下的果蔬安全性，所述果蔬包括即食果蔬。本发明构建含有毒素基因和gfp基因的融合蛋白表达载体，转化入大肠杆菌中，得到表达毒素-gfp融合蛋白的大肠杆菌。本发明对所述大肠杆菌的来源没有特殊的限定，采用常规大肠杆菌即可。在本发明中，本发明优选从果蔬中分离大肠杆菌。即在本发明中，所述大肠杆菌优选为从果蔬中分离的野生大肠杆菌，使用已经在果蔬中生长良好的野生大肠杆菌能够避免出现其他大肠杆菌(大肠杆菌类型很多)由于一些情况影响毒素-gfp融合蛋白表达的情况。本发明对所述大肠杆菌的分离方法没有特殊的限定，优选采用国标规定的方法进行即可，如平板划线分离法。得到大肠杆菌后，本发明优选对所述大肠杆菌进行鉴定，本发明对所述鉴定方法没有特殊的限定，采用大肠杆菌常规鉴定方法即可，如进行16srrna测序，通过ncbi进行序列比对，实现大肠杆菌的鉴定。在本发明中，所述毒素基因优选包括stx2、fimy、inlb、shet1、ciab、trh2或trh，其中stx2的核苷酸序列如seqidno.1所示、fimy的核苷酸序列如seqidno.2所示、inlb的核苷酸序列如seqidno.3所示、shet1的核苷酸序列如seqidno.4所示、ciab的核苷酸序列如seqidno.5所示、trh2的核苷酸序列如seqidno.6所示、trh的核苷酸序列如seqidno.7所示。在本发明中，所述stx2来自escherichiacolio157:h7，所述fimy来自沙门氏菌，所述inlb来自单核细胞增生李斯特菌，所述shet1来自致贺氏菌，所述ciab来自空肠弯曲菌，所述trh2来自副溶血弧菌，所述trh来自副溶血弧菌。本发明对所述毒素基因的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的基因合成方法进行人工合成即可。本发明通过将毒素基因与gfp蛋白进行融合表达，能够实现表达毒素基因的大肠杆菌在果蔬中生长，且表达带有绿色荧光标记的毒素，通过观测绿色荧光毒素蛋白的表达量，得出果蔬对致病大肠杆菌的安全性。在本发明中，用于构建含有毒素基因和gfp基因的融合蛋白克隆载体的空载体包括pmd19-t，表达载体的空载体包括pbv-220。在本发明中，所述表达载体的构建方法包括酶切连接法。得到表达毒素-gfp融合蛋白的大肠杆菌后，本发明将表达毒素-gfp融合蛋白的大肠杆菌进行培养，得到菌液，将菌液梯度稀释后接种于果蔬中，4～37℃贮藏24～72h，进行安全性评估；所述果蔬包括果蔬汁或果蔬块；当所述果蔬为果蔬汁时，所述安全性评估为：直接将贮藏后的果蔬汁在荧光分光光度计490nm光度值下进行检测，检出数值越高，代表果蔬被致病菌侵染的风险高；当所述果蔬为果蔬块时，所述安全性评估为：将贮藏后的果蔬块与去离子水混合，将混合后得到的液体接种在lb固体培养基上，36±1℃培养12～24h，观测培养基上发出绿色荧光的菌落比例越高，代表果蔬被致病菌侵染的风险高。在本发明中，所述果蔬在使用前优选包括洗净的步骤。本发明对所述果蔬汁和果蔬块的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的果蔬汁、果蔬块制备方法即可，本发明在所述制备方法中所有实验用到的玻璃仪器和耗材，例如烧杯、试管、枪头等，优选进行灭菌操作，本发明对所述灭菌的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规灭菌方法即可，如高压蒸汽灭菌锅，121℃，15min灭菌。在本发明中，所述菌液由表达毒素-gfp融合蛋白的大肠杆菌培养得到，所述培养的条件优选为37℃，过夜培养。贮藏前本发明对菌液梯度稀释的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规梯度稀释方法即可，在本发明中，贮藏前所述稀释用溶剂优选为生理盐水。在本发明中，当所述果蔬为果蔬汁时，所述接种为将菌液梯度稀释后，以10～100cfu/ml的接种量接入果蔬汁；当所述果蔬为果蔬块时，所述接种为将果蔬块在梯度稀释为100～1000cfu/ml的菌液中浸泡10s后取出。在本发明中，所述果蔬块浸泡10s后优选进行沥干。沥干后，本发明优选将果蔬块进行分装，进行贮藏。本发明所述分装优选使用均质袋进行分装，更优选25±0.5g/袋，每袋中的果蔬块的表面积优选相同。在本发明中，所述贮藏的温度优选为4～37℃，更优选为6～37℃；所述贮藏的时间优选为24～72h，更优选为30～48h。本发明将贮藏后的果蔬块与去离子水混合，优选将混合后得到的液体在均质机中拍打1分钟，将均质后的混合液取出1ml接种在lb固体培养基上，36±1℃培养12～24h，更优选37℃培养20h。本发明将所述贮藏后的果蔬块与去离子水的混合的目的是稀释贮藏后的果蔬块中的菌液，本发明所述稀释优选为梯度稀释，本发明对所述稀释的具体操作没有特殊的限定。本发明优选从混合后得到的液体中取1ml涂布于lb固体培养基上。贮藏后，本发明对所述果蔬进行安全性评估，当所述果蔬为果蔬汁时，在本发明中，所述光度值检测的方法优选采用分光光度计进行操作，所述光度值优选在490nm下观察。如果果蔬本身的营养条件和环境适合致病菌的生长的话，在分光光度计490nm下观察得到的数值就相应较高(因为致病菌在此条件下繁殖和存活率都比较高)，所以数值高就代表这个果蔬被致病菌侵染的风险就高。当所述果蔬为果蔬块时，本发明对所述果蔬块的大小没有特殊的限定，保持果蔬块的表面积相同即可，表面积相同，能够保证实验果蔬染菌的几率是一致的。培养基上所长的绿色菌落数量越高、比例越高说明安全性越差，因为把表达毒素-gfp融合蛋白的大肠杆菌接入到不同的果蔬当中，如果果蔬中的营养环境适合大肠杆菌生长，培养基上菌落数就会增加。如果还能让致病基因表达，那么菌落就是绿色的，所以绿色越多越能证明这种果蔬风险越高。本发明通过观察培养基上绿色菌落的个数和比例，实现对不同果蔬安全性的评价。在本发明中，所述果蔬安全性评估方法优选能够间接应用于评价即食果蔬安全性。下面结合具体实施例对本发明所述的一种果蔬安全性的评估方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1本实施例具体的果蔬安全性评估方法技术路线图如图1所示，其中，图1a为不同食品中大肠杆菌的分离过程；图1b为稳定表达毒素基因-gfp融合蛋白菌株的构建过程；图1c为果蔬安全性评估过程。(a)不同果蔬中大肠杆菌的分离(使用大肠杆菌分离培养基：emb培养基)将果蔬打成果蔬汁，稀释后取1ml置于emb培养基中，36℃±1℃培养24h，挑取几个典型菌落(典型大肠杆菌菌落特征为具黑色中心有金属光泽或无光泽)，保种，并将菌液进行16srna测序。将测序结果与ncbi的基因库进行比较，以确保为大肠杆菌，确定为大肠杆菌后进行感受态细胞的制备。(b)引物设计：从含pet28a-egfp质粒的菌中提取gfp基因。菌株名称：e.colibl21(pet28a-egfp)所含质粒：pet28a-egfp利用pet28a载体上的插入位点：ecorⅰ(gaattc)和hindⅲ(aagctt)，将gfp基因扩增下来；根据已知的stx2序列生物合成stx2基因。再将stx2和gfp基因利用酶切连接法连接到克隆载体pmd19-t上，转化到大肠杆菌感受态中。然后提取该大肠杆菌的质粒，再将stx2-gfp基因酶切下来，利用酶切连接法连接到表达载体pbv220上，转化到大肠杆菌感受态中。用于连接stx2和gfp基因和将stx2-gfp基因连到表达载体上所用的引物包括：stx-f-gaattcatgacgatagacttttcg(seqidno.8)；stx-r-gtcgaggagcgggaacgagtgcgttgtatataaaaactgtgacttt(seqidno.9)；gfp-f-aaagtcacagtttttatatacaacggtgagcaagggcgaggagctg(seqidno.10)；gfpr-gtcgacttacttgtacagctcg(seqidno.11)。(c)果蔬安全性评估，先将果蔬洗净、切块，配置一盆菌悬液(100cfu/ml)，然后将切块的果蔬在菌悬液中浸泡10s，浸泡后沥干。将沥干后的切块果蔬置于均质袋中(25g/袋，并保证表面积大致相同，允许误差在±0.5g之内)，根据不同测试温度进行贮藏(4～37℃)24h、48h或72h，贮藏后取出。向贮藏后的均质袋中加入225ml去离子水进行稀释。再取出1ml稀释液涂布到lb固体培养基上，36℃±1℃培养24h。培养后观察培养基上绿色菌落数量以及比例确定果蔬的风险。实施例2按照本发明实施例1方法对结球生菜进行评估，所述结球生菜切为结球生菜块进行处理。评估结果如表1所示：表1结球生菜安全性评价结果(单位：cfu/ml)备注：上表数据为白色菌落数/总菌落数“全”代表是用的lb培养基，“3/4”代表只称取lb培养基的3/4剩下用琼脂代替，(因为lb培养基的营养成分最充足，而蔬菜里的营养成分达不到lb培养基那么多，3/4模拟营养成分是lb的3/4)以此类推，“1/2”代表只称取lb培养基的1/2剩下用琼脂代替，“1/4”代表只称取lb培养基的1/4剩下用琼脂代替，“1/8”代表只称取lb培养基的1/8剩下用琼脂代替。实验证明营养成分越高，生菜的风险程度越大。在营养成分高的情况下(全、3/4)温度会对生菜的风险程度有影响，但是在到30℃之后变化不大。最后得出的结球生菜只能在8度(或更低)的条件下保存1天是安性的，8度保存1天以上，生菜感染致病菌风险程度很高。实施例3分别对白萝卜、黄瓜、苹果、生菜和洋葱进行评估。评估结果如表2所示：表2白萝卜、黄瓜、苹果、生菜和洋葱安全性评价结果(单位：cfu/ml)表2中的不同果蔬的数值代表菌数量，根据评估结果可以判断，黄瓜的安全性<生菜<洋葱<苹果<白萝卜，且在相同条件下黄瓜的菌数量大约是生菜的2倍左右。在4℃和10℃的贮藏温度下，洋葱苹果和白萝卜在72h内处于低风险状态，而黄瓜和生菜在24h内处于低风险状态，24h后风险上升。而在25℃时，黄瓜和生菜在24h内就处于高风险状态，洋葱和苹果在24h内处于低风险状态24h后风险上升，而白萝卜则在72h内风险较低。由此可知，不同的果蔬风险程度不仅受到自身营养成分的影响，而且与当时的温度密切相关！(高风险是指菌数大于1×103的情况)本发明提供的方法可以快速、准确且直观的评估鲜切果蔬对于致病菌的风险，所以在日常生活中我们不但要注意果蔬的清洗，更要根据不同果蔬安全性评估结果注重他们的保存条件并且尽快食用完毕，防止食物中毒的发生。实施例4对黄瓜、生菜和苹果进行评估，将上述蔬菜榨汁，接种菌液，接种量是100cfu/ml，贮藏条件37℃，24h，贮藏后直接检测。不同果蔬汁在荧光分光光度计下的数值如表3所示表3不同果蔬汁在荧光分光光度计490nm下的数值菌液7.3空白10.50.250.125生菜2.39.15.73.93.2黄瓜3.310.77.05.04.2苹果0.40.80.60.50.5表格中空白指纯的果蔬汁没加菌，1是纯的果蔬汁加菌后测量，0.5是1中果蔬汁稀释一倍后测量，0.25是0.5中果蔬汁稀释一倍后测量，0.125是0.25中果蔬汁稀释一倍后测量。490nm是绿色荧光蛋白发光最亮的峰值。在490nm处不加菌的原液生菜、黄瓜、苹果分别是(2.3、3.3和0.4)。在加完菌后，生菜、黄瓜、苹果分别是9.1、10.7和0.8，生菜大于黄瓜大于苹果。在所有营养条件下都是此规律。也证明了之前实施例3里面的数据，黄瓜风险大于生菜风险大于苹果的风险。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>北京农学院<120>一种果蔬安全性的评估方法<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>960<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atgaagtgtatattatttaaatgggtactgtgcctgttactgggtttttcttcggtatcc60tattcccgggagtttacgatagacttttcgacccaacaaagttatgtctcttcgttaaat120agtatacggacagagatatcgacccctcttgaacatatatctcaggggaccacatcggtg180tctgttattaaccacaccccaccgggcagttattttgctgtggatatacgagggcttgat240gtctatcaggcgcgttttgaccatcttcgtctgattattgagcaaaataatttatatgtg300gccgggttcgttaatacggcaacaaatactttctaccgtttttcagattttacacatata360tcagtgcccggtgtgacaacggtttccatgacaacggacagcagttataccactctgcaa420cgtgtcgcagcgctggaacgttccggaatgcaaatcagtcgtcactcactggtttcatca480tatctggcgttaatggagttcagtggtaatacaatgaccagagatgcatccagagcagtt540ctgcgttttgtcactgtcacagcagaagccttacgcttcaggcagatacagagagaattt600cgtcaggcactgtctgaaactgctcctgtgtatacgatgacgccgggagacgtggacctc660actctgaactgggggcgaatcagcaatgtgcttccggagtatcggggagaggatggtgtc720agagtggggagaatatcctttaataatatatcagcgatactggggactgtggccgttata780ctgaattgccatcatcagggggcgcgttctgttcgcgccgtgaatgaagagagtcaacca840gaatgtcagataactggcgacaggcctgttataaaaataaacaatacattatgggaaagt900aatacagctgcagcgtttctgaacagaaagtcacagtttttatatacaacgggtaaataa960<210>2<211>723<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atgcgcagcgtaccacgcagggaaagacaccgccgtttaagaaatgctaaagactgcgcc60tgccgttatcactctccaacgccgcagatatttgatcgccttgagttactgaaccaacag120ctcaattatgccttgccggttggtatcatttctcaggcaataattacaactgacaactac180ctcggctattcattgagtcactacttattttccggaaaacgtaccgcagcattccgctca240ttagatgacatttctttgtggattgaaaaggggtcgctcagacaactgattgtagatatg300gaggcgctacctgtctcctgtattgaggcgcttaaccagctacgcgcgctcagttggcaa360caaagcgatatccagatttacctgctggtatcagataaaacctccgctataacacagttt420atccgtatggctgggcgtttttttgtcctgtcgcgacgacaaaatctggcctcagtacgc480gaagccttgttatcagcctccaaacctcgcttatcggaaagctttagccgtactgactgg540ttgatgattgaaactttagcgcaaggcgcctctttaaaagaaatagcacgtcagcaaagc600gtaccttatcatcgtgtagtttaccggcttaaacaacttatcaccctccttaaccttccc660cacaggcaaagctttcttcggctgatccagcagctaaacgttactttccacgacattttt720taa723<210>3<211>1893<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gtgaaagaaaagcacaacccaagaaggaaacattgtttaatctcaggtttagccattatt60tttagtttatggataattattggaaacggggcgaaagtacaagcggagactatcactgtg120ccaacgccaatcaagcaaatttttccagatgatgcttttgcagaaactatcaaagacaat180ttaaagaaaaaaagtgtgacggatctagtggcacaaaatgaattaaatggtatagatcaa240atcattgcgaataatagtgatattaaatccattcaaggaattcagtatttacccaatgtg300acaaagttagttttaaacgggaataaactaacagatataaagcccttagcaaactcgaaa360aatttaggatggctttttttagacgaaaataaaattaaagacctaagttcgctcaaggat420ttaaaaaaattaaaatcactttctttggagcataatggtataagtgatataaatggactt480gttcatttaccgcaactggaaagtttgtatttgggaaataataaactaacggatataacg540attctttcacgtttaactcaactggatactttatctcttgaagataacgaaattagtgat600attgtgccactttcaggtttaactaaattgcagaacctatatttaagtaagaatcacata660agcgatttaagagcgttagcagggcttaaaaatctggatgttttagaattatttagccaa720gaatgtttgaataaatctattaatcatcaaacgaatctagttgttccgaacacagtaaaa780aacattgatgggtcgcttgttactccagaaataataagtgatgatggcgattatgaaaaa840ccgaatgtcaaatggcatttaccagaatttataaatgaagtaagttttgttttctatcaa900ccagtcactgttggaaaagcaagagcacgatttcatgggagagtaacccaaccactgaaa960gaggtttacacagtaagttatgatgttgatggaacggtaataaaaacaaaagtagaggca1020gggacgcgaataactgcacctaaacctccgaccaaacaaggctatgtttttaaaggctgg1080tatactgaaaaaaatggtggacatgagtggaattttagtacggattatatgtccggaaac1140gattttactttgtacgcgatgtttaaagcggaaacgactgaaaaagcggtgaacttaaca1200cgctatgttaaatatattcgcgggaatgcgggaatctacaaacttccaagagaagataac1260tcgcttaaacaaggaacgctagcctcgcaccgctgtaaagctttaactgttgatagagaa1320gcgcgaaatggcagtgaattatggtacaggttaaaaaatattggctggaccaaagctgaa1380aatctttccttagaccgttacgataaaatagaatatgacaaaggtgttactgcttatgca1440agagtaaaaaatgcgccagggaatgcagtttggacgaaaccatacaatacagccggcgca1500accctcgtgaacaagctttccgtctaccaaggtaaaaatatgcgaatattgcgcgaagcc1560aaaacaccaattactacgtggtatcaatttagcattgatggtaaagtaattggttgggtc1620gatacgcgtgcacttaacacattttataaacaaagcatggaaataccaatccaattaact1680cgatacgtcagcgcaaataaaggaaatgaagcatactataaagttccggtagtagatagc1740ccaatcaaatggggaactttaaccaagtataaaaatcaaacattaattgtcgatcgaaca1800gccaccgttgaaggtcagctttggtatcggataagaactagctccaccttcatcggttgg1860acaaaagctacgaatttaagtacgcagaaataa1893<210>4<211>696<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4atggctcctgtcattcacggtgtccgggacagaggtaccttcctccggaatgacataatt60tcctgttccgtcatttttatccacaaatgccctgtcacttcccagtgtgatatggctgtt120atccgacttaatgtcactgttcagcgaggcgttacgtgaaagatggaagtcagcgtcttt180cagcgacagtgttttcattgtaaactgacggttttcccagtctttctggttcaggctgac240cggtgcactgccactgatggaggcatggataaccggatgtccctggaatatcagggtgcc300actgtcctgactcagggtaccttccggcaggttcacgctaccatcaaagattacctttct360tccccccggcacctgtggaatggcgacatccatattcccggtcagctgaccatgaaagat420aacgggttgttttgcccgcccggccaggatcctatcttttactgtctgaactgctttgtt480tttgttcatgccaacaaactcccactgagccggatcattcaggctgttcccccacagagt540gttaccatagctggcagatttcagaatatagaagcgggtctggctgttgagtatcatgct600gtacaggtttcctggagtgccggtaccaccaaagggggatatatttccaatcgtcggttc660actgacatttgtatcctgagccttaagatccagtaa696<210>5<211>1900<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5catttttactccttattttaaaaaatgaattataattaaaaaagttaaaaaggagaataa60aagtatgaataattttaaagaaatagc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