用于检测二价汞离子的生物工程菌及其制备方法和用途与流程

本发明涉及水污染检测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种用于检测二价汞离子的生物工程菌及其制备方法和用途。

背景技术

在重金属污染研究中，密度在5.0g/ml以上的金属离子hg²⁺是生物毒性显著的污染物之一。一旦污染进入水环境、土壤、生物体内，则会造成难以去除的局面。资料显示，极低浓度hg²⁺也会对人类健康造成毒害，出现一系列人体消化道、肾、脏等损坏，更是危害中枢神经系统而引发汞中毒。

近年来，生产工艺大量排放汞残液，致使重金属汞污染呈上升趋势。重金属汞污染不易降解，又抑制人体蛋白、酶等生命大分子物质的生物活性从而影响正常代谢。鉴于汞污染对环境和人体生命健康的严重危害，对水环境中hg²⁺检测尤其重要。最初的化学试剂法，检测灵敏度和区分度有局限，无法特异性识别某一重金属离子，并且所选有机试剂释放环境引起二次污染。近代以来，汞检测的技术手段及研究方法的不断发展和改进。具备灵敏性极好的分析方法就有原子荧光光谱法(atomicfluorescencespectrometry，afs)、原子吸收光谱法(atmoticabsorptionspectrometry，aas)、原子发射光谱法(atomicemissionpectrometry，aes)和电感耦合等离子体质谱法(iductivelycoupledplasma-massspectrometry，icp-ms)等。但这些依赖于大型仪器的检测方法成本高昂、样品处理复杂、所需时间长，难以实现低成本的、简单、快速的检测。。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种通过利用merr蛋白对目标金属离子hg²⁺高选择性、高灵敏性的识别及结合特性以及红色荧光蛋白mfrp1优异的荧光光谱性质，实现对水污染体系中痕量hg²⁺特异性的可视化检测的生物工程菌。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种所述生物工程菌含有表达载体merrop-ompa-rfp-psb1a2，其中，merrop-ompa-rfp为重组基因，psb1a2为质粒骨架。

本发明还提供一种用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、利用pcr扩增反应分别实现merrop、ompa、rfp基因片段的扩增，将扩增后的merrop基因片段和ompa基因片段通过重叠延伸pcr技术连接，并通过pcr扩增反应实现扩增，得到目的基因片段merrop-ompa；

步骤二、使用限制性内切酶xbai和spei对psb1a2质粒骨架和目的基因片段merrop-ompa进行双酶切，使目的基因片段merrop-ompa和psb1a2质粒骨架同时露出相同的粘性末端，通过t4dna连接酶将目的基因片段merrop-ompa和psb1a2质粒骨架连接，实现merrop-ompa-psb1a2质粒的构建；

步骤三、使用限制性内切酶spei对merrop-ompa-psb1a2质粒和扩增后的rfp基因片段进行单酶切，再用t4dna连接酶将merrop-ompa-psb1a2质粒和扩增后的rfp基因片段连接，完成表达载体merrop-ompa-rfp-psb1a2的构建；

步骤四、通过化学转化法将表达载体merrop-ompa-rfp-psb1a2转化至感受态细胞内，获得所述生物工程菌。

优选的是，步骤一中的目的基因片段merrop-ompa具体通过以下方法获得：分别以全合成的merrop、ompa、rfp基因序列为模板，进行第一次pcr扩增反应，再将扩增后的merrop和ompa基因片段末端的互补片段通过重叠延伸pcr技术实现merrop和ompa的连接，得到连接片段merrop-ompa，进行第二次pcr扩增反应，实现连接片段merrop-ompa的扩增，得到目的基因片段merrop-ompa。

优选的是，步骤四中的感受态细胞为e.colidh5α感受态细胞。

优选的是，第一次pcr扩增反应时，merrop需要加入的引物包括imer-opxf、op-ompaup，ompa需要加入的引物包括op-ompadn、ompasr，rfp需要加入的引物包括mrfp1sf、mrfp1sr；第二次pcr扩增反应加入的引物包括imerr-opxf和ompasr。

优选的是，步骤二中进行双酶切时的反应温度为37℃，反应时间为1h。

优选的是，步骤三中进行单酶切时的反应温度为37℃，反应时间为1h。

优选的是，第一次pcr扩增反应包括30个循环，其中，一个循环依次包括98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸5s；第二次pcr扩增反应包括30个循环，其中，一个循环依次包括98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸10s。

本发明还提供一种用于检测二价汞离子的生物工程菌的用途，该生物工程菌用于检测水环境是否含有hg²⁺。

优选的是，该生物工程菌识别hg²⁺的反应时间为15min以上。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明提供的生物工程菌可以高选择性的识别并检测水环境中的目标金属离子汞，对0.025μm金属离子hg²⁺已经有明显的响应，而对高浓度的其它金属离子ag⁺、au³⁺、cd²⁺、cr³⁺、cu²⁺、fe³⁺、ni²⁺、pb²⁺、zn²⁺均没有响应。而且，在一定浓度(1μm)下，分析不同反应时间中工程菌响应程度，在15min相对短时间内，出现明显荧光强度，随着反应时间(15min～8h)变化，荧光强度增加。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的psb1a2质粒骨架的质粒图谱；

图2为本发明所述的表达载体的构建流程图；

图3为本发明所述的merrop、ompa、rfp、merrop-ompa基因片段扩增后的电泳图；

图4为本发明所述的merrop-ompa-psb1a2质粒及酶切鉴定的电泳图；

图5为本发明所述的merrop-ompa-rfp-psb1a2表达载体及酶切鉴定的电泳图；

图6为本发明所述的生物工程菌对不同浓度hg²⁺可视化检测的荧光强度图；

图7为本发明所述的生物工程菌在不同培养时间中对相同浓度hg²⁺可视化检测的荧光强度图；

图8为本发明所述的生物工程菌对10种金属离子可视化检测的荧光强度图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明提供一种用于检测二价汞离子的生物工程菌，所述生物工程菌含有表达载体merrop-ompa-rfp-psb1a2，其中，merrop-ompa-rfp为重组基因，psb1a2为质粒骨架。psb1a2质粒骨架用于构建重组质粒，psb1a2质粒图谱如图1所示。

如图2所示，本发明还提供一种用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、利用pcr扩增反应分别实现merrop、ompa、rfp基因片段的扩增，将扩增后的merrop基因片段和ompa基因片段通过重叠延伸pcr技术连接，并通过pcr扩增反应实现扩增，得到目的基因片段merrop-ompa；

merr的基因序列如seqidno.1所示，op的基因序列如seqidno.2所示，ompa的基因序列如seqidno.3所示，rfp的基因序列如seqidno.4所示，重组基因merrop-ompa-rfp的基因序列如seqidno.5所示。

步骤一中的目的基因片段merrop-ompa具体通过以下方法获得：分别以全合成的merrop、ompa、rfp基因序列为模板，进行第一次pcr扩增反应，再将扩增后的merrop和ompa基因片段末端的互补片段通过重叠延伸pcr技术实现merrop和ompa的连接，得到连接片段merrop-ompa，进行第二次pcr扩增反应，实现连接片段merrop-ompa的扩增，得到目的基因片段merrop-ompa。如下表1为第一次pcr扩增反应体系(100ul)。如下表2为第二次pcr扩增反应体系(100ul)。

表1

表2

第一次pcr扩增反应时，merrop需要加入的引物包括上游引物imerr-opxf和下游引物op-ompaup，ompa需要加入的引物包括上游引物op-ompadn和下游引物ompasr，rfp需要加入的引物包括上游引物mrfp1sf和下游引物mrfp1sr；第二次pcr扩增反应加入的引物包括imerr-opxf和ompasr，上述各引物的序列如下表3所示。在第一次pcr扩增反应和第二次pcr扩增反应时还加入了dna聚合酶。

表3

第一次pcr扩增反应包括30个循环，其中，一个循环依次包括98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸5s；第二次pcr扩增反应包括30个循环，其中，一个循环依次包括98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸10s。如下表4为第一次pcr扩增反应的反应程序。如下表5为第二次pcr扩增反应的反应程序。

表4

表5

基因片段merrop、ompa、rfp、merrop-ompa通过pcr程序扩增后使用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果显示泳道1、2、3、4在500bp附近、500bp-750bp之间、750bp附近、1000bp附近均有明显的单条带，与merrop(506bp)、ompa(549bp)、rfp(742bp)与merrop-ompa(1054bp)基因片段的大小完全相符，如图3所示，表明pcr扩增结果基本正确。图3中，1代表merrop基因扩增产物；2代表ompa基因扩增产物；3代表rfp基因扩增产物；4代表merrop-ompa基因扩增产物。

步骤二、使用限制性内切酶xbai和spei对psb1a2质粒骨架和目的基因片段merrop-ompa进行双酶切，使目的基因片段merrop-ompa和psb1a2质粒骨架同时露出相同的粘性末端，通过t4dna连接酶将目的基因片段merrop-ompa和psb1a2质粒骨架连接，实现merrop-ompa-psb1a2质粒的构建；进行双酶切时的反应温度为37℃，反应时间为1h。

使用限制性内切酶xbai及spei处理通过重叠延伸pcr技术连接的目的基因片段merrop-ompa及psb1a2质粒骨架，反应体系于37℃恒温反应1h后酶切产物通过1％琼脂糖凝胶电泳实验和切胶回收实验纯化后进行浓度测试。酶切片段merrop-ompa与psb1a2质粒骨架经切胶回收后，在t4连接酶的作用下，实现merrop-ompa片段与psb1a2的成功连接，连接产物通过化学法转化至e.colidh5α感受态细胞中。挑取单克隆进行按步骤一的方法进行pcr鉴定，pcr鉴定正确的单克隆进行质粒提取和酶切鉴定实验，如图4所示，图4中1和2分别代表merrop-ompa-psb1a2质粒及xbai、spei双酶切鉴定的结果。同时，经上海生工生物公司测序证明，merrop-ompa片段成功的插入到psb1a2质粒骨架的xbai/spei酶切位点间，且构建过程未发生突变。

目的基因片段merrop-ompa及psb1a2质粒骨架的双酶切反应体系如下表6所示。然后，通过连接反应将目的基因片段merrop-ompa构建至psb1a2质粒骨架，实现merrop-ompa-psb1a2载体的构建，具体反应体系如表7所示，于16℃恒温过夜后取少量连接产物进行转化，挑取pcr鉴定和酶切鉴定正确的单克隆于lb培养基中过夜培养后送去上海生工生物公司进行测序，将测序结果正确的载体merrop-ompa-psb1a2进行后续实验。

表6

表7

步骤三、使用限制性内切酶spei对merrop-ompa-psb1a2质粒和扩增后的rfp基因片段进行单酶切，再用t4dna连接酶将merrop-ompa-psb1a2质粒和扩增后的rfp基因片段连接，完成表达载体merrop-ompa-rfp-psb1a2的构建；图2中重叠pcr就是重叠延伸pcr技术；步骤三中进行单酶切时的反应温度为37℃，反应时间为1h。

使用限制性内切酶spei处理扩增后的rfp基因片段与merrop-ompa-psb1a2，反应体系于37℃恒温反应1h后酶切产物通过1％琼脂糖凝胶电泳实验和切胶回收实验纯化后进行浓度测试。如图5所示，图5中1和2代表表达载体为merrop-ompa-rfp-psb1a2及spei酶切鉴定的结果，证明merrop-ompa片段成功连接到质粒psb1a2后，merrop-ompa-psb1a2与rfp片段使用spei单酶切后，再使用t4连接酶即可实现质粒merrop-ompa-rfp-psb1a2的成功构建。再转入感受态细胞e.colidh5α中，经测序以防有碱基缺失或突变。经上海生工生物公司测序证明，rfp片段成功的插入到psb1a2载体与merrop-ompa片段之间位，且构建过程未发生突变。

merrop-ompa-psb1a2与扩增后的rfp基因片段的单酶切反应体系如下表8所示。然后，通过连接反应将扩增后的rfp基因片段构建至merrop-ompa-psb1a2上，实现表达载体merrop-ompa-rfp-psb1a2的构建，具体反应体系如表9所示，再进行转化，挑取pcr鉴定和酶切鉴定正确的单克隆于lb培养基中过夜培养后送去上海生工生物公司进行测序，将测序结果正确的表达载体merrop-ompa-rfp-psb1a2划线及保种后用于后续的性能测试实验。

表8

表9

步骤四、通过化学转化法将表达载体merrop-ompa-rfp-psb1a2转化至感受态细胞内，获得所述生物工程菌。步骤四中的感受态细胞为e.colidh5α感受态细胞，作为宿主菌。具体转化过程为：(1)从氮气罐中取分装好的感受态细胞e.colidh5α于冰上解冻；(2)加入1ul表达载体merrop-ompa-rfp-psb1a2，可轻弹管壁以混合，于冰上放置30min；(3)42℃水浴热激90s，避免震荡；(4)迅速放回冰上5min；(5)加500ul灭菌lb(不含抗性)，于37℃250rpm恒温培养60min；(6)取50ul菌液于含抗性的lb固体培养基板上，铺展均匀；(7)板倒置于37℃烘箱过夜培养。

<生物工程菌性能测试>

一、工程菌识别hg²⁺灵敏度性能研究

(1)从划线培养的lb平板上挑取含merrop-ompa-rfp-psb1a2表达载体的单菌落，接种于3ml灭菌的液体lb培养基中(含150μg/ml羧苄青霉素)，于37℃250rpm恒温培养过液；

(2)将过夜培养的菌液按1:100比例扩大培养于250ml的液体lb培养基中(含150ug/ml羧苄青霉素)，于37℃250rpm恒温培养直至od600＝1；

(3)分装上述生长至od600＝1菌液(5ml/管)，分别向分装好的菌液中加入相应hg²⁺标准溶液至终浓度分别为0μm、0.001μm、0.01μm、0.025μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm，于37℃250rpm继续培养4h(设置5个重复实验)；

(4)6000rpm离心3min收集菌体，用500μl10mmpbs缓冲液洗涤；

(5)向洗涤后的菌体加1ml10mmpbs缓冲液重悬，使用岛津rf-6000荧光分光光度计测重悬菌液荧光强度并进行拍照。

实验中，分别给予工程菌一定浓度的hg²⁺(0μm、0.001μm、0.01μm、0.025μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm)，按照上述方法，最终测得不同浓度hg²⁺下工程菌显示荧光强度，由图6可以明显看出，随着hg²⁺浓度的增加，体系荧光强度先升高后下降，而且hg²⁺浓度达到0.5μm时显示荧光强度最强。当hg²⁺浓度在0.025μm～15μm范围时，工程菌显示明显荧光强度。不同浓度下在细胞膜表面展示红色荧光与测量荧光强度一致，红色强度梯度增高后又减弱。实验成果表明，生物工程菌可高效、可视化检测水环境中低浓度汞离子。

二、工程菌识别hg²⁺最优反应时间研究

(1)从划线培养的lb平板上挑取含merrop-ompa-rfp-psb1a2质粒的单菌落，接种于3ml灭菌的液体lb培养基中(含150μg/ml羧苄青霉素)，于37℃250rpm恒温培养过液；

(2)将过夜培养的菌液按1:100比例扩大培养于250ml的液体lb培养基中(含150ug/ml羧苄青霉素)，于37℃250rpm恒温培养直至od600＝1；

(3)向上述生长至od600＝1菌液中加200μl500μmhg²⁺标准溶液后分装(5ml/管)，于37℃250rpm继续培养(设置5个重复实验)；

(4)于0min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h分别取出菌液，6000rpm离心3min收集菌体，用500μl10mmpbs缓冲液洗涤；

(5)向洗涤后的菌体加1ml10mmpbs缓冲液重悬，使用岛津rf-6000荧光分光光度计测重悬菌液荧光强度并进行拍照。

在一定的hg²⁺浓度(1μm)下，汞离子进入细胞内部，与细胞内表达的merr蛋白结合后，激活下游ompa-rfp基因的表达，使红色荧光蛋白mrfp1在细菌表面表达，从而在细菌表面显示荧光强度，图7结果表示，随着加入汞离子时间变化，体系荧光强度有明显差别。在孵育15min后，工程菌已经显示微弱的荧光强度，并且肉眼可见；在孵育1h后，工程菌显示的荧光强度上升迅速；在1h～4h之间，工程菌的荧光强度上升趋势明显；在4h～8h之间，工程菌显示较强的荧光强度，肉眼观察十分明显。研究成果表明，此生物工程菌可在短时间内实现水环境中痕量hg²⁺的可视化检测。

三、工程菌识别hg²⁺特异性性能研究

(1)从划线培养的lb平板上挑取含merrop-ompa-rfp-psb1a2质粒的单菌落，接种于3ml灭菌的液体lb培养基中(含150μg/ml羧苄青霉素)，于37℃250rpm恒温培养过液；

(2)将过夜培养的菌液按1:100比例扩大培养于250ml的液体m9培养基中(含150ug/ml羧苄青霉素)，于37℃250rpm恒温培养直至od600＝1；

(3)将上述生长至od600＝1菌液分装(5ml/管)，分别向分装好的菌液加入终浓度分别为0.05μm和0.1μm的hg²⁺、ag⁺、au³⁺、cd²⁺、cr³⁺、cu²⁺、fe³⁺、ni²⁺、pb²⁺、zn²⁺，于37℃250rpm继续培养12h(设置5个重复实验)；

(4)6000rpm离心3min收集菌体，用500μl10mmpbs缓冲液洗涤；

(5)向洗涤后的菌体加1ml10mmpbs缓冲液重悬，使用岛津rf-6000荧光分光光度计测重悬菌液荧光强度并进行拍照。

在培养工程菌的液体lb培养基分别加入10种金属离子(hg²⁺、ag⁺、au³⁺、cd²⁺、cr³⁺、cu²⁺、fe³⁺、ni²⁺、pb²⁺、zn²⁺)，比较工程菌对不同金属离子响应的荧光强度以反映工程菌对hg²⁺的选择性。由图8可以看出，加入hg²⁺时，工程菌特异性显示荧光强度，对hg²⁺有较好选择性，从而有效检测水环境中hg²⁺浓度。而水环境中其它金属离子(ag⁺、au³⁺、cd²⁺、cr³⁺、cu²⁺、fe³⁺、ni²⁺、pb²⁺、zn²⁺)虽然也能使工程菌显示荧光强度，但相对很弱。相对研究结果表明工程菌对hg²⁺有较好的的选择性，可特异性检测水环境中汞离子含量。

本实验利用基因工程技术，通过pcr扩增、酶切、连接与转化等基因工程手段成功构建出merrop-ompa-rfp-psb1a2表达载体，含有表达载体的细菌可以通过金属调控蛋白merr的“转录激活”机制调控红色荧光蛋白mrfp1在微生物细胞表面的表达，从而实现痕量hg²⁺的可视化检测。研究结果表明，水环境中hg²⁺浓度不同，生物工程菌表面显示的红色蛋白mrfp1荧光强度不同，并且生物工程菌的荧光强度随时间呈增长的趋势。同时，上述生物工程菌只能特异性检测水环境中hg²⁺，而其它金属离子ag⁺、au³⁺、cd²⁺、cr³⁺、cu²⁺、fe³⁺、ni²⁺、pb²⁺、zn²⁺均没有响应。因此，本研究中生物检测工程菌的成功开发，为生态环保、选择性好、灵敏度高、成本低廉、可重复利用的汞污染检测奠定了重要基础。

此外，本发明中所用的试剂如下表10所示。

表10

本发明中所用的仪器设备如下表11所示。

表11

本发明中所用的培养基配方如下表12所示。

表12

本发明中所用的电泳液为50×tae电泳液(1l)，具体制备方法为：称量242gtris碱，用去离子水完全溶解后加入57.1ml冰醋酸和100ml0.5mnaoh(ph＝8.0)后定容至1000ml，工作溶液浓度为1×。

本发明中所用的琼脂糖制备方法为：称量2g琼脂粉(agaroseg-10)，加入4ml50×tae后定容至200ml，中火加热至固体完全溶解。

本发明中所用的m9培养基的配方如表13所示，其中1×m9盐溶液的配方和制备方法如表14，mgso4－葡萄糖－cacl2溶液的配方如表15所示，按表15的配方称取相应重量的mgso4、葡萄糖、cacl2后，再加纯净水定容到20ml，过0.22μm的无菌滤膜后分装，放置-20℃保存。

表13

表14

表15

本发明中所用的6×dna上样缓冲液(1ml)的配方如表16所示。

表16

本发明中所用的0.1m磷酸盐缓冲液(pbs)的制备方法为：称取80gnacl、2gkcl、36.3gna2hpo4·12h2o和2.4gkh2po4溶于800ml蒸馏水中，用4m稀盐酸调节溶液ph值至7.4，调节完ph值后加蒸馏水定容至1l，最后120℃高压灭菌30min，4℃冰箱中保存。

本发明中用到了琼脂糖凝胶电泳实验。琼脂糖凝胶电泳实验主要用来分离和鉴定dna分子。dna分子主要由核糖、磷酸和碱基组成，并且核糖-磷酸骨架的结构重复性，使相同数量的双链dna分子拥有相同的静电荷，并且作为两性分子的核酸在ph＝8.0左右时，整个电荷带负电，在电泳作用将以同样的速度向正极移动，因此在相同的电场强度下，dna分子的迁移速率取决于dna分子本身的分子量和结构。对于构型相同的dna分子，其迁移速度与相对分子量的大小成反比。而对于分子量相同构型不同的dna分子，琼脂糖凝胶电泳实验同样可以得到有效的分离，在一定电场中不同构型的dna分子的迁移速率为：共价闭环超螺旋dna>线性dna>开环的双链环状dna。一般琼脂糖凝胶电泳实验适用于分离大小在0.2kb～50kb范围内的dna片段。以1％琼脂糖凝胶电泳实验为例，主要操作过程为：称量2g琼脂糖，加入4ml50×tae电泳缓冲液混匀后用去离子水定容至200ml，在微波炉内加热至琼脂糖完全溶解后室温冷却，待温度降至60℃左右后迅速倒入模具并加入2-4ul溴化乙锭。混合均匀后继续冷却至胶体凝固后，将制备好的凝胶由模具转移至电泳系统中，加入1×tae电泳缓冲液至稍没过胶面。之后向琼脂糖凝胶的泳道中加入dna样品，加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压100v，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。当样品中溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1/3处时，停止电泳。小心取出凝胶，在紫外灯下观察，dna存在则显示出红色荧光条带，采用geldocxr凝胶成像系统拍照保存。

本发明中用到了切胶回收实验。使用omegabio-tek切胶回收试剂盒对琼脂糖凝胶电泳实验切取的dna片段进行回收，主要步骤如下：1)将置于干净灭菌的ep管中的凝胶称重，计算出凝胶的净重，并按照每100mg重量的凝胶加入100ulbindingbufferxp2的比例加入适宜体积的bindingbufferxp2于ep管中。2)将ep管放入55-60℃的水域中，直至至凝胶完全融化，期间可上下颠倒凝胶加速凝胶的融化。3)待凝胶完全融化后用移液枪将溶解液小心的转入安装有收集管的dnamini柱中，室温下10000xg离心1分钟，弃去离心液。4)再次向dnamini柱中加入300ulbindingbufferxp2，同样室温下10000xg离心1分钟后弃去离心液。5)向dnamini柱中加入700ulspwwashbuffer，室温高速离心1min后弃去滤液。6)重复步骤5)后，再次室温高速离心3min干燥dnamini柱。7)将样品收集管置换为无菌的ep管，加入20-30ul灭菌的milliqh2o浸润dnamini柱，室温静置2min后高速离心洗脱dna样品，使用nanodrop1000微量蛋白核酸测定仪测定浓度后保存至-4℃。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

本发明中merr的序列如下：

ttacggcatagcagaaccagccagtgaagcaccaccttgcagcgaagcgatcagcggacacgacacgttaccgcgacgagcatgacatgcgcaaaccagttctgacagcactgcttccatacgtgccaggtctgccatcttttcacggacatccttcagtttgtgttcggccagagagctcgcttcttcgcaatgcgtaccgtcttccaggcgcagcagttctgcgatttcatccagggagaagcccagacgctgagcacttttgacaaagcgaacacgggtcacgtctgcttcaccgtagcgacgaatagagccatacggcttatccggttccagcagcaggcctttgcgttgatagaagcggatcgtttccacattcacaccggcagccttagcgaagacaccaatcgtcaggttttccaggttattttccat

本发明中op(operator)的序列如下：

atcgcttgactccgtacatgagtacggaagtaaggttacgctatccaatttcaattcgaaaggacaagcgc

本发明中ompa的序列如下：

atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggccgctccgaaagataacacctggtacactggtgctaaactgggctggtcccagtaccatgacactggtttcatcaacaacaatggcccgacccatgaaaaccaactgggcgctggtgcttttggtggttaccaggttaacccgtatgttggctttgaaatgggttacgactggttaggtcgtatgccgtacaaaggcagcgttgaaaacggtgcatacaaagctcagggcgttcaactgaccgctaagctgggttacccaatcactgacgacctggacatctacactcgtctgggtggcatggtatggcgtgcagacactaaatccaacgtttatggtaaaaaccacgacaccggcgtttctccggtcttcgctggcggtgttgagtacgcgatcactcctgaaatcgctacccgtctggaataccagtggaccaacaacatcggtgacgcacacaccatcggcactcgtccggacaacggaggatcc

本发明中rfp的序列如下：

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本发明中重组基因merrop-ompa-rfp的序列如下：

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sequencelisting

<110>广西师范学院

<120>用于检测二价汞离子的生物工程菌及其制备方法和用途

<130>cn18nn9855i

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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cctaaactagt1751